Reticulum; ER)에 존재하는 칼슘 펌프로 알려진 Sarcoendoplasmic Reticulum Ca2+
의해 손상된 DNA를 수리하기위해 poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)라는 효
전달계의 이상으로 미토콘드리아 내에 자유라디칼 (free-radical)이 과도하게 증가
다 (Houtkooper 등, 2010).
NAD+는 NAD+
de novo
경로와 NAD+ salvage 경로를 통해 생성된다고 알려 져 있다 (Fig. 4) (Denu, 2007). 포유류세포에서 세포내 NAD+의 공급은 필수아미 노산인 트립토판 (L-tryptophan)에서 시작되는 NAD+de novo
경로의 경우보다 NAD+ salvage 경로를 통해 주로 이루어진다. Nicotinic acid (NA), nicotinamide (NAM), nicotinamide ribose (NR)는 NAD+ salvage 경로에서 NAD+를 공급할 수 있는 전구물질이며 포유류에서는 NAM이 중요한 niacin 유래 NAD+ 전구물질로 생각되고 있다 (Bogan 와 Brenner, 2008). NAM을 통한 NAD+로의 전환은 NAD+ salvage 경로를 통해 이루어지는데 즉, NAD+ salvage 경로의 속도 조절 효소인 nicotinamide phosphoryltransferase (Nampt)를 통해 NAM이 nicotinamide mononucleotide (NMN)로 바뀌고 바뀐 NMN은 NMN adenylyltransferase (Nmnat)에 의해 NAD+로 전환된다.Fig. 4. NAD+ synthesis Pathway. (Yamamoto 등, 2007) nicotinamide (NAM), nicotinamide ribose (NR), nicotinamide mononucleotide (NMN), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+), nicotinic aicd mononucleotide (NaMN), nicotinamide phosphoryltransferase (Nampt), nicotinamide phosphoryltransferase (Nampt), ADP-ribose transferase (PARP), cADP-ribose synthase (CD38), sirtuin (SIRT)
2. NAD+ 소비 효소
NAD+는 앞에서 언급한 바와 같이 수소전달반응에서 조효소로의 역할 뿐만 아 니라 ADP-ribose의 공여체로 사용되어 NAD+가 소비되는 반응에도 중요한 역할 을 한다. NAD+를 기질로 사용하여 NAD+ 소비에 관여하는 효소로는 ADP-ribose transferase (PARP), cADP-ribose synthase (CD38, CD157), sirtuin (SIRT) 등 이 대표적으로 알려져 있다 (Fig. 4). 이 효소들의 경우 간접적으로 NAD+의 생리
를 제거하는 활성을 가진다. 일반적으로 히스톤 (Histone) 단백질이나 다른 단백질 며 활성화된 Sirt1은 peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), PPAR γ coactivator-1α (PGC-1α)과 같은 대사 조절에 관련된 전사인자들의 유
의 감소와 함께 Sirt1의 활성이 감소하는데, 이 조건에 세포배양 배지에 직접적으로
대사질환의 치료와 예방을 위한 대안이 될 수 있다.
Sirtuin Class Localization Activity Target
SIRT3 Ⅰ Mitochondria deacetylation LCAD, HMGCS2, GDH, SOD2, IDH2, OXPHOS complex
Sirt3, Sirt4, Sirt5와 같이 미토콘드리아에 존재하는 SIRT는 ATP 생산, 에너지
또한 Sirt3은 succinate dehydrogenase (SDH)와 isocitrate dehydrogenase 2 (ICDH2) 그리고 glutamate dehydrogenase (GDH)와 같은 TCA 회로에 관련된 효
함으로 간이나 지방세포에서 지방산 산화의 증가가 보고되었다 (Nasrin등, 2010).
Sirt5는 urea cycle의 첫 번째 속도 조절 효소 (Rate-limiting enzyme)인 carbamoyl phosphate synthetase (CPS1)를 조절한다고 보고되었다 (Nakagawa 등, 2009). 미토콘드리아내 에너지 생산에 관련된 효소와 미토콘드리아 SIRT의 관 계를 그림으로 나타내었다 (Fig. 5).
Fig. 5. Network of mitochondrial sirtuins. (Verdin등,2010)
Acetyl-CoA synthetase 2 (AceCS2), Long-chain acyl-CoA dehydrogenase (LCAD), Carbamoyl phosphate synthetase (CPS1), Glutamate dehydrogenase (GDH)
H. Glutamate dehydrogenase
Glutamate dehydrogenase (GDH)는 NAD(P) + Glutamate ⇆. NAD(P)H + a-ketoglutarate + NH4+
반응을 촉매하는 효소이다 (Fahien과 Macdonald, 2011).
GDH를 통해 glutamate에서 α-ketoglutarate로 전환되는 경로는 아미노산 대사의 중간산물, 탄소원으로 제공되어 TCA 경로를 채워주거나 보충경로 (Anaplerotic pathway)에 중요한 역할을 한다 (Göhring과 Mulder, 2012). GDH는 세포내 에너 지 상태 변화에 따라 조절되는데, ATP와 GTP는 glutamate 형성 반응을 유도하는 다른 자리 입체성 작동체 (allosteric effector)이지만 ADP와 GDP는 α -ketoglutarate 형성 반응을 유도하는 다른 자리 입체성 작동체이다. GDH가 활성 화되면 glutamate가 α-ketoglutarate로 전환이 촉진되며, 그 결과 TCA 회로의 산 화 능력을 활성화시켜 ATP 생산을 촉진한다 (Fig. 6).
Fig. 6. GDH activation stimulates the conversion of glutamate to α- ketoglutarate (Göhring과 Mulder, 2012) GDH activation stimulates the
conversion of glutamate to α-ketoglutarate, resulting in enhanced substrate oxidation in the citric acid cycle. Adenine nucleotide translocator (ANT), mitochondrial intermembrane space (MIS), membrane potential (ΔΨm)
베타세포에서 GDH의 활성화제인 루신 (leucin)과 2-Aminobicyclo-(2,2,1)- heptane-2-carboxylic acid (BCH)를 처리하였을 때 GDH의 활성이 증가하며 인슐 린 분비가 촉진되었다 (Panten 등, 1984; Sener 등, 1981). 그러므로 BCH는 베타 세포에서 GDH의 활성을 증가시키는 약제로 생각된다.
INS-1 베타세포에 고농도 포도당/지방산을 처리하면 TCA 회로의 중간산물의 부족으로 인해 에너지 생산에 문제가 야기되고 결국 베타세포사멸로 이어지며 이 상황에 BCH를 처리하면 고농도 포도당/지방산 독성에 의한 세포사멸을 억제한다고 보고되었다 (Choi 등, 2011). 이는 BCH 처리를 통한 GDH 활성이 TCA 회로 중간 산물을 증가시킴으로 에너지 생산이 증가되어 고농도 포도당/지방산 독성에 의한 세포사멸을 억제했을 것으로 추측할 수 있다. 또한
db/db
동물 모델에 BCH를 주사 하면 베타세포의 양과 기능을 유지함으로 인슐린 분비를 증가시켜 내당능장애를 개 선하며 항당뇨 효과를 나타내었다 (Han 등, 2012).I. 연구 목적
Ⅱ. 재료 및 방법
A. 재 료
세포 배양에 사용하는 Fetal bovine serum은 Sigma (Sigma-Aldrich., St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고 RPMI 1640은 Cellgro (Mediatech Inc., Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. Penicillin과 streptomycin은 Duchefa (Duchefa Biochemie B.V., RV Haarlem, Netherland)에서 구입하였다. 실험에 사용된 약제 glucose, palmitate, streptozotocin (STZ), N-acetylcysteine (NAC), reduced glutathione (GSH), nicotinamide (NAM) β-nicotinamide mononucleotide (NMN), β -nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+), L-kynurenine, L-lactate, L-Asparagine, 3-aminobenzamide (3-AB), 5-iodo-6-amino-1,2- Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다. Anti-acetyl-lysine, anti-caspase 3, anti-phospho-Akt, anti-Akt, anti-phospho-eIF2α, anti-eIF2α, anti-CHOP 대 부분의 항체들은 Cell Signaling Technology (Cell Signaling Technology Inc., Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Anti-calnexin 항체는 Stressgen (Enzo Life Sciences Inc., Victoria, BC, Canada)에서 구입하였고 anti-actin과 anti-JNK 항체 는 Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA)에서 구입하였고 anti-phospho-JNK 항체는 Invitrogen (Life Technologies Corporation., Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였으며 anti-NDUFA9는 Abcam (Abcam plc., Cambridge,
United Kingdom)에서 구입하였다.
INS-1 세포를 6 well plate에 well당 1×106개씩 분주하고 24시간 동안 배양하였
ATPLiteTM luminoscence ATP detection assay system (PerkinElmer Life Science., Boston, MA, USA)를 이용하여 세포내 ATP 양을 측정하였다. INS-1
담은 상등액 중 일부만 (50 ㎕) 만 취하여 plate에 넣은 다음 효소 (50X)를 첨가한
NeonTM trangsfection system (Life Technologies Corporation., Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 siRNA duplex 또는 Plasmid vector를 INS-1 세포에 형질주입 하였
주셨으며 pc-Visfatin은 그린진 바이오텍 (GreenGene Biotech., Gyouggido, South
의 염기서열은 마크로젠에서 분석하였다.
11. Glutamate dehydrogenase mutant plasmid vector 구축 가. ADP-ribosylation site mutant (C172A)
12. 통계
3번 이상의 독립적인 실험으로 통계 처리하였으며 오차는 SE값으로 나타내었다. 통 계 값은 Student's
t
test를 이용하여 구하였으며 군간 p 값이 0.05이상일 때 유의 성이 있다고 표시하였다.Fig. 7. Construction of GDH mutant
Genes Genbank Number siRNA sequence (5’→3’) Table 2. Genbank number and nucleotide sequence of siRNAs
Gene Genbank
Name Mutant
N-acetyl-cysteine (NAC) antioxidant reduced glutathiom (GSH) antioxidant
Mito-Tempol Mitochondrial antioxidant
FK-866 Nampt inhibitor
3-aminobenzamide (3-AB) PARP inhibitor 5-iodo-6-amino-1,2-benzopyro
ne (INH2BP) PARP inhibitor (mitocondrial)
sirtinol Sirtuin inhibitor
resveratrol Sirtuin activator
저해제 (Inhibitor)
Ⅲ. 결 과
A. 고농도 포도당/지방산 독성에 의한 INS-1 세포사멸에서 Nicotinamide 의 세포 사멸 억제 효과
INS-1 베타세포에 고농도 포도당/지방산을 처리하면 세포사멸이 유도된다 (Choi 등, 2011). Nicotinamide (NAM)가 고농도 포도당/지방산 독성에 의한 세포사멸을 억 제하는지 알기위해 INS-1 세포에 NAM를 고농도 포도당 (Glucose; 25 mM; HG)/지 방산 (Palmitate; 400 uM; PA)과 함께 처리 후, 농도별 또는 시간별로 MTT assay 및 DNA fragment assay를 실시하여 세포사멸 억제에 미치는 영향을 조사하였다. 고농도 포도당/지방산 처리 후 15시간 째 INS-1세포의 viability는 40%로 감소하며, DNA fragmentation은 0.5에서 2.0으로 증가하는데 NAM를 같이 처리하면 NAM 농도 의존 적으로 viability가 증가하며 20 mM NAM에서 viability가 77.5%까지 증가, DNA fragmentation은 0.9로 감소하였다 (Fig. 8A). 또한 고농도 포도당/지방산과 함께 20 mM NAM을 처리하면 시간 의존적으로 고농도 포도당/지방산에 의한 viability 감소와 증가된 DNA fragmentation을 회복시켰다 (Fig. 8B). 세포사멸시에 활성화되는 death caspase로 대표적인 단백질인 caspase 3의 발현을 western blot으로 확인하였을 때, 고농도 포도당/지방산에 의해 증가된 cleaved caspase 3 발현이 NAM의 농도 의존적 (Fig. 9A), 시간 의존적 (Fig. 9B)으로 감소하는 것을 확인하였다.
Fig. 8. NAM protects against HG/PA-induced INS-1 cell death. (A) INS-1 cells were seeded in 96-well plate at a density of 5×104and were maintained for 24h. INS-1 cells were treated with different concentrations of nicotinamide in the presence of 25 mM glucose (HG)/0.4 mM palmitate (PA) for 15 h. Cell viability was measured by MTT assay. Apoptotic cell death was measured by an increase in DNA fragmentation using the cell death detection ELISA kit.
Data represent mean ±SE from three independent experiments. *P<0.05;
**P<0.01, vs. HG/PA-treated control cells. (B) INS-1 cell were treated with 20 mM NAM in the presence or absence HG/PA for the indicated times. Cell viability was measured by MTT assay. DNA fragmentation was measured by the cell death detection ELISA kit. Data represent mean ±SE from three independent experiments. **P<0.01, vs. HG/PA-treated control cells.
Fig. 9. NAM protects against HG/PA-induced INS-1 cell death - Western blotting. INS-1 cells were seeded in 6-well plate at a density of 1×106 and were maintained for 24h. (A) INS-1 cells were treated with different concentrations of nicotinamide in the presence of 25 mM glucose (HG)/0.4 mM palmitate (PA) for 15 h. (B) INS-1 cell were treated with 20 mM NAM in the presence or absence HG/PA for the indicated times. Apoptotic cell death was measured by Western blot analysis of processed caspase 3 clevages or PARP cleavages. P-Cas 3; pro-caspase 3, C-Cas 3; cleaved caspase 3, P-PARP; pro-poly(ADP ribose) polymerase, C-PARP; cleaved pro-poly(ADP ribose) polymerase
B. STZ, 과산화수소, 사이토카인에 의한 세포사멸에서 Nicotinamide의 INS-1 베
Fig. 10. NAM protects against H2O2 or STZ-induced INS-1 cell death, but not protects against cytokine-induced cell death. INS-1 cells were treated with different concentrations of nicotinamide in the presence of cytokine mixture (5 ng/ml of IL-1β, 10 ng/ml of TNF-α, 50 ng/ml of INF-γ)(A) for 24h, H2O2
(75 μM)(B) for 3h or streptozotocin (STZ : 20 mM)(C) for 15 h. Cell viability was measured by MTT assay. Apoptotic cell death was measured by an increase in DNA fragmentation using the cell death detection ELISA kit. Data represent mean ±SE from three independent experiments. *P<0.05; **P<0.01, vs. H2O2- or STZ- treated control cells.
C. Nicotinamide의 고농도 포도당/지방산 독성에 의한 베타세포사멸 억제 기작
사멸에서는 활성산소-매개 산화적 스트레스 (ROS-mediated Oxidative stress)가 세 포사멸을 유도하는데 결정적인 역할을 하지 않을 것으로 추측되며, NAM에 의한 고농 도/포도당 독성에 의한 세포사멸 억제 효과는 항산화작용을 매개하지 않을 것으로 추 측된다.
Fig. 11. Protective effect of NAM on HG/PA-induced INS-1 cell death is not attributable to its anti-oxidant activity. INS-1 cells were treated with 20 mM NAM or different antioxidants, 2.5 mM N-acetylcysteine (NAC), 2.5 mM reduced glutathione (GSH) or 100 μM Mito-TEMPOL (Mito-T) in the presence of HG/PA (A), 20 mM streptozotocin (STZ) (B) or cytokines (5 ng/ml of IL-1β, 10 ng/ml of TNF-α, 50 ng/ml of INF-γ) (C) for 15 h. DNA fragmentation was measured by the cell death detection ELISA kit. *P<0.05;
**P<0.01, vs. DNA fragmentation of HG/PA-, STZ- or cytokine treated control cells.
Fig. 12. Protective effect of NAM on HG/PA-induced INS-1 cell death is not attributable to its anti-oxidant activity-ROS generation. (A, B) ROS level were analyzed by measuring fluorescent intensity in the flow cytometer (Excitation: 488 nm, Emission: 530 nm) after dichlorodihydro fluorescein diacetate (DCFH2-DA) staining for 30 min in INS-1 cells treated with BSA, HG/PA or HG/PA and 20 mM NAM for 12 h, respectively.
2. NAD depletion
고농도 포도당/지방산에 의한 ATP 양의 감소를 예방하였다 (Fig. 13C 와 13D).
Fig. 13. NAM prevents HG/PA-induced reduction of energy level. (A), (C) INS-1 cells were treated with different concentrations of nicotinamide in the presence of HG/PA for 12 h. (B), (D) INS-1 cell were treated with 20 mM NAM in the presence or absence HG/PA for the indicated times. (A), (B) Level of total NAD in cellular extract was determined using a NAD+/NADH Quantification kit. (C), (D) Cellular ATP content was determined using a ATPLiteTM luminoscence ATP detection assay system. Data represent mean
±SE from three independent experiments. $P<0.05; $$P<0.01, vs. tNAD or ATP of BSA-treated INS-1 cells. #P<0.05; ##P<0.01, vs. tNAD or ATP of BSA-treated control cells. *P<0.05; **P<0.01, vs. tNAD or ATP of HG/PA-treated control cells
3. NAD+ 보충
fragmentation에도 차이가 없음을 확인하였다 (Fig. 15).
세포외부에서 처리한 NMN, NAD+ 경우 nucleotide가 세포벽을 통과 할 수 있는지 에 대한 의문이 있어 NMN, NAD+ 및 Kyn을 처리 후 세포내 tNAD 양이 증가하는지 알기위해 세포내 tNAD 양을 측정하였다. NMN, NAD+, L-Kyn 모두 농도 의존적으로 세포내 tNAD 양을 증가시켰다 (Fig. 16A, 16B 와 16C). 따라서 세포외부에서 처리한 NMN, NAD+그리고 L-Kyn는 세포내부로 들어가서 세포내 tNAD 양을 증가시켰을 것으로 생각된다.
놀랍게도, INS-1 베타세포에 STZ를 처리해 세포사멸을 유도한 조건에서 NMN, NAD+ 및 L-Kyn의 처리 또한 STZ에 의한 세포사멸을 억제하지 못했다 (Fig.
17).
결과를 종합해 볼 때 고농도 포도당/지방산에 의해 감소된 NAD+ 수준을 세포외부
결과를 종합해 볼 때 고농도 포도당/지방산에 의해 감소된 NAD+ 수준을 세포외부