cytochrome P450 reductase, NADPH oxidase, lipoxygenase 또는 cyclooxygenase 등에 의해 생성된다. 생성된 활성산소종들은 세포내 단백질, 지질 또는 핵산 등을 공 격, 손상을 주게 되며 이러한 손상이 축적되어 염증 및 노화 등의 병리학적 손상 을 일으키게 된다. 활성산소종들은 이외에도 다양한 종류의 세포내 신호 전달계 에 영향을 주는 것으로 알려져 있는데, mitogen activated protein kinase (MAPK) 경로 의 활성화, protein kinase C 및 Ca++ signaling의 변화, AP-1, NF-kB등을 비롯한 각종
전사인자 (transcription factors)의 활성화 등을 통해 세포내 유전자 발현을 포함한
Fig. 1. ROS-mediated activation of various cell signaling pathway in the skin.
뿐 아니라 급성염증 (acute inflammation) 반응을 매개한다는 보고도 있다. 또한 피
Atypical PKC (aPKC) 경로 또한 UVB 유도 COX-2 발현과 관련되어 있을 것
COX-2의 발현을 억제하는 것으로 보고된 바 있는 Fructose 1,6-diphspate (FDP)가
이외에도 FDP는 신장, 간, 뇌 등의 저산소성 손상 (hypoxic injury) 또는 허혈/
에는 그 실험적 근거가 불충분하며 또한 일부 결과와 부합되지 않는 경우도 있
C. 연구과제의연구과제의연구과제의 목표연구과제의 목표목표목표
최근 human keratinocyte cell line (HaCaT)에서 FDP가 UVB 유도 prostaglandin 생성을 유의적으로 억제하며, 이는 COX-2 발현 및 그에 따른 cyclooxygenase 활 성 억제에 기인한다는 사실을 보고한 바 있다.
본 연구에서는 COX-2의 발현 외에도 자외선에 의해 유도되는 MMP활성증 가 등의 염증반응에 미치는FDP의 조절작용과 함께. UVB와 관련된 세포 신호 전달체계에 미치는 영향을 검토함으로써, UVB 유도 피부병변의 효과적 제어를 위한 FDP의 응용 가능성을 탐색하고 그 이론적 근거를 제시하고자 하였다. 마 지막으로 피부에 도포했을 때 자외선에 의해 유도되는 산화적 스트레스를 억제 할 수 있는지를 in vivo동물시험을 통해 검토함으로써 자외선에 의해 유도되는 피부의 생리학적 기능변화, 즉 피부 염증 및 노화, 피부암 등에의 응용 가능성 을 검토하고자 하였다.
II. 재료 재료 재료 재료 및 및 및 및 방법 방법 방법 방법
A. 재료재료재료 재료
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), Penicillin-streptomycin, 0.25%
trypsin-EDTA는 Gibco, BRL (Grand Island, NY, USA)에서, fetal bovine serum 은 Hyclon (Logan, UT, USA)에서, D-fructose-1,6-diphosphate (FDP), N-acetylcysteine (NAC), 등은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 각각 구매하였다. MAPK inhibior인 SP600125 (JNK inhibitor), PD98059 (ERK inhibitor), SB202190 (p38 inhibitor)와 wortmanin (PI3K inhibitor)는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. ERK, JNK, p38, Akt, Research Center, DKFZ, Heidelberg, Germany)로부터 분양 받아 사용하였으며, normal human fibroblast는 사람의 포피로부터 분리 배양하여 사용하였다. 세포는 DMEM 에 10% FBS, 10% penicillin-streptomycin (100 Unit/ml, 100 μg /ml) 이 첨가된 배지로
세포배양기 (37 , 5% CO℃ 2 95% air)에서 배양하였다. 세포의 배양을 위해서는0.25% DENKI, Japan)을 이용하여 조사하였다. 광량은 IL1700 radiometer (International Light Inc., Newburyport, MA, USA)를 사용하여 측정하였다 자외선 조사 전에 배지를 제
여기에 FDP를 각 농도로 처리한 후, 16~20시간 동안 배양하였다. 일정시간 경과 후, 배양 상층액을 적당량 취하여 세포 손상의 지표 효소인 젖산탈수소화효소 (lactate dehydrogenase, LDH)의 양을 정량하였다. 배양 상층액 중의 LDH 양은 Promega사 (Madison, WI, USA)의 Cytotox 96 non-radioactive cytotoxicity assay 키트 를 이용하여 정량한 후 흡광도는 ELISA reader를 이용하여 측정하였다. 간 동안 blocking한 뒤 Akt, phospho-Akt, phospho-GSK-3β, phospho-ERK, phospho-p38, 항체(1/1,000) 등의 1차 항체로 3-4 시간 동안 처리하고, horseradish peroxidase- 결
합 2차 항체 및 LumiGlo (NEN Biolabs, Beverly, MA, USA)를 이용하여 band intensity를 확인하였다.
6. RT-PCR
Total RNA는 acid guanidium thiocyanate-phenol chloroform (AGPC) 방법에 의하 여 분리한 후, denaturating solution (4M guanidium thiocyanate, 25 mM sodium citrate:
pH 7.0, 0.1 M 2-mercaptoethanol, 0.5 % sarcosyl), 2 M sodium acetate (pH 4.0), phenol 을 1:0.1:1 의 비율로 처리하고, chloroform/isoamyl alcohol (v/v, 49:1) 을 넣고 잘 섞은 (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)로 PCR 반응하였다.
MMP-2 primer forward (5’-CAC CTA CAC CAA GAA CYY CC-3’)
reverse (5’ AAC ACA GCC TTC TCC TCC TG-3’) GAPDH primer forward (5’-GGT CCG AGT CAA CGG ATT TG-3’) reverse (5’-ATG AGC CCC AGC CTT CTC CAT-3’) destaining solution (MeOH 5ml, glacial acetic acid 5 ml, DW 40 ml)으로 탈색하였다.
8. Electrophoretic mobility shift analysis (EMSA)
Nuclear extract는 Satriano 및 Schlondorff의 방법 (Satriano J와 Schlondorff D, 1994)에 의해 조제하였다. 세포를 PBS로 세척한 뒤, 1.5 ml의 hypotonic buffer A (10 mM Hepes, PH 7.6, 15 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 1.0 mM dithiothreitol-DTT, 0.2% Nonidet P-40) 에 재현탁 시키고, 5분간 얼음 위에 방치하였다. 세포 homogenate를 650 g에서 원심 분리한 뒤, buffer A로 한번 세척하였다. Pellet 을
100 µl buffer C (25 mM Hepes, PH 8.0, 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1.0 mM dithiothreitol-
질 20 µl 을 피부의 각질층 면에 적용한 다음, 리셉터 용액 (인산 완충용액)을 일
vehicle을 도포한 군, 자외선을 조사하면서 1% FDP를 도포한 군으로 나누어 한
(2) GSH assay 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH)을 넣어 2,4-dinitrophenylhydrazone (DNP-hydrazone)로 유도체화하고 2M Tris base/30% glycerol로 중화하고 SDS-PAGE를 standard procedure
로 시행하였다. 10% SDS-polyacrylamide gel에 전기영동하여 polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane에 transfer하였다. 0.1% Tween과 5% non-fat dried milk로 block시키 고 anti-DNP antibody와 anti-rabbit IgG horseradish peroxidase을 차례로 반응시킨 후 chemiluminescence (Luminol)로 develop 하여 관찰하였다.
13. 통계처리통계처리통계처리통계처리
모든 자료는 mean ± S.E.로 나타내었고 Student’s t test로 통계 처리하여 p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
III. 결과 결과 결과 결과
A. UVB에에에 의한에 의한의한의한 HaCaT keratinocyte 손상손상손상손상 보호효과보호효과보호효과 보호효과
1. UVB에 의한 세포손상 억제효과
자외선에 의한 cell death는 세포배양액으로 유리되는 젖산탈수소화효소 (lactate dehydrogenase, LDH)를 정량하는 방법으로 측정하였다. 배양한 HaCaT keratinocyte에 UVB 30 mJ/cm2 로 조사한 후 FDP를 20 mM부터 0.1 mM까지의 농도 로 처리한 결과 20, 10, 5 mM의 농도에서는 세포배양액으로 유리되는 LDH를 통 계적으로 유의한 수준으로 억제하였다 (Fig. 2).
2. Glycolytic metabolites의 UVB에 의한 세포손상 보호효과
UVB에 의한 세포 배양액으로의 LDH유리가 FDP고유의 효과인지 여부를 검 증하기 위하여 동일한 조건 하에서 FDP, F6P (Fructose 6-phosphate), F1P (Fructose 1-phosphate), F2,6DP (Fructose 2,6-diphosphate)의 영향을 비교실험 하였다. 시험결과 배양한 HaCaT keratinocyte에 UVB 30 mJ/cm2 로 조사한 후 FDP를10 mM로 처리한 경우에는 통계적으로 유의한 수준으로 세포배양액으로 유리되는 LDH를 억제하 였으나, F6P, F1P, F2,6DP의 경우에는 자외선에 의해 유도되는 LDH 유리를 억제하 지 못하였다 (Fig. 3).
Fig. 2. Effects of FDP on UV-induced cell death. Cells were UVB-irradiated (30 mJ/cm2) and further incubated with FDP for 24 h in DMEM containing 1% serum. The activity of LDH released in media was measured. The results are expressed as mean ± S.E. in four different experiments. * p<0.05 vs control; # p<0.05 vs UV treated.
Fig. 3. Effects of glycolytic metabolites on UV-induced cell death. Cells were UVB-irradiated (30 mJ/cm2) and further incubated with FDP metabolites (10 mM) for 24 h in DMEM containing 1% serum. The activity of LDH released in media was measured. The results are expressed as mean ± S.E. in four different experiments. * p<0.05 vs control; # p<0.05 vs UV treated.
3. UVB에 의해 유도되는 COX-2 발현에 미치는 영향
자외선에 의해 COX-2 단백질의 발현증가를 Western Blot으로 확인하였다. 배 양한 HaCaT keratinocyte에 UVB 30 mJ/cm2 로 조사한 후 FDP를 20 mM, 10 mM의 농도로 처리한 결과 자외선에 의한 COX-2 단백질 발현을 농도 의존적으로 억제 하는 경향을 나타내었다. 항산화물질중 하나인 NAC 10 mM을 처리한 경우에도 자외선에 의한 COX-2 단백질의 증가가 효과적으로 감소되는 것을 확인할 수 있 었다 (Fig. 4).
Fig. 4. FDP prevents the UV-induced COX-2 expression in cultured HaCaT keratinocytes. Cells were UVB-irradiated (30 mJ/cm2) and further incubated with FDP and NAC (10 mM) for 24 h in DMEM containing serum 1%. Total protein was extracted and 20 µg of proteins was subjected to SDS-acrylamide gel electrophoresis, and analyzed by
Western blotting using specific antibody. UVB irradiation significantly increased COX-2 protein compared with unirradiated control. FDP and NAC, a precursor of glutathione, prevented this alteration.
4. UVB에 의해 유도되는 MMP-2활성 및 발현에 미치는 영향
자외선 조사에 의해서 피부에서 MMP의 활성 및 발현이 증가한다는 것은 잘 알려진 사실이다. 표피유래 Keratinocyte에서 발현된다고 알려진 MMP-2,9의 활성 을 Zymograpy를 이용하여 확인하였다. 배양한 HaCaT keratinocyte에 UVB 30 mJ/cm2 로 조사한 후 세포 배양액으로 유리되는 MMP-2, 9의 활성이 시간에 따라 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 자외선 조사 후 48, 72 시간째 MMP-2, 9의 활성이 확연히 증가하는 것을 Zymograph를 통해 확인할 수 있었다 (Fig. 5A).
UVB조사 후 FDP를 10, 5, 1 mM의 농도로 처리한 결과 농도 의존적으로 자외선에 의한 MMP-2,9의 활성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 5B). 자외선에 의 해 증가된 MMP-2, 9의 활성이 발현의 증가에 의한 것인지를 검증하기 위하여 RT-PCR을 통해 mRNA의 발현을 확인하였다. 시험결과 UVB 조사에 의해 MMP-2의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었으며, FDP 10 mM을 처리한 경우 자외 선에 의한 MMP-2 발현이 억제되는 경향을 나타내었다 (Fig. 6). 그러나 MMP-9의 경우는 자외선에 의한 mRNA 의 발현증가 경향이 나타나지 않았다.
Fig. 5. FDP prevents the UV-induced MMP-2,9 activities in cultured HaCaT keratinocytes. Cells that had been pretreated with FDP (1, 5, 10 mM) were exposed to UVB(30 mJ/cm2). After UVB irradiation, cells were incubated with FDP in fresh culture media without phenol-red and FBS and MMP-2, 9 activities in the media were determined.
Zymografic patterns of MMP-2, 9 secreted into conditioned media of HaCaT keratinocytes after UVB irradiation(A). UVB irradiation significantly increased MMP-2, 9 activites compared with unirradiated control. FDP prevented this alteration(B).
Fig. 6. FDP prevents the UV-induced MMP-2 expression in cultured HaCaT keratinocytes. Cells that had been pretreated with FDP (10 mM) were exposed to UVB (30 mJ/cm2). After UVB irradiation, cells were incubated with FDP in fresh culture media for indicated time until 8 h and mRNA levels of MMP-2 was determined by RT-PCR. The graph was depicted with arbitrary unit of MMP-2 mRNA/GAPDH ratio.
5. UVB 조사에 의한 세포 항산화 시스템변화에 미치는 영향
Fig. 7. FDP preserves the cellular antioxidant capacity. Effects of FDP on the antioxidant capacity of HaCaT keratinocytes with (A) or without (B) exposures to UVB were examined.
HaCaT keratinocytes that had been exposed to UV irradiation (30 mJ/cm2) were incubated with FDP (10 mM) in fresh culture media containing 10% FBS for 24 h. Cells were harvested by scraping and antioxidative parameters were measured. The results are expressed as mean ± S.E. of four different experiments. * p<0.05
Fig. 8. DPPH radical-scavenging activity of the FDP. The reaction mixture contained 0.1 ml of 1 mM DPPH radical solution, 0.8 ml of 99% ethanol, and 0.1 ml of test compounds The solution was rapidly mixed and scavenging capacity was measured spectrophoto- metrically by monitoring the decrease in absorbance at 515 nm.
B. UVA에에에 의한에 의한의한의한 Fibroblast 손상손상손상손상 보호효과보호효과보호효과 보호효과
FDP 1, 5 mM을 처리한 경우에는 UVA에 의한 MMP-1의 발현이 억제되는 것을 확 인할 수 있었다. 항산화제로 알려진 NAC 5 mM을 처리한 경우에도 같은 경향을 나타내었다 (Fig. 9).
3. UVA에 의한 GSH 감소에 미치는 영향
Fibroblast에 UVA 15 J/cm2로 조사한 후 시간대별로 GSH의 변화를 측정하고, 동시에 FDP를 처리한 후 UVA를 조사하고 GSH의 변화를 측정하였다. 실험결과 fibroblast에 UVA 조사 후 8시간대에 GSH가 현저하게 감소함을 확인 할 수 있었 고, 이러한 현상은 72시간까지 지속되었다. 그러나 UVA와 동시에FDP를 처리한 군의 경우는 UVA를 조사하지 않은 대조군과 유사한 정도로 GSH 양의 변화가 관찰되지 않았다 (Fig. 10).
Fig. 9. FDP prevents the UV-induced MMP-1 expression and procollagen depression in cultured skin fibroblast. Normal human fibroblast that had been exposed to UVA irradiation (15 J/cm2) were incubated with FDP (1, 5 mM) and NAC (5 mM) in fresh culture media containing 10% FBS for 48 h. The media containing MMP-1 and procollagen were subjected to SDS-acrylamide gel electrophoresis, and analyzed by Western blotting using specific antibody. UVA irradiation significantly increased MMP-1 protein and decreased procollagne level compared with unirradiated control. FDP and NAC, a precursor of glutathione, prevented these alteration.
Fig. 10. FDP preserves the GSH in cultured skin fibroblast after UVA irradiation.
Normal human fibroblasts that had been exposed to UVA irradiation (15 J/cm2) were incubated with FDP (1 mM) in fresh culture media. UVA-irradiation decreased total glutathione level compared with unirradiated control. The results are expressed as mean ± S.E. of three different experiments. * p<0.05
C. 자외선에자외선에자외선에 의해자외선에 의해의해의해 유도되는유도되는유도되는유도되는 세포내세포내세포내세포내 신호전달계에신호전달계에신호전달계에신호전달계에 미치는미치는미치는미치는 영향영향영향영향