Electrophoretic mobility shift analysis(EMSA)

Nuclear extract는 Satriano 및 Schlondorff의 방법 (Satriano J와 Schlondorff D, 1994)에 의해 조제하였다. 세포를 PBS로 세척한 뒤, 1.5 ml의 hypotonic buffer A (10 mM Hepes, PH 7.6, 15 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 1.0 mM dithiothreitol-DTT, 0.2% Nonidet P-40) 에 재현탁 시키고, 5분간 얼음 위에 방치하였다. 세포 homogenate를 650 g에서 원심 분리한 뒤, buffer A로 한번 세척하였다. Pellet 을

100 µl buffer C (25 mM Hepes, PH 8.0, 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1.0 mM dithiothreitol-

질 20 µl 을 피부의 각질층 면에 적용한 다음, 리셉터 용액 (인산 완충용액)을 일

vehicle을 도포한 군, 자외선을 조사하면서 1% FDP를 도포한 군으로 나누어 한

(2) GSH assay 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH)을 넣어 2,4-dinitrophenylhydrazone (DNP-hydrazone)로 유도체화하고 2M Tris base/30% glycerol로 중화하고 SDS-PAGE를 standard procedure

로 시행하였다. 10% SDS-polyacrylamide gel에 전기영동하여 polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane에 transfer하였다. 0.1% Tween과 5% non-fat dried milk로 block시키 고 anti-DNP antibody와 anti-rabbit IgG horseradish peroxidase을 차례로 반응시킨 후 chemiluminescence (Luminol)로 develop 하여 관찰하였다.

13. 통계처리통계처리통계처리통계처리

모든 자료는 mean ± S.E.로 나타내었고 Student’s t test로 통계 처리하여 p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.

III. 결과 결과 결과 결과

A. UVB에에에 의한에 의한의한의한 HaCaT keratinocyte 손상손상손상손상 보호효과보호효과보호효과 보호효과

1. UVB에 의한 세포손상 억제효과

자외선에 의한 cell death는 세포배양액으로 유리되는 젖산탈수소화효소 (lactate dehydrogenase, LDH)를 정량하는 방법으로 측정하였다. 배양한 HaCaT keratinocyte에 UVB 30 mJ/cm² 로 조사한 후 FDP를 20 mM부터 0.1 mM까지의 농도 로 처리한 결과 20, 10, 5 mM의 농도에서는 세포배양액으로 유리되는 LDH를 통 계적으로 유의한 수준으로 억제하였다 (Fig. 2).

2. Glycolytic metabolites의 UVB에 의한 세포손상 보호효과

UVB에 의한 세포 배양액으로의 LDH유리가 FDP고유의 효과인지 여부를 검 증하기 위하여 동일한 조건 하에서 FDP, F6P (Fructose 6-phosphate), F1P (Fructose 1-phosphate), F2,6DP (Fructose 2,6-diphosphate)의 영향을 비교실험 하였다. 시험결과 배양한 HaCaT keratinocyte에 UVB 30 mJ/cm² 로 조사한 후 FDP를10 mM로 처리한 경우에는 통계적으로 유의한 수준으로 세포배양액으로 유리되는 LDH를 억제하 였으나, F6P, F1P, F2,6DP의 경우에는 자외선에 의해 유도되는 LDH 유리를 억제하 지 못하였다 (Fig. 3).

Fig. 2. Effects of FDP on UV-induced cell death. Cells were UVB-irradiated (30 mJ/cm2) and further incubated with FDP for 24 h in DMEM containing 1% serum. The activity of LDH released in media was measured. The results are expressed as mean ± S.E. in four different experiments. * p<0.05 vs control; # p<0.05 vs UV treated.

Fig. 3. Effects of glycolytic metabolites on UV-induced cell death. Cells were UVB-irradiated (30 mJ/cm2) and further incubated with FDP metabolites (10 mM) for 24 h in DMEM containing 1% serum. The activity of LDH released in media was measured. The results are expressed as mean ± S.E. in four different experiments. * p<0.05 vs control; # p<0.05 vs UV treated.

3. UVB에 의해 유도되는 COX-2 발현에 미치는 영향

자외선에 의해 COX-2 단백질의 발현증가를 Western Blot으로 확인하였다. 배 양한 HaCaT keratinocyte에 UVB 30 mJ/cm² 로 조사한 후 FDP를 20 mM, 10 mM의 농도로 처리한 결과 자외선에 의한 COX-2 단백질 발현을 농도 의존적으로 억제 하는 경향을 나타내었다. 항산화물질중 하나인 NAC 10 mM을 처리한 경우에도 자외선에 의한 COX-2 단백질의 증가가 효과적으로 감소되는 것을 확인할 수 있 었다 (Fig. 4).

Fig. 4. FDP prevents the UV-induced COX-2 expression in cultured HaCaT keratinocytes. Cells were UVB-irradiated (30 mJ/cm²) and further incubated with FDP and NAC (10 mM) for 24 h in DMEM containing serum 1%. Total protein was extracted and 20 µg of proteins was subjected to SDS-acrylamide gel electrophoresis, and analyzed by

Western blotting using specific antibody. UVB irradiation significantly increased COX-2 protein compared with unirradiated control. FDP and NAC, a precursor of glutathione, prevented this alteration.

4. UVB에 의해 유도되는 MMP-2활성 및 발현에 미치는 영향

자외선 조사에 의해서 피부에서 MMP의 활성 및 발현이 증가한다는 것은 잘 알려진 사실이다. 표피유래 Keratinocyte에서 발현된다고 알려진 MMP-2,9의 활성 을 Zymograpy를 이용하여 확인하였다. 배양한 HaCaT keratinocyte에 UVB 30 mJ/cm² 로 조사한 후 세포 배양액으로 유리되는 MMP-2, 9의 활성이 시간에 따라 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 자외선 조사 후 48, 72 시간째 MMP-2, 9의 활성이 확연히 증가하는 것을 Zymograph를 통해 확인할 수 있었다 (Fig. 5A).

UVB조사 후 FDP를 10, 5, 1 mM의 농도로 처리한 결과 농도 의존적으로 자외선에 의한 MMP-2,9의 활성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 5B). 자외선에 의 해 증가된 MMP-2, 9의 활성이 발현의 증가에 의한 것인지를 검증하기 위하여 RT-PCR을 통해 mRNA의 발현을 확인하였다. 시험결과 UVB 조사에 의해 MMP-2의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었으며, FDP 10 mM을 처리한 경우 자외 선에 의한 MMP-2 발현이 억제되는 경향을 나타내었다 (Fig. 6). 그러나 MMP-9의 경우는 자외선에 의한 mRNA 의 발현증가 경향이 나타나지 않았다.

Fig. 5. FDP prevents the UV-induced MMP-2,9 activities in cultured HaCaT keratinocytes. Cells that had been pretreated with FDP (1, 5, 10 mM) were exposed to UVB(30 mJ/cm²). After UVB irradiation, cells were incubated with FDP in fresh culture media without phenol-red and FBS and MMP-2, 9 activities in the media were determined.

Zymografic patterns of MMP-2, 9 secreted into conditioned media of HaCaT keratinocytes after UVB irradiation(A). UVB irradiation significantly increased MMP-2, 9 activites compared with unirradiated control. FDP prevented this alteration(B).

Fig. 6. FDP prevents the UV-induced MMP-2 expression in cultured HaCaT keratinocytes. Cells that had been pretreated with FDP (10 mM) were exposed to UVB (30 mJ/cm²). After UVB irradiation, cells were incubated with FDP in fresh culture media for indicated time until 8 h and mRNA levels of MMP-2 was determined by RT-PCR. The graph was depicted with arbitrary unit of MMP-2 mRNA/GAPDH ratio.

5. UVB 조사에 의한 세포 항산화 시스템변화에 미치는 영향

Fig. 7. FDP preserves the cellular antioxidant capacity. Effects of FDP on the antioxidant capacity of HaCaT keratinocytes with (A) or without (B) exposures to UVB were examined.

HaCaT keratinocytes that had been exposed to UV irradiation (30 mJ/cm²) were incubated with FDP (10 mM) in fresh culture media containing 10% FBS for 24 h. Cells were harvested by scraping and antioxidative parameters were measured. The results are expressed as mean ± S.E. of four different experiments. * p<0.05

Fig. 8. DPPH radical-scavenging activity of the FDP. The reaction mixture contained 0.1 ml of 1 mM DPPH radical solution, 0.8 ml of 99% ethanol, and 0.1 ml of test compounds The solution was rapidly mixed and scavenging capacity was measured spectrophoto- metrically by monitoring the decrease in absorbance at 515 nm.

B. UVA에에에 의한에 의한의한의한 Fibroblast 손상손상손상손상 보호효과보호효과보호효과 보호효과

FDP 1, 5 mM을 처리한 경우에는 UVA에 의한 MMP-1의 발현이 억제되는 것을 확 인할 수 있었다. 항산화제로 알려진 NAC 5 mM을 처리한 경우에도 같은 경향을 나타내었다 (Fig. 9).

3. UVA에 의한 GSH 감소에 미치는 영향

Fibroblast에 UVA 15 J/cm²로 조사한 후 시간대별로 GSH의 변화를 측정하고, 동시에 FDP를 처리한 후 UVA를 조사하고 GSH의 변화를 측정하였다. 실험결과 fibroblast에 UVA 조사 후 8시간대에 GSH가 현저하게 감소함을 확인 할 수 있었 고, 이러한 현상은 72시간까지 지속되었다. 그러나 UVA와 동시에FDP를 처리한 군의 경우는 UVA를 조사하지 않은 대조군과 유사한 정도로 GSH 양의 변화가 관찰되지 않았다 (Fig. 10).

Fig. 9. FDP prevents the UV-induced MMP-1 expression and procollagen depression in cultured skin fibroblast. Normal human fibroblast that had been exposed to UVA irradiation (15 J/cm²) were incubated with FDP (1, 5 mM) and NAC (5 mM) in fresh culture media containing 10% FBS for 48 h. The media containing MMP-1 and procollagen were subjected to SDS-acrylamide gel electrophoresis, and analyzed by Western blotting using specific antibody. UVA irradiation significantly increased MMP-1 protein and decreased procollagne level compared with unirradiated control. FDP and NAC, a precursor of glutathione, prevented these alteration.

Fig. 10. FDP preserves the GSH in cultured skin fibroblast after UVA irradiation.

Normal human fibroblasts that had been exposed to UVA irradiation (15 J/cm²) were incubated with FDP (1 mM) in fresh culture media. UVA-irradiation decreased total glutathione level compared with unirradiated control. The results are expressed as mean ± S.E. of three different experiments. * p<0.05

C. 자외선에자외선에자외선에 의해자외선에 의해의해의해 유도되는유도되는유도되는유도되는 세포내세포내세포내세포내 신호전달계에신호전달계에신호전달계에신호전달계에 미치는미치는미치는미치는 영향영향영향영향

못하였다. 또한 UVB에 의한 p38의 인산화를 FDP가 억제하지 못했던 결과와 달 리 항산화제로 알려진 NAC에 의해서는 UVB에 의해 인산화 된 ERK/JNK/p38 모 두 강하게 억제되는 현상이 관찰되었다 (Fig. 11B).

2. 자외선에 의해 유도되는 PI3K/Akt 활성에 미치는 영향

MAPK외에도 cell survival에 주로 관여하는 PI3K/Akt 경로 또한 UV에 의해 유도되는 중요한 세포내 신호전달 경로이다. 특히 최근에는 UV에 의한 HaCaT keratinocyte 에서의 COX-2 발현에 Akt및 GSK3β의 관련성이 중요하게 대두된 바 있다. 따라서 UVB에 의한 Akt/GSK3β의 인산화에 대한 FDP의 영향을 검토하였 다. 실험결과 UVB조사 10분 후부터 MAPK와 마찬가지로 Akt/GSK3β 가 인산화 되는 것을 확인할 수 있었으며, 이후 인산화가 유지되다가 4시간 대에는 대조군 수준으로 떨어지는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 12A). UVB에 의한 Akt 및 GSK3β의 인산화는 10 mM의FDP를 처리한 경우 억제되었으며, 또한 항산화제로 알려진 NAC에 의해서도 UVB에 의해 인산화된 Akt가 억제되는 현상을 관찰할 수 있었다 (Fig. 12B).

Fig. 11. FDP inhibits UVB-induced ERK and JNK phosphorylation in HaCaT keratinocyte. HaCaT keratinocytes were starved by replacing the medium with serum free DMEM and culturing for 24 h. The cells were then pretreated with FDP (10 mM) for 30 min.

The cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm²) and subsequently cultured for indicated time (A). HaCaT keratinocytes were pretreated with FDP and NAC (10 mM). The cells irradiated with UVB and subsequently cultured for 10 min (B). The cells were lysed, and the phosphorylation levels were estimated by immunoblotting.

Fig. 12. FDP inhibits UVB-induced Akt and GSK3ββββ phosphorylation in HaCaT keratinocyte. HaCaT keratinocytes were starved by replacing the medium with serum free DMEM and culturing for 24 h. The cells were then pretreated with FDP (10 mM) for 30 min.

The cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm²) and subsequently cultured for indicated time (A). HaCaT keratinocytes were pretreated with FDP and NAC (10 mM). The cells irradiated with UVB and subsequently cultured for 10 min (B). The cells were lysed, and the phosphorylation levels were estimated by immunoblotting.

3. 자외선에 의해 유도되는 transcription factor활성에 미치는 영향

다음은 FDP가 COX-2, MMP-2관련 transcription factor의 활성에 미치는 영향을 검토하였다. FDP는 UVB에 의해 유도되는 NF-κB, AP-1, CREB등, transcription factor 의 활성을 억제하였다 (Fig. 13). 또한 UVB에 의해AP-1의 구성성분 중 하나인 Jun의 활성화에 미치는 FDP의 영향을 검토한 결과, UVB조사 후 10 분 후부터 c-Jun의 인산화가 관찰되었으며 (ser 73), 자외선 조사 후 4시간까지도 인산화가 지 속되는 현상을 관찰할 수 있었다 (ser63) (Fig. 14A). UVB에 의한 c-Jun의 인산화는 FDP 10 mM 처리에 의해 강하게 억제되었으며, 항산화제인 NAC에 의해서도 억제 되는 현상을 관찰할 수 있었다 (Fig. 14B).

Fig. 13. FDP attenuates UVB-induced transcription factors activities. HaCaT were pretreated with FDP (10 mM) for 30 min. The cells were then irradiated with UVB (30 mJ/cm²) and subsequently cultured for indicated time. And DNA binding activity of transcription factors were determined by EMSA as described in materials and methods.

Fig. 14. FDP inhibits UVB-induced c-Jun phosphorylation in HaCaT keratinocyte.

HaCaT keratinocytes were starved by replacing the medium with serum free DMEM and culturing for 24 h. The cells were then pretreated with FDP (10 mM) for 30 min. The cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm²) and subsequently cultured for indicated time (A).

HaCaT keratinocytes were pretreated with FDP and NAC (10 mM). The cells irradiated with UVB and subsequently cultured for 1 h (B). The cells were lysed, and the phosphorylation levels were estimated by immunoblotting.

4. 자외선에 의한 MMP-2발현에 영향을 미치는 세포내 신호전달계에 대한 FDP의 영향

UVB에 의해 증가되는 MMP-2의 발현 조절에 영향을 미치는 세포내 신호전 달계에 대해 검토하였다. UVB 조사 한 경우 MMP-2의 발현이 증가하였으며, FDP 와 NAC 10 mM 을 처리한 경우 대조군 수준으로 발현이 억제되었다. MAPK inhibitor중 SP600125 (5 µM, JNK inhibitor)와 wortmannin (100 nM, PI3K inhibitor)을 처리한 경우 MMP-2의 발현이 강하게 억제되었으며, SB202190 (5 µM, p38 inhibitor) 에 의해서도 발현이 억제되는 경향을 나타내었다. 그러나 PD98059 (10 µM, ERK inhibitor)을 처리한 경우에는 UVB에 의한 MMP-2의 발현을 억제하지 못하였다

UVB에 의해 증가되는 MMP-2의 발현 조절에 영향을 미치는 세포내 신호전 달계에 대해 검토하였다. UVB 조사 한 경우 MMP-2의 발현이 증가하였으며, FDP 와 NAC 10 mM 을 처리한 경우 대조군 수준으로 발현이 억제되었다. MAPK inhibitor중 SP600125 (5 µM, JNK inhibitor)와 wortmannin (100 nM, PI3K inhibitor)을 처리한 경우 MMP-2의 발현이 강하게 억제되었으며, SB202190 (5 µM, p38 inhibitor) 에 의해서도 발현이 억제되는 경향을 나타내었다. 그러나 PD98059 (10 µM, ERK inhibitor)을 처리한 경우에는 UVB에 의한 MMP-2의 발현을 억제하지 못하였다