C. 자외선에 의해 유도되는 세포내 신호전달계에 미치는 영향
5. 자외선에 의한 COX-2 발현에 영향을 미치는 세포내
UVB에 의해 증가되는 COX-2의 발현에 조절에 영향을 미치는 세포내 신호 전달계에 대해 검토하였다. UVB 조사 한 경우 COX-2의 발현이 증가하였으며, FDP와 NAC 10 mM 을 처리한 경우 대조군 수준으로 발현이 억제되었다. MAPK inhibitor중 SB202190 (5 µM, p38 inhibitor) 와 wortmannin (100 nM, PI3k inhibitor)을 처리한 경우 MMP-2의 발현이 강하게 억제되었으며, PD98059 (10 µM, ERK inhibitor)에 의해서도 발현이 억제되었다. 그러나 SP600125 (5 µM, JNK inhibitor)을 처리한 경우에는 UVB에 의한 COX-2의 발현을 억제하지 못하였다 (Fig. 16). 이상 의 결과를 볼 때, FDP에 의해 조절되는 UVB에 유도 COX-2 발현은 ERK/PI3K을 경유하는 것으로 유추할 수 있다.
Fig. 16. Effects of MAPK and PI3K inhibitor on UVB-induced COX-2 expression in HaCaT keratinocyte. The cells were pretreated with FDP (10 mM), NAC (10 mM), PD98059 (10 µM), SB202190 (5 µM), SP600125 (5 µM), wortmannin (100 nM) for 30 min.
The cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm2) and subsequently cultured for 24 h and protein levels of COX-2 was determined by immunoblotting. The graph was densitometric analysis for COX-2.
D. Hairless mouse 피부에서피부에서피부에서 자외선에피부에서 자외선에자외선에 의해자외선에 의해의해 유도되는의해 유도되는유도되는유도되는 산화적산화적산화적산화적 손상에손상에손상에 미치는손상에 미치는미치는미치는 영향영향영향영향 이제까지의 결과를 볼 때 FDP는 자외선에 의해 유도되는 피부세포의 염증반 응 및 산화적 stress를 억제함으로써 세포를 보호하는 효과가 있으리라 기대된다.
따라서 피부에 도포하였을 경우에 FDP가 피부를 투과하여 자외선에 의한 피부손 상을 보호할 수 있는지를 알아보기 위하여 hairless mouse를 이용한 in vivo 실험을 수행하였다.
1. FDP의 피부투과 시험
In vivo에서의 효능시험을 진행하기에 앞서 피부에 도포했을 때 피부를 투과
하여 효과를 나타낼 수 있는지 여부를 Franz-type diffusion cell을 이용한 피부흡수 실험을 수행하였다. 14C로 표지된 FDP를 피부의 각질층 면에 적용한 다음, 시간 에 따라 리셉터 부분의 용액을 채취하여 피부 전층을 통과한 FDP의 양을 LSC를 이용하여 측정하였다. 실험결과 14C-FDP가 시간에 따라 피부를 투과하는 양이 증 가하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 17). 처음 도포한 14C-FDP의 양을 기준으로 볼 때 24 시간 경과 후 약 3.5±1.09%의 radioactivity가 피부를 투과한 것으로 확 인되었다.
Fig. 17. Topically applied FDP readily penetrates the skin. Freshly excised hairless mouse skin was mounted in Franz-type diffusion cells and [14C]-FDP solution (20 µl) was uniformly applied. The solution for topical application was prepared by adding 2 µCi of [14C]-FDP (0.1
mCi/ml, 248 mCi/mmol) to a cold FDP solution (1% w/v) in 70% water and 30% propylene glycol. Following application, aliquots of receptor chamber fluid were removed at indicated time and the amount of radioactivity in each sample was measured. Relative amount of [14C]-FDP in the receptor over time after penetration (A). The relative [14C]-FDP content of the receptor, stratum corneum (SC), and remaining skin 24 h after topical application (B).
Data are presented as mean ± S.E. of five determinations. .
2. 자외선에 의해 유도되는 항산화계 손상에 미치는 효과
의 양이 증가한 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 19). 반면 SOD의 단백질 양은 자외 선 조사 혹은 FDP를 도포한 모든 실험군에서 유의적인 변화를 관찰할 수 없었다.
.
Fig. 18. FDP preserves the antioxidant capacity of hairless mouse skin. Effects of FDP (1%, w/v) on the antioxidant capacity of hairless mouse skin with (A) or without (B) multiple exposures to UVB (100 mJ/cm2 each day for 4 consecutive days) were determined as described in the Materials and Methods. GSH: glutathione; CAT: catalase; SOD:
superoxide dismutase. The experiments were repeated three times and data was presented as mean ± S.E. * p<0.05 vs control; # p<0.05 vs UV treated.
Fig. 19. FDP reverses the UVB-induced loss of catalase protein. Immunoblot analysis of catalase and SOD from hairless mouse skin (A). Lane 1: non-irradiated control; Lane 2: FDP (1%) alone; Lane 3: irradiated control; Lane 4: UVB+FDP (1%). Densitometric analysis of catalase proteins (B). The results are expressed as mean ± S.E. of 4 samples in each group.
*P<0.05
3. 자외선에 의해 유도되는 단백질 손상에 미치는 효과
단백질을 구성하는 아미노산 중 lysine, arginine, proline은 산화반응에 의해 carbonyl유도체를 형성하며, 이 carbonyl group은 DNPH와 반응하여 안정한 형태의 hydrazone을 형성한다. 이렇게 형성된 hydrazone은 산화적 스트레스에 의한 단백 질의 손상 지표로 널리 사용되고 있다 (Levine RL, 2002). 자외선에 의한 단백질 손상에 미치는 FDP의 영향을 검토하기 위하여 anti-DNP 항체를 이용한 Western blot으로 피부 단백질의 손상정도를 측정하였다. 실험결과 UVB를 조사한 경우 표피에서 산화된 단백질이 유의적으로 증가하였으며, FDP를 도포한 경우에 표피 및 진피에서 산화된 단백질이 감소하였다 (Fig. 20).
피부에 자외선을 조사하면 생성되는 활성산소중의 하나인 H2O2를 hairless mouse 피부 파쇄액에 처리한 경우 대조군에 비해 산화된 단백질이 유의적으로 증가하였다 (149%). 항산화제로 알려진 ascorbic acid가 H2O2에 의한 산화단백질 생성을 유의적으로 억제한 반면, FDP는 H2O2에 의한 산화단백질 생성을 억제하 지 못하였다 (Fig. 21). 이는 DPPH 라디칼 소거효능에 대한 실험 결과와 마찬가지 로 자외선에 의해 유도되는 산화적 손상에 대한 FDP의 보호효과가 직접적인 라 디칼 소거에 의한 것이 아니라는 것을 의미한다.
Fig. 20. FDP prevents UVB-induced protein oxidation in hairless mouse skin.
Immunoblot analysis of carbonyl residues in protein extracts from epidermal (A) and dermal (B) tissues of hairless mouse skin. Protein extracts (20 µg) were incubated with DNPH, separated by SDS-PAGE, blotted onto a nitrocellulose membrane, and incubated with polyclonal rabbit anti-dinitrophenylhydrazone antibody. The -DNP lanes contain underivatized proteins for negative control. Lane 1, 4: non-irradiated control, lane 2, 5:
irradiated control, Lane 3, 6: UVB + FDP (1%).
Fig. 21. FDP can not prevent in vitro protein oxidation by hydrogen peroxide.
Immunoblot analysis of carbonyl residues in protein extracts from hydrogen-peroxide-treated (1 mM for 1 h at 37°C) mouse skin extracts. Protein extracts (10 µg) were incubated with
DNPH, and subjected to Western blot with polyclonal rabbit anti-dinitrophenylhydrazone antibody (A). Lane 1:non-treated control, Lane 2: H2O2 (1 mM), Lane 3: H2O2 + vit C (5 mM), Lane 4: H2O2 + FDP (5 mM). Total proteins were visualized by Coomassie Blue (B).
Densitometric analysis of total carbonylated proteins (C). The results are expressed as the mean ± S.E. of 3 different experiments. *p<0.05.
IV. 고 고 고 고 찰 찰 찰 찰
있음이 보고되었다 (Ahn SM 등, 2002). 본 연구에서 FDP는 각질형성세포 배양 모
하지 않았다 (Fig. 6). 자외선에 의해 hairless mouse 피부에서 MMP-2,9의 발현이
radical scavenging에 의한 작용인지 알아보기 위하여 실험해본 결과 FDP는 DPPH
라겐 합성을 감소시키고 MMP-1의 발현을 증가시켜 콜라겐 분해를 촉진시켜 피
ERK, JNK 및 p38이 인산화 되며, 이후 감소하기 시작하여 4시간 대에는 대조군
Keratinocyte에서 자외선에 의해 활성화되는 ERK에 의해 MMP-2의 발현이 조절된
얻었으나, 어떠한 기전에 의한 것인지는 확인할 수 없었다. 이상의 결과로 볼 때
적으로 UVB를 조사하여 산화적 stress를 유도하는 모델을 사용하였다. 100 mJ/cm2
생길 경우 산화적 stress나 활성산소의 평형상태에 영향을 주게 된다. 따라서 활
억제하여 MMP-2와 COX-2의 발현을 억제하는 것이라고 추정되지만 (Fig. 22) 좀 더 세밀한 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다. 또한 FDP는 피부에 도포하였 을 경우에 피부를 투과하여 자외선에 의해 유도되는 피부손상을 억제하는 효능 을 나타내므로 염증반응, 광노화, 피부암 등의 병리학적 증상을 예방하기 위한 목적으로 사용 가능할 것으로 생각된다.
Fig. 22. Schematic diagram for the inhibitory role of FDP in UV-induced skin inflammation. FDP could reduce COX-2 and MMP-2 expression by regulating UVB-induced alteration of cellular signaling pathway. FDP also could reduce the cellular UV-induced ROS generation by increasing metabolic flux through PPP.
V. 결 결 결 론 결 론 론 론
Fructose 1,6-diphosphate (FDP)가 자외선에 의해 유도되는 염증반응 및 산화적 스트레스를 억제할 수 있는지를 피부세포배양 모델과 in vivo 동물시험을 통해 연 구하였다.
FDP는 HaCaT keratinocytes에서 UVB에 의해 유도되는 세포손상을 억제하고 COX-2, MMP-2의 발현을 억제하였다. 또한 직접적인 라디칼 소거효능 없이 UVB 에 의한 세포내 항산화계의 손상을 보호하였다.
UVB에 의해 변화되는 세포내 신호전달계에 미치는 FDP의 영향을 COX-2와 MMP-2의 발현을 중심으로 연구해 본 결과 ERK, JNK, Akt 및 GSK3β의 인산화를 억제하였으며, AP-1, NF-κB, CREB의 활성화를 억제하였다.
Franz-type diffusion cell을 이용한 피부투과 시험결과 FDP는 피부에 도포하였 을 경우 투과할 수 있는 물질이었다. 따라서 UVB에 의해 유도되는 피부손상을 억제할 수 있는지 hairless mice 피부에 FDP를 도포하여 시험해 본 결과 FDP는 UVB에 의해 유도되는 항산화계 손상을 억제하고 산화된 단백질 생성을 억제하 는 효과를 나타내었다. 이러한 결과로 유추해 볼 때 FDP는 자외선에 의해 유도 되는 세포내 신호전달계를 조절하거나 항산화계를 보호함으로써 자외선에 의한 피부염증반응을 억제함으로써 피부손상을 보호할 수 있을 것으로 생각된다.
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