NADP+/NADPH

NADkinase (NADK)는 NAD+의 인산화를 통해 NADP+를 만들어내는 반응을 촉매함으로 세포의 NADP+/NADPH의 수준을 조절하는 역할을 한다. NADK는 베 타세포에서 세포내의 산화/환원반응을 조절함으로써 인슐린 분비와 항산화 작용에 영향을 준다고 보고되었다 (Gray 등, 2012). NADK에 대한 siRNA와 plasmid vector를 INS-1 세포에 형질주입한 후 고농도 포도당/지방산을 처리하여 NADK가 고농도 포도당/지방산 독성에 의한 세포사멸에 미치는 영향을 조사하였다. siNADK 가 형질주입된 INS-1 세포는 대조군과 비교하여 고농도 포도당/지방산에 의해 감 소된 viability (Fig. 24A)와 cleaved caspase 3의 발현에는 큰 영향을 미치지 않았 다 (Fig. 24C). NADK가 과발현된 INS-1 세포에 고농도 포도당/지방산을 처리하 였을 때도 마찬가지로 고농도 포도당/지방산에 의한 INS-1 세포 viability 감소와 cleaved caspase3의 발현에 영향을 미치지 않았다 (Fig. 24B와 24D). NADK의 발 현이 저해된 세포 및 과발현된 세포 모두 고농도 포도당/지방산 독성에 큰 영향을 미치지 않으며 고농도 포도당/지방산에 의한 세포사멸에서 NAM이 세포사멸을 억 제하는 효과에도 영향을 미치지 않았다 (Fig. 23A와 23C). 따라서 NADK 발현 조 절을 통한 간접적인 NADP+/NADPH 조절은 고농도 포도당/지방산 독성에 의한 세 포사멸에 중요한 역할을 하지 않을 것이라 추측된다.

Fig. 24. Knockdown or overexpression of NADkinase (NADK) does not protects HG/PA-induced INS-1 cell death. INS-1 cells were transfected with siRNA of NADkinase (A, C)or NADkianse (B, D) expressing plasmid vector using a electroporation method. After 48h incubation, transfected INS-1cells were treated with HG/PA or 20 mM NAM and HG/PA for 15 h. Cell viability was measured by MTT assay (A, B) and Cell death was measured by Western blot analysis of processed caspase 3 clevages. (C, D). Data represent mean

±SE from three independent experiments. ^**P<0.01, vs. Viability of siGFP- or pcDNA-transfected cells in the presence of HG/PA.

7 . NAD+ 소비 효소

: Nicotinamide를 통한 NAD+ 소비 효소 저해제로서의 역할

NAD+는 ADP-ribose의 공여체로 사용되어 NAD+가 소모되는 반응에서도 중 요한 역할을 한다. NAD+를 기질로 사용하여 NAD+를 소모하는 대표적인 효소로 Poly(ADP-ribose) Polymerase (PARPs), SIRT (SIRT1-7), cADP-ribose synthases (CD38) 등이 알려져 있다. 이 효소들의 활성에 따라 NAD+ 양이 조절

농도별로 처리했을 때 고농도 포도당/지방산에 의한 INS-1 세포 viability 감소 및

Fig. 25. Inhibition of PARP does not protect HG/PA-induced INS-1 cell death.

INS-1 cells were treated with different concentrations of PARP inhibitor, 3-AB (A) or INH2BP (B) in the presence or absence of HG/PA for 15 h. Cell viability was measured by MTT assay and DNA fragmentation was measured by the cell death detection ELISA kit. Data represent mean ±SE from three independent experiments. ^*P<0.05; ^**P<0.01, vs. Viability or DNA fragmentation of HG/PA-treated control cells.

Fig. 26. PARP inhibitor 3-AB but not INH2BP increase intracellular tNAD level. INS-1 cells were treated with different concentrations of PARP inhibitor 3-AB (A) or INH2BP (B) in the absence or presence of HG/PA for 12 h.

Total NAD in cellular extract was determined using a NAD+/NADH Quantification kit. Data represent mean ±SE from three independent experiments. ^#P<0.05, vs. tNAD of BSA-treated control cells. ^*P<0.05, vs.

tNAD of HG/PA-treated control cells.

Fig. 27. Inhibition of PARP does not protect HG/PA-induced INS-1 cell death.

- siRNA : siNampt, siNmnat. INS-1 cells were transfected with siRNA of green fluorescent protein (GFP) or PARP using a electroporation method. After 36h incubation, siRNA-transfected INS-1cells were treated with HG/PA or 20 mM NAM and HG/PA for 15 h. Knock down of PARP was determined by semi-quntitative RT-PCR. Cell viability was measured by MTT assay (A) and DNA fragmentation was measured by the cell death detection ELISA kit (B).

Data represent mean ±SE from three independent experiments. ^**P<0.01, vs.

Viability or DNA fragmentation of siGFP-transfected cells in the presence of HG/PA.

Fig. 28. Pharmacological inhibitor of PARP but not knock down of PARP protects STZ-induced INS-1 cell death. (A) INS-1 cells were treated with PARP inhibitor such as 10 mM 3-AB, 100 μM INH2BP in the presence of 20 mM STZ for 15 h. DNA fragmentation was measured by the cell death detection ELISA kit. ^*P<0.05; ^**P<0.01, vs. DNA fragmentation of STZ-treated control cells (B) siGFP or siPARP transfected INS-1 cells were treated with 20 mM STZ or 20 mM NAM and 20 mM STZ for 15 h. DNA fragmentation was measured by the cell death detection ELISA kit. Data represent mean ±SE from three independent experiments. ^*P<0.05; ^**P<0.01, vs. DNA fragmentation of siGFP transfected cells in the presence of STZ.

나. CD38

CD38은 NAD+ glycohydolase 활성을 가진 효소로 NAD+를 기질로 사용하여 cADP-ribose와 같은 이차전령을 만들어 칼슘의 이동을 조절한다. CD38의 활성이 증가된 대부분의 조직에서는 NAD+ 부족이 나타난다 (Balan 등, 2010). CD38의 발현 조절이 고농도 포도당/지방산 독성에 의한 세포사멸에 영향을 주는지 알기위 해 CD38에 대한 siRNA와 plasmid vector를 INS-1 세포에 형질주입한 후 고농도 포도당/지방산을 처리하여 INS-1 세포 viability와 cleaved caspase3 발현 양을 조사하였다. INS-1 세포는 쥐 소도세포와 대조적으로 CD38의 발현이 너무 미미하 여 유전자 수준에서 발현 양을 측정할 수 없었다 (그림으로 보여주지 않음). CD38 에 대한 siRNA가 형질주입된 INS-1 세포에 고농도 포도당/지방산을 처리하였을 때 GFP siRNA가 형질주입된 대조군과 비교하여 INS-1 세포 viability (Fig. 29A) 와 cleaved caspase 3의 발현에 차이를 보이지 않았다 (Fig. 29C). CD38 palsmid vector를 형질주입해서 과발현시킨 세포 또한 고농도 포도당/지방산에 의한 INS-1 세포 viability 감소와 cleaved caspase3의 발현에 영향을 미치지 않았다 (Fig. 29B 와 29D). CD38의 발현이 저해된 세포 및 과발현된 세포 모두 고농도 포도당/지방 산 독성에 의한 세포사멸에서 NAM에 의한 세포사멸을 억제 효과에도 영향을 미치 지 않았다 (Fig. 28A와 28B).

Fig. 29. Knockdown or overexpression of CD38 does not protect HG/PA- induced INS-1 cell death. INS-1 cells were transfected with siRNA of CD38 (A, C)or CD38 (B, D) expressing plasmid vector using a electroporation method. After 48h incubation, transfected INS-1cells were treated with HG/PA or 20 mM NAM and HG/PA for 15 h. Cell viability was measured by MTT assay (A, B) and Cell death was measured by Western blot analysis of processed caspase 3 clevages (C, D). Data represent mean ±SE from three independent experiments. ^**P<0.01, vs. Viability of siGFP or pcDNA transfected cells in the presence of HG/PA.

다. Situin

다 (Fig. 32B). 또한 고농도 포도당/지방산에 의해 2.1로 증가된 DNA fragmentation을 siSirt3에서는 1.32로, siSirt4에서는 1.39로 감소시켰으며 siSirt3 에서는 NAM에 의한 세포사멸 억제 효과를 증가시키는 경향을 보였다 (Fig. 32C).

Fig. 30. Inhibition of SIRT protects against HG/PA-induced INS-1 cell death.

INS-1 cells were treated with different concentrations of Sirt activator resveratrol (RES) (A) or SIRT inhibitor sirtinol (SIR) (B) in the presence or absence of HG/PA for 15 h. Cell viability was measured by MTT assay and DNA fragmentation was measured by the cell death detection ELISA kit. Data represent mean ±SE from three independent experiments. ^#P<0.05, vs.

BSA-treated control cells. ^*P<0.05; ^**P<0.01, vs. HG/PA-treated control cells.

Fig. 31. SIRT activator decrease intracellular tNAD level but SIRT inhibitor does not increase intracellular tNAD level. INS-1 cells were treated with different concentrations of Sirt activator resveratrol (RES) (A) or panSirt inhibitor sirtinol (SIR) (B) in the absence or presence of HG/PA for 12 h.

Total NAD in cellular extract was determined using a NAD+/NADH Quantification kit. Data represent mean ±SE from three independent experiments. ^#P<0.05; ^##P<0.01, vs. tNAD of BSA-treated control cells.

*P<0.05; ^**P<0.01, vs. tNAD of HG/PA-treated control cells.

Fig. 32. Knockdown of Sirt3 or Sirt4 protects against HG/PA-induced INS-1 cell death. (A) Knock down of Sirtuins was determined by semi-quntitative RT-PCR. INS-1 cells were transfected with siRNA of green fluorescent protein (GFP), Sirt1, Sirt2, Sirt3, Sirt4, Sirt5, Sirt6 or Sirt7 using a electroporation method. After 36h incubation, siRNA-transfected INS-1cells were treated with HG/PA or 20 mM NAM and HG/PA for 15 h. Cell viability was measured by MTT assay (B) and DNA fragmentation was measured by the cell death detection ELISA kit (C). Data represent mean ±SE from three independent experiments. ^#P<0.05; ^##P<0.01, vs. Viability of siGFP- transfected cells in the presence of BSA. ^*P<0.05; ^**P<0.01, vs. Viability or DAN fragmentation of siGFP-transfected cells in the presence of HG/PA.

$P<0.05, DAN fragmentation of siGFP-transfected cells in the presence of NAM and HG/PA

Fig. 33. Overexpression of Sirt3 or Sirt4 augment HG/PA-induced INS-1 cell death. (A) Overexpression of Sirt3 and Sirt4 were determined by semi-quntitative RT-PCR. INS-1 cells were transfected with Sirt3 or Sirt4 expressing plasmid vector using a electroporation method. After 48h incubation, vector-transfected INS-1cells were treated with HG/PA or 20 mM NAM and HG/PA for 15 h. Cell viability was measured by MTT assay (B) and DNA fragmentation was measured by the cell death detection ELISA kit (C). Data represent mean ±SE from three independent experiments. ^#P<0.05; ^##P<0.01, vs. Viability or DAN fragmentation of CMV-transfected cells in the presence of

BSA. ^*P<0.05; ^**P<0.01, vs. Viability or DAN fragmentation of CMV- transfected cells in the presence of HG/PA. ^$$P<0.01, vs. Viability or DAN fragmentation of CMV-transfected cells in the presence of HG/PA and NAM.

Fig. 34. Activation of SIRT protect STZ-induced INS-1 cell death. INS-1 cells were treated with SIRT activator resveratol (50 μM) or SIRT inhibitor sirtinol (12 μM) in the presence of 20 mM STZ for 15 h. DNA fragmentation was measured by the cell death detection ELISA kit. ^*P<0.05; ^**P<0.01, vs.

STZ-treated control cells.

D. Nicotinamide가 Mitochondiral Sirtuin의 저해제로서 고농도 포도당/지방산 독성 에 의한 세포사멸에서 역할.

1. 고농도 포도당/지방산에 의한 SIRT 발현 및 활성

고농도 포도당/지방산을 처리한 INS-1 세포에서 각 SIRT의 발현조절이 어떻게 되는지 알기위해 각 SIRT의 발현을 RT-PCR로 확인하였다. 고농도 포도당/지방산 에 의해 Sirt1, Sirt3, Sirt4, Sirt6의 발현양이 증가함을 확인하였고 고농도 포도당/

지방산과 함께 NAM을 처리하면 Sirt1의 발현은 줄어들지 않은 반면 Sirt3, Sirt4의 발현이 줄어드는 것을 확인하였다 (Fig. 35A와 Fig. 35B). 실제로 SIRT의 활성이 고농도 포도당/지방산에서 어떻게 조절되는지 알기위해 세포내 전체 단백질의 acetyl-lysine을 Western blotting으로 조사하였다. 고농도 포도당/지방산 처리 후 시간별로 전체 단백질의 acetyl-lysine을 보면 6시간과 9시간 째 증가하였다가 12 시간과 15시간에는 감소함을 확인하였다. 고농도 포도당/지방산과 NAM을 함께 처 리하면 3시간부터 15시간 까지 acetyl-lysine이 계속 증가되어 있음을 확인하였다 (Fig. 36). 위 결과를 종합해보면 고농도 포도당/지방산을 처리했을 때, 12시간과 15시간에서 SIRT의 활성이 증가하며 이러한 상황에 NAM을 처리하면 SIRT 활성 이 저해될 것이라 간접적으로 설명할 수 있다. 고농도 포도당/지방산을 처리하여 독 성이 나타나는 시간에 오히려 과도한 SIRT을 활성을 나타내며 이 상황에서 과도한 SIRT의 활성이 고농도 포도당/지방산 독성을 유도하는데 영향을 줄 수 있다고 추 측할 수 있으며, 고농도 포도당/지방산에 의해 증가된 Sirt3, Sirt4의 발현을 NAM 이 줄이는 효과를 통해 포도당/지방산 독성을 억제하는 것이라 제안할 수 있다.

Fig. 35. Expressioin of Sirtuins in the presence of HG/PA or in the presence of HG/PA and NAM. (A) INS-1 cell were treated with HG/PA or HG/PA and 20 mM NAM for the indicated times. Sirtuin expression was determined by semi-quntitative RT-PCR. (B) The band intensity was determined by densitometric analysis using a one-dimensional Quantity OneÒ 1D image analysis system. Control (0 h) intensity was converted to 1 and the relative intensity on the basis of maximum was then calculated.

Fig. 36. Pattern of Acetyl-lysine in HG/PA-treated INS-1 cell. INS-1 cells were treated with HG/PA or HG/PA and 20 mM NAM for the indicated times.

The acetylated proteins were dected by western blot with anti-acetyl lysine antibody.

2. 고농도 포도당/지방산에 의한 미토콘드리아 SIRT의 활성

Sirt3, Sirt4 및 Sirt5와 같이 미토콘드리아에 존재한다고 알려진 SIRT들은 산화 적 대사, 세포사멸, 세포내 신호전달에 관련된 효소들의 기능에 관여함으로 미토콘 드리아 기능을 조절한다고 알려져 있다. 이전 실험결과에서 세포내 전체 단백질의 acetyl-lysin의 양상을 보았을 때, 고농도 포도당/지방산을 처리하면 6시간과 9시간 에는 증가하였다가 12시간 이후에서는 감소하는 양상을 보였다 (Fig. 36). 따라서 고농도 포도당/지방산을 처리했을 때, 미토콘드리아에 존재한다고 알려진 Sirt3나 Sirt4에 의해 미토콘드리아내 단백질의 acetyl-lysine 양상이 변하는지 알기위해 미 토콘드리아를 분리하여 미토콘드리아의 단백질로 Western blotting 하였다. 그 결과 고농도 포도당/지방산을 처리한 미토콘드리아 단백질에서 3시간과 6시간 째 acetyl-lysine이 증가하였으며 9시간 이후로 감소하는 양상을 나타내었다. 반면 고

농도 포도당/지방산과 NAM을 함께 처리한 미토콘드리아 단백질에서는

농도 포도당/지방산과 NAM을 함께 처리한 미토콘드리아 단백질에서는