약 어
Ⅰ. 서 론
Impair Glucose Tolerance). 이 단계는 당뇨병으로 진단되지 않지만 당뇨병으로 발 병하기 쉬운 위험요소를 가지고 있다. (Fig. 1) (Prentki 와 Nolan, 2006). 증가된 혈중 포도당은 지방세포로부터 유리된 지방산과 함께 베타세포의 양적 감소를 초래 하는데 기여하며 포화지방산, restin, TNF-α등과 같은 물질은 인슐린 저항성을 악 화시켜 혈중 포도당 농도가 더욱 높아진다 (LeRoith등, 2002). 이 단계가 되면 명 백한 당뇨병으로 진단되며 적절한 치료가 요구된다. 인슐린 저항성 단계에서 제2형 당뇨병으로 진행되는데 있어 베타세포의 기능 이상과 베타세포의 양적 감소는 중요 한 병인으로 작용하며 실제 비만과 인슐린 저항성을 가진 환자에서 베타세포의 보 상 작용이 적절하게 유지되면 당뇨병으로 발병하는데 오랜 기간이 소요될 것으로 생각하고 있다 (Debotah와 Christopher, 2008).
Fig. 1. Islet β-cell failure and the natural history of T2D.
(Prentki 와 Nolan, 2006)
영양분이 과도한 상황 즉, 높은 농도의 포도당과 유리지방산의 증가는 활성산소
(DG), phosphatidic acid (PA), phospholipids (PL), triglycerides (TG)와 같은 독 성매개 산물이 축적된다. 독성매개 산물이 증가된 상황은 베타세포 기능 이상 및 베타세포사멸에 기여한다 (Fig. 2) (Prentki 등, 2002; Poitout 등, 2010). 최근 Choi 등이 보고한 결과에서 베타세포가 고농도 포도당과 지방산에 노출되면 TCA 회로 (tricarboxiylic acid (TCA) cycle; TCA cycle) 중간물질의 부족과 에너지 생 성대사 이상이 초래되며, 지방산 산화 촉진이나 TCA 회로 중산물질의 보충을 통해 이런 상황을 극복하면 고농도 포도당/지방산 독성이 완화되는 것이 보고되었다. 따 라서 미토콘드리아내 에너지 대사 이상이 베타세포 기능 이상 및 세포사멸 유도에 기여할 것이라고 제안하였다 (Fig. 3) (Choi 등, 2011).
Fig. 2. Effect of glucose on lipid partitioning in the beta cell. (Poitout 등, 2010) fatty acid (FA), carnitine-palmitoyl transferase-1 (CPT-1). long-chain acyl-CoA (LC-CoA), diglycerides (DG), phosphatidic acid (PA), phospholipids (PL), triglycerides (TG).
Fig. 3. Supplement of TCA cycle intermediates protects against high glucose/palmitate-induced INS-1 beta cell death. (Choi 등, 2011) Since TCA
cycle intermediates are replenished through treatment with various metabolic fuels. phenylacetic acid (PAA), monomethyl succinate (MMS), α -ketoisocaproate (KIC), dimethyl malate (DMM), aminobicyclo-heptane -2-carboxylic acid (BCH; activator of glutamate dehydrogenase), benzene tricarboxylate (BTA; inhibitor of the mitochondrial tricarboxylate carrier)
B. 베타세포사멸
Reticulum; ER)에 존재하는 칼슘 펌프로 알려진 Sarcoendoplasmic Reticulum Ca2+
의해 손상된 DNA를 수리하기위해 poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)라는 효
전달계의 이상으로 미토콘드리아 내에 자유라디칼 (free-radical)이 과도하게 증가
다 (Houtkooper 등, 2010).
NAD+는 NAD+
de novo
경로와 NAD+ salvage 경로를 통해 생성된다고 알려 져 있다 (Fig. 4) (Denu, 2007). 포유류세포에서 세포내 NAD+의 공급은 필수아미 노산인 트립토판 (L-tryptophan)에서 시작되는 NAD+de novo
경로의 경우보다 NAD+ salvage 경로를 통해 주로 이루어진다. Nicotinic acid (NA), nicotinamide (NAM), nicotinamide ribose (NR)는 NAD+ salvage 경로에서 NAD+를 공급할 수 있는 전구물질이며 포유류에서는 NAM이 중요한 niacin 유래 NAD+ 전구물질로 생각되고 있다 (Bogan 와 Brenner, 2008). NAM을 통한 NAD+로의 전환은 NAD+ salvage 경로를 통해 이루어지는데 즉, NAD+ salvage 경로의 속도 조절 효소인 nicotinamide phosphoryltransferase (Nampt)를 통해 NAM이 nicotinamide mononucleotide (NMN)로 바뀌고 바뀐 NMN은 NMN adenylyltransferase (Nmnat)에 의해 NAD+로 전환된다.Fig. 4. NAD+ synthesis Pathway. (Yamamoto 등, 2007) nicotinamide (NAM), nicotinamide ribose (NR), nicotinamide mononucleotide (NMN), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+), nicotinic aicd mononucleotide (NaMN), nicotinamide phosphoryltransferase (Nampt), nicotinamide phosphoryltransferase (Nampt), ADP-ribose transferase (PARP), cADP-ribose synthase (CD38), sirtuin (SIRT)
2. NAD+ 소비 효소
NAD+는 앞에서 언급한 바와 같이 수소전달반응에서 조효소로의 역할 뿐만 아 니라 ADP-ribose의 공여체로 사용되어 NAD+가 소비되는 반응에도 중요한 역할 을 한다. NAD+를 기질로 사용하여 NAD+ 소비에 관여하는 효소로는 ADP-ribose transferase (PARP), cADP-ribose synthase (CD38, CD157), sirtuin (SIRT) 등 이 대표적으로 알려져 있다 (Fig. 4). 이 효소들의 경우 간접적으로 NAD+의 생리
를 제거하는 활성을 가진다. 일반적으로 히스톤 (Histone) 단백질이나 다른 단백질 며 활성화된 Sirt1은 peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), PPAR γ coactivator-1α (PGC-1α)과 같은 대사 조절에 관련된 전사인자들의 유
의 감소와 함께 Sirt1의 활성이 감소하는데, 이 조건에 세포배양 배지에 직접적으로
대사질환의 치료와 예방을 위한 대안이 될 수 있다.
Sirtuin Class Localization Activity Target
SIRT3 Ⅰ Mitochondria deacetylation LCAD, HMGCS2, GDH, SOD2, IDH2, OXPHOS complex
Sirt3, Sirt4, Sirt5와 같이 미토콘드리아에 존재하는 SIRT는 ATP 생산, 에너지
또한 Sirt3은 succinate dehydrogenase (SDH)와 isocitrate dehydrogenase 2 (ICDH2) 그리고 glutamate dehydrogenase (GDH)와 같은 TCA 회로에 관련된 효
함으로 간이나 지방세포에서 지방산 산화의 증가가 보고되었다 (Nasrin등, 2010).
Sirt5는 urea cycle의 첫 번째 속도 조절 효소 (Rate-limiting enzyme)인 carbamoyl phosphate synthetase (CPS1)를 조절한다고 보고되었다 (Nakagawa 등, 2009). 미토콘드리아내 에너지 생산에 관련된 효소와 미토콘드리아 SIRT의 관 계를 그림으로 나타내었다 (Fig. 5).
Fig. 5. Network of mitochondrial sirtuins. (Verdin등,2010)
Acetyl-CoA synthetase 2 (AceCS2), Long-chain acyl-CoA dehydrogenase (LCAD), Carbamoyl phosphate synthetase (CPS1), Glutamate dehydrogenase (GDH)
H. Glutamate dehydrogenase
Glutamate dehydrogenase (GDH)는 NAD(P) + Glutamate ⇆. NAD(P)H + a-ketoglutarate + NH4+
반응을 촉매하는 효소이다 (Fahien과 Macdonald, 2011).
GDH를 통해 glutamate에서 α-ketoglutarate로 전환되는 경로는 아미노산 대사의 중간산물, 탄소원으로 제공되어 TCA 경로를 채워주거나 보충경로 (Anaplerotic pathway)에 중요한 역할을 한다 (Göhring과 Mulder, 2012). GDH는 세포내 에너 지 상태 변화에 따라 조절되는데, ATP와 GTP는 glutamate 형성 반응을 유도하는 다른 자리 입체성 작동체 (allosteric effector)이지만 ADP와 GDP는 α -ketoglutarate 형성 반응을 유도하는 다른 자리 입체성 작동체이다. GDH가 활성 화되면 glutamate가 α-ketoglutarate로 전환이 촉진되며, 그 결과 TCA 회로의 산 화 능력을 활성화시켜 ATP 생산을 촉진한다 (Fig. 6).
Fig. 6. GDH activation stimulates the conversion of glutamate to α- ketoglutarate (Göhring과 Mulder, 2012) GDH activation stimulates the
conversion of glutamate to α-ketoglutarate, resulting in enhanced substrate oxidation in the citric acid cycle. Adenine nucleotide translocator (ANT), mitochondrial intermembrane space (MIS), membrane potential (ΔΨm)
베타세포에서 GDH의 활성화제인 루신 (leucin)과 2-Aminobicyclo-(2,2,1)- heptane-2-carboxylic acid (BCH)를 처리하였을 때 GDH의 활성이 증가하며 인슐 린 분비가 촉진되었다 (Panten 등, 1984; Sener 등, 1981). 그러므로 BCH는 베타 세포에서 GDH의 활성을 증가시키는 약제로 생각된다.
INS-1 베타세포에 고농도 포도당/지방산을 처리하면 TCA 회로의 중간산물의 부족으로 인해 에너지 생산에 문제가 야기되고 결국 베타세포사멸로 이어지며 이 상황에 BCH를 처리하면 고농도 포도당/지방산 독성에 의한 세포사멸을 억제한다고 보고되었다 (Choi 등, 2011). 이는 BCH 처리를 통한 GDH 활성이 TCA 회로 중간 산물을 증가시킴으로 에너지 생산이 증가되어 고농도 포도당/지방산 독성에 의한 세포사멸을 억제했을 것으로 추측할 수 있다. 또한
db/db
동물 모델에 BCH를 주사 하면 베타세포의 양과 기능을 유지함으로 인슐린 분비를 증가시켜 내당능장애를 개 선하며 항당뇨 효과를 나타내었다 (Han 등, 2012).I. 연구 목적
Ⅱ. 재료 및 방법
A. 재 료
세포 배양에 사용하는 Fetal bovine serum은 Sigma (Sigma-Aldrich., St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고 RPMI 1640은 Cellgro (Mediatech Inc., Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. Penicillin과 streptomycin은 Duchefa (Duchefa Biochemie B.V., RV Haarlem, Netherland)에서 구입하였다. 실험에 사용된 약제 glucose, palmitate, streptozotocin (STZ), N-acetylcysteine (NAC), reduced glutathione (GSH), nicotinamide (NAM) β-nicotinamide mononucleotide (NMN), β -nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+), L-kynurenine, L-lactate, L-Asparagine, 3-aminobenzamide (3-AB), 5-iodo-6-amino-1,2- Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다. Anti-acetyl-lysine, anti-caspase 3, anti-phospho-Akt, anti-Akt, anti-phospho-eIF2α, anti-eIF2α, anti-CHOP 대 부분의 항체들은 Cell Signaling Technology (Cell Signaling Technology Inc., Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Anti-calnexin 항체는 Stressgen (Enzo Life Sciences Inc., Victoria, BC, Canada)에서 구입하였고 anti-actin과 anti-JNK 항체 는 Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA)에서 구입하였고 anti-phospho-JNK 항체는 Invitrogen (Life Technologies Corporation., Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였으며 anti-NDUFA9는 Abcam (Abcam plc., Cambridge,