Development of a multi channel measurement system for the cellular respiration measurement

(1)

세포 호흡량 측정용 다채널 측정 시스템 개발

남현욱·박정일·김영미*·박정호^†

Development of a multi channel measurement system for the cellular respiration measurement

Hyunwook Nam, Jungil Park, Youngmi Kim Pak

^*

, and James Jungho Pak

^†

Abstract

This paper describes a multi channel measurement system which can measure the cellular respiration level in a solution containing cells by using a Clark-type sensor with the solution temperature control unit. The Clark-type sensor can measure the cellular respiration level in the solution because it can measure the reduction current depending on the dissolved oxygen level in the solution. This measurement system was maintained the temperature within ±0.1^oC of the setting temperature value by on/off control method in order to measure the precise cellular respiration level. The measurement system showed that the applied voltage to the working electrode was very stable(−0.8 V±0.0071 V) by using proportional control method.

From the current measurement, the response time and the linearity correlation coefficient were 25 sec and 0.94, respectively, which are very close to the results of the commercial product. Using this system and the fabricated Clark- type sensor, the average ratio of the uncoupled OCR(oxygen consumption rate) to the coupled OCR was 1.35 and this is almost the same as that obtained from a commercial systems.

Key Words :oxygen consumption rate, cellular respiration level, amperometry, Clark-type sensor.

1. 서 론

최근에세포의호흡량측정을통한미토콘드리아의 대사증후군발병원인에대한연구가활발히진행되 고있다^[1]. ^세포내의^산소량이^{저하되거나}, ^{미토콘드리}

아의기능이감소되어전자전달계나산화적인산화과 정이작동하지못하면세포의산소소모량이감소하게 된다. ^결국^화합물에^저장되어^있는^대부분의^에너지

가사용될수없게될뿐아니라, 산소가전자를더많 이받아서활성산소종(reactive oxygen species)과같은 유해물질을만들어세포에 damage^를^주기도^한다. ^에

너지를 ATP 형태로전환시켜주지못하면근육수축,

신경세포간의신경전달물질교환, 복제중 DNA 이중 나선을풀어주는과정, ^세포^분열^중^염색체의^이동

등과같이생물체내에서의일상적대사활동을할수 없게된다. 또한정확한발병기전이아직설명되고있 지는않으나, ^{미토콘드리아의}^기능^저하는^{미토콘드리}

아근병증, 비만증, 뇌졸중, 고중성지방혈증, 동맥경화,

당뇨병, 비만, 대사증후군, 퇴행성신경질환, 암등다

양한질병의근본발생원인으로생각되고있다^[2,3].^세

포의 산소 소모량과 개체의 에너지 소모량(energy

expenditure)은모두미토콘드리아활성의중요한지표

로생각된다. ^따라서^{미토콘드리아의}^기능의^정확한

측정은이들질병의진단및예방/치료물질의개발을 위한중요한이슈중하나가되었다. 미토콘드리아의 기능은미토콘드리아의전자전달계내산소가소모되 는양을측정할수밖에없고, 이때미토콘드리아에서 소모하는산소량을정확하게측정하는것이대사증후 군의진단및치료제개발에중요한역할을한다. 이 렇게미토콘드리아가소모하는산소의양을정밀하고 정확하게측정하기위해전기화학적산소센서의개발

고려대학교전기전자전파공학과(School of Electrical Engineering, Korea University, Seoul, Korea)

*경희대학교의과대학생리학교실, 나노의약생명과학과(Department of Physiology, College of Medicine, Department of Nanopharmaceutical and Life Sciences, Kyung Hee University, Seoul, Korea)

†Corresponding author : [email protected]

‡Co-coressponding author: [email protected]

(Received : November 24, 2009, Revised : January 4, 6, 2010 Accepted : January 13, 2010)

(2)

이 요구되고 있다. 782 Oxygen Meter(strathkelvin instruments, Scotland)^와 Oxygraph-2k(oroboros instru-

ments, Austria)등이미상용화된제품들이있음에도

불구하고상용화제품들의높은가격, 다수의샘플을 동시에측정할수없는이유그리고주기적으로고가 의센서를교체해야하는단점들때문에다기능, 소형 의산소센서개발이요구된다. 용존산소센서는전기 화학적측정방법을사용하기때문에전기화학적측정 장치가반드시필요하다^[4]. 전기화학적측정장치또한 상용화된제품들이많지만고가이고여러샘플을동시 에측정할수없는단일채널형태가대부분이고다중 채널측정이가능하다고하더라도기준전극과상대전 극을공통으로사용하기때문에각센서들의측정결 과에영향을미칠수있다. 이와같은단점들을보완 하여기존의상용화제품들과비교하여저렴한비용으 로유사한측정능력을가지면서최대 6^개까지^샘플을

동시에측정할수있는다중채널형태이면서세포의 활성을유지할수있는온도제어능력과세포의호흡 량을측정할수있는시스템을구성하였다.

세포의호흡량측정을위한다채널측정시스템은

NI(national instrument, USA)^측정^장비들과^호환성^및

확장성이용이하여여러분야에사용되고있는 Lab-

VIEW 프로그램^[5]으로구성하였다. 또한용존산소량

을측정할수있는전기화학적측정법인 amperometry

와세포의활성을유지시키기위해히터와온도컨트 롤러를사용하였다. 개발된시스템을이용하여전압인 가및전압의변화측정, ^용존^산소^농도에^따른^전류

측정및이에대한평가와분석을수행하였다. 또한개

발된측정시스템과상용화제품인 Oxygraph-2k를이

용하여동일한조건에서의세포호흡량을측정한뒤 비교분석하여개발된시스템의성능을검증하였다.

2. 본 론

2.1. 용존 산소센서 측정 시스템의 원리

용존산소센서측정시스템은 amperometry 측정방

법을기반으로하여최대여섯개의 Clark-type 센서의

환원전류를동시에측정하는것이다. Amperometry ^측

정방법은전해질내에있는작업전극과상대전극사 이에일정한전위를인가하여작업전극과상대전극 사이에발생된전류를측정하는것이며작업전극에 인가되는전위는작업전극과기준전극사이에서측 정된것이다. Fig. 1은 amperometry 측정방법을이용 한 Clark-type ^센서의^측정^{메커니즘을}^보여준다. ^작업

전극에일정한전위가인가된상태에서측정용액내

에용존산소가센서의멤브레인을거쳐센서의전해 질로이동하면, 이때작업전극에인가되는일정한음 전위에의해작업전극표면에서용존산소는식 (1)과 같이반응한다^[6]. 이화학반응에의한전자의흐름이 전류를발생시키고발생한전류를측정함으로써용존 산소량또는용액내에존재하는세포의산소호흡량 을측정할수있다.

작업전극: O2 + 2H2O + 4e⁻→4OH^-

상대전극: 4OH⁻→O2 + 2H2O + 4e⁻ (1)

2.2. 용존 산소센서 측정 시스템의 구성

용존산소센서측정시스템은 Fig. 2^와^같이 Clark-

type 센서에구동전압을인가하여용존산소량변화에

따른전류변화를측정하는 amperometry 측정부와정 확한세포의산소호흡량측정을위해항온을유지시 키는온도제어부그리고측정시스템을전체적으로 Fig. 1.A schematic drawing of Clark-type oxygen sensor

operating principle.

Fig. 2.A block diagram of a multi channel measurement system.

(3)

제어하는컨트롤부로구성된다. Amperometry 측정부 는전압인가및전압측정부분과전류를측정하는부 분으로나뉜다. ^전압^인가^및^전압^측정^부분은^작업

전극과상대전극사이에일정한구동전압을인가하고

제어하기위해전압인가모듈(NI 9263)과전압측정모

듈(NI 9215)^로^구성된다. ^전류를^측정하는^부분은^전

류측정모듈(NI PXI-4071)과다채널전류측정을위한

멀티플렉서(NI PXI 2503) 그리고주변노이즈에의한

영향을줄이기위한필터(PXI-4022)^를^이용하여^구성

하였고컨트롤부와연결되어컴퓨터로제어된다.

온도제어부는온도변화가세포의산소호흡량측정 에미치는영향을최대한줄이고항온을유지하기위

해 Fig. 3과같이제작하였다. 온도제어부는펠티어

히터(peltier heater), ^쿨러(cooler), ^디지털 ^계전기(NI 9474)모듈, 온도측정모듈(NI 9217)로구성되어있으 며컨트롤부와연결하였다. 항온상태의유지는릴레이 신호를 이용하여히터와쿨러의 설정온도에따른

ON/OFF 제어를통해수행된다.

컨트롤부는 PC와 LabVIEW 구동프로그램으로구

성되어있으며, amperometry ^측정부와^온도^제어부를

제어하고측정데이터를모니터에보여주는동시에데 이터를파일로저장하고분석하는툴을제공한다. 컨트

롤부의 LabVIEW ^구동^{프로그램은}^각각의^센서에^구

동전압을일정하게유지하고인가된전압을측정하며,

8개센서의전류측정과온도측정및제어를한다. 구

동프로그램의알고리즘은 Fig. 4와같이릴레이신호

를이용한 ON/OFF 제어를통해설정온도로항온을

유지한후, ^센서에^인가된^안정된^전위가^인가되면^전

류측정을시작한다. 측정된온도와전압및전류는컴 퓨터화면에수치와그래프로동시에나타나고측정 종료버튼을누르면측정된데이터는스프레드시트형 식의파일로저장된다.

2.3. 측정 시스템의 특성 평가 2.3.1. 전압 인가/측정

Amperometry에서작업전극과상대전극사이에일

정한구동전압을인가하기위해 proportional ^제어^방

법을사용하였다. Proportional 제어는기준전압값에 대한현재전압값의차이에적당한 P-gain(proportional

gain)^을^곱하여^원하는^전압값을^만드는^방법이다^[7].

Amperometry의 proportional 제어루프(loop)문구현은 식 (2)와같다.

2nd 루프문에서의인가전압

= 1st 루프문에서의인가전압

+ {P-gain * (기준전압 − 측정전압)} (2)

Proportional 제어는 P-gain 값에따라구동전압이안 정된상태에이르는시간과안정된상태에이른후측 정값의진폭을결정한다^[8]. 전압인가/측정특성평가 실험에서안정된상태는측정전압이인가전압과비교

하여±0.01 V 차이로 5초이상지속된경우로정의하

였다. P-gain 값이클수록구동전압이빨리안정된상

태에이르지만, ^안정된^{상태에서의}^전압^진폭이^크다.

반대로 P-gain 값이작으면안정된상태에이르는시간

은느리지만, 안정된상태에서의전압진폭이작아비 교적안정적이다. P-gain 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 0.9 ^값에^따

라구동전압이안정된상태에이르는시간과안정된 상태에이른후의구동전압변화를측정하였고안정된 상태에이른후의구동전압의표준편차를구하였다. P-

gain의크기에따라전압이안정된상태까지걸리는시

Fig. 3.A schematic picture of the constant temperature control module.

Fig. 4.Algorithm of a multi channel measurement system operation.

(4)

간을 Fig. 5^의^①~^⑤로^{나타내었다}. Table 1^에서^보이

듯이, P-gain 값이 0.1에서 0.2 간격으로 0.9까지변할 때, 구동전압이안정된상태에서표준편차는±0.0071

에서±0.0115로증가하였고. 정상상태에도달하는시

간은 14초에서 3.5초로감소하였다.

2.3.2. 온도 제어

센서의전류측정동안의온도변화를측정하기위 해상용온도센서인 PT100^을^{사용하였다}^[9]. ^온도측정

프로그램은측정시스템의전과정에서전류측정과무 관하게실시간으로측정이가능해야하기때문에, 독립 루프문으로프로그램을구성하였다. Clark-type ^센서의

온도를측정한후측정온도의결과를설정온도와비 교하여그결과에따라쿨러와히터를상호배제적으 로구동시킨다. ^{측정온도와}^{설정온도를}^{일치시키기}^위

해쿨러와히터가 1회작동한후에다시 Clark-type 센

서의온도측정과정을반복한다^[10,11]. 구성한온도제어

프로그램을이용하여인간의 몸의정상온도인 약

37^oC를유지하도록설정하고온도를측정하였다. 온도 제어시작후, 약 500초후부터±0.1^oC이내로온도가 유지되는것을 Fig. 6에서알수있다.

2.3.3. 전류 측정

제작된측정시스템의성능을평가하기위해동일한

Clark-type 센서를이용하여상용 potentiostat 장비인

EIS300(potentiostat, gamry instrument, USA)^와^제작한

측정시스템장비의응답시간및선형도를비교하였다.

센서의응답시간은산소포화상태(267 µmol/l)인물을

Clark-type ^센서^측정^영역에^넣고, ^물속의^용존^산소를

제거하는 Na2SO3를투여한뒤측정전류의변화로측정 하였다. Na2SO3는물에들어있는용존산소를제거하 기때문에산소센서내용존산소의환원반응이줄어들 어, 작업전극과상대전극을통해흐르는전류가감소 한다^[12]. Na2SO3를투여하여전류가최소로줄어드는

양의 90 %까지걸리는시간을응답시간으로정의하였

고 4회반복하여응답시간을측정하였다^[13]. Fig. 7은

Na2SO3를 4회반복투여하여측정한결과이다. Na2SO3

투입전(산소포화상태) 측정된약 150 nA의전류가

Fig. 5.Voltage vs, time graph depending on the P-gain value.

Table 1. Standard deviation of the measured voltage value and the time to reach steady state with P-gain value

P-gain ^안정된_전압의^상태에서_표준편차^측정(V) ^정상^되는^상태까지^시간(sec)^소요

0.1 ±0.0071 14

0.3 ±0.0073 10

0.5 ^±0.0078 7

0.7 ^±0.0090 4.5

0.9 ^±0.0115 3.5

Fig. 6.The measured sensor temperature vs. time profile by using the temperature control.

Fig. 7.The measured response time of the fabricated Clark-type oxygen sensor by using the multi channel measurement system.

(5)

투입후(^산소^제거상태)^에는 20 nA^로^{감소하였고}, 4^회

측정한결과, 23초에서 29초사이의응답시간을얻었다. Table 2는 potentiostat과산소측정시스템간의응답시 간을보이며, ^두^시스템^모두^평균^{응답시간이}^약 25.5

초로동일함을알수있다.

제작한산소센서측정시스템을이용하여 Na2SO3의 몰농도와측정전류간의상관계수를측정함으로써, ^센

서의선형도(linearity)를평가하였다. 산소센서의산소

농도가포화상태(267 µmol/l)일때산소농도를측정한

후, ^산소센서^내부의^산소를^제거할^수^있는 Na2SO3를

0.001 M에서 0.1 M까지의다양한측정용액을사용하

여몰농도와측정전류간의상관계수를측정하였다^[14].

응답속도의측정결과에따라전류 150 nA^를^산소농

도 100 %, 20 nA를산소농도 0 %라고가정하였다. 측 정한결과는 Fig. 8^과^같이 Na2SO3의몰농도에따라 전류값이 20 nA(산소농도 0 %)에서 133 nA(산소농도

80 %)까지변화를보였다^[15]. Fig 8의측정값을이용하 여몰농도에따른전류값변화에대한상관계수를식

(3)을이용하여구하였다^[16].

(3)

식 (3)^에서 ^와 ^는^각각 X(^몰농도)^와 Y(^측정전류)

의평균값이고 s와 s'는각각의표준편차이다. 제작한

시스템과 potentiostat 장비로측정한결과값을이용한

선형상관계수는각각 0.92와 0.96이고, 약 0.04만큼낮 은값을보였다.

2.4. 상용화 제품과 개발한 용존 산소센서 측정 시스 템의 세포 호흡량 측정 결과 비교

개발한용존산소센서측정시스템을이용한세포

호흡량측정실험을통해상용화제품(Oxygraph-2k)과

동일한측정능력을가지는지실험하였다. 개발한측정 시스템에 Clark-type ^센서^여섯^개를^장착하고^[1]^온도

컨트롤모듈을이용하여온도를 37^oC로유지시킨후,

세포(L6 rat skeletal muscle, 1.5×10⁶cells/200 µl)를상 용화제품과개발한측정시스템에각각동시에주입 하여세포의호흡량을측정하였고이에대한결과를 비교분석하였다. Uncoupled OCR (oxygen consumption rate)^에^대한 coupled OCR^의^비로^세포의^호흡량

을판단하기때문에전자전달계와산화적인산화과정 을거쳐 ATP(adenosine-5'-triphosphate)를형성하는세 포호흡상태인 coupling ^상태에서 FCCP(carbonylcya- nide p-trifluoroume thoxyphenyl hydrazone, uncoupler)

를투여하여전자전달계와산화적인산화과정을방해

받는 uncoupling 상태로만들어세포호흡량변화를

측정하였다^[17]. Fig. 9는여섯 개의 Clark-type 센서가 장착된측정시스템에서세포호흡량의변화를동시에 측정한결과이고, Fig. 10은상용화제품인 Oxygraph- 2k에서측정한세포의호흡량결과그래프이다. Table 3

에나타나있는것과같이개발한측정시스템을이용 하여 얻은 여섯 개의 Clark-type 센서의 uncoupled OCR/coupled OCR의평균은약 1.35이고상용화제품 인 Oxygrph-2k^를^이용하여^얻은 uncoupled OCR/coupled OCR의평균은약 1.45이다. 두시스템의uncoupled OCR/coupled OCR의차이값은약 0.1로차이는약 0.1

로제작한세포호흡량측정용다채널측정시스템은 상용화제품과유사한감도를가지고있는것을이실 험결과를통해확인할수있었다.

3. 결 론

본논문에서는세포호흡량측정용다채널측정시스 r

N1

---- ⁽xr–x^{) y}⁽ ^r–^y⁾

r 1= N

∑

S S⋅ ^s

---

=

x y

Table 2.Comparison of the response time of a potentiostat and that of the fabricated multi channel measurement system

회차

최대산소농도일

때의전류(nA) ^최소^때의^{산소농도일}^전류(nA) ^응답시간(^초) Potentio

stat

산소측정 시스템

Potentio stat

산소측정 시스템

Potentio stat

산소측정

1 151 148 33.8 33.0 28 시스템29

2 144 140 21.7 21.3 27 27

3 139 138 22.0 21.0 25 23

4 138 135 21.7 16.0 22 23 _{Fig. 8.}Linearity vs. oxygen concentration comparison between a potentiostat and the multi channel measurement system.

(6)

템 개발 및 그 특성을 평가하였다. 개발한 측정 시스템 은 정확한 세포의 산소 호흡량 측정을 위해 항온을 유지 하며 Clark-type 센서에 −0.8 V 전압을 일정하게 인가하

고 용존 산소의 환원 전류를 측정할 수 있도록 구성하였 다. Clark-type 센서의 구동전압은 proportional 제어 방법 을 이용하여 오차범위 ±0.01 V 이내로 인가될 수 있도록 프로그래밍하였고, 온도는 설정 온도와 비교하여

±0.1^oC 이내로 온도가 유지될 수 있도록 프로그래밍하 였다. 또한, 개발한 측정 시스템을 이용하여 응답속도와 선형 상관계수를 측정한 결과, 응답시간은 25.5초, 선형 상관계수는 0.92를 얻었고, 상용 potentiostat으로 측정한 결과와 유사함을 확인하였다. 또한, 개발한 측정 시스템 과 상용화 제품에서 얻은 세포의 산소 호흡량의 uncoupled OCR에서 coupled OCR을 나눈 값의 차이가 약 0.1 일 정도로 상용화 제품만큼의 뛰어난 측정능력을 가지 고 있다는 것을 확인하였다. 현재 나와있는 상용화 제품 들이 최대 2개의 센서에서 세포의 호흡량을 측정할 수 있지만 개발한 측정 시스템은 최대 여섯 개의 채널에서 세포의 호흡량을 동시에 정확하게 측정 할 수 있기 때문 에 측정의 효율성 또한 높일 수 있다. 향후에 콜레스테 롤 센서, 글루코스 센서 등 다양한 전기화학 센서 측정 시스템에 응용 가능할 것으로 예상된다.

감사의 글

이 논문은 한국과학재단 특정기초연구(R01-2006- 000-11371-0)와 2009년도 정부(교육과학기술부)의 재 원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임 (No. K20601000002-09E0100-00200).

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Fig. 9.The cellular respiration level measurement results of six Clark-type sensors by using the multi channel measurement system.

Fig. 10.The measurement result of cellular respiration level by using Oxygraph-2K.

Table 3.Current variation between a a coupled OCR and a uncoupled OCR

Sensor # CoupledOCR Uncoupled

OCR Uncoupled OCR /coupled OCR

1 0.07353 0.10652 1.44866

2 0.04183 0.0382 0.91322

3 0.07352 0.09479 1.28931

4 0.0545 0.092458 1.69648

5 0.09113 0.10536 1.15615

6 0.07347 0.11715 1.59452

Average 0.067997 0.092413 1.349725

(7)

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