생물방제균 Pseudomonas fluorescens 2112의 고추 근권정착능과 Quorum-sensing 기능
정병권, 김요환, 김상달*
영남대학교미생물생명공학과
Received : October 17, 2012 / Revised : November 8, 2012 / Accepted : November 15, 2012
서 론
세균들은 quorum-sensing (QS)이라불리는세포-세포간 의의사소통체계를사용하여세포밀도를조절하는기능을 가진다. Pseudomonas spp. 등과같은그람음성세균의경우 acyl-homoserine lactones (AHLs)라는 autoinducer (AI)의 생산및조절에의해 quorum-sensing이이루어지며일반적 으로자연환경에서생물막과같이단단한표면을형성하거 나식물뿌리에 colonization 되거나[7], 유전자발현을조절 하여항생물질생산, 운동성, 병독성, 생물발광등에필수적 인기작으로알려져있다[5, 16, 23]. 최근에는병원에입원 한환자들에게균혈증(bacteremia)을일으키는기회감염균 인 Pseudomonas aeruginosa의 quorum sensing에 대한
연구가 활발히 진행되고 있으며[20], 유선염을 일으키는
Streptococcus agalactiae와간에종양을발생시키는 Fuso- bacterium necrophorum, 상처에감염되는 Staphylococcus
aureus 등다양한병원성세균들이인체에감염됨에있어생
물막형성이밀접하게연관되어있음이보고되고있다[3, 17].
또한감염균들이인체내에서생물막을형성하면서생장함 으로인해항생제를이용한치료가어려운경우가자주발 생하고있다[3].
그러나생물막형성은병원성세균뿐만아니라근권에서군
집을만드는이로운세균에의해서도이루어진다[15]. 근권
(Rhizosphere)은식물의뿌리주위에둘러싸여있는환경을일
컫는용어로써작물의건강성이나생산성에매우중요한영 향을미친다[19]. 근권에는뿌리와공생하는근권세균(Plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)이나 균근균
(Mycorrhizae)과같은다양한토양미생물들이서식하고있
으며군집을구성하고있는데, 이들중에서식물생장촉진근
권세균(PGPR)은대기중의질소고정, 식물생장홀몬의생산,
효소활성을 통해 식물의 생장을 촉진시키며 항생물질,
siderophore와같은항진균물질을생산하여질병으로부터
Root Colonization and Quorum Sensing of the Antagonistic Bacterium Pseudomonas fluorescens 2112 involved in the Red-pepper Rhizosphere. Jung, Byung-Kwon, Yo-Hwan Kim, and Sang-Dal Kim*. Department of Applied Microbiology and Biotechnology, School of Biotechnology, Yeungnam University, Gyeongsan 712-749, Korea
Biofilm formation of multifunctional plant growth promoting rhizobacterium (PGPR), Pseudomonas fluorescens 2112 is neces- sary for P. fluorescens 2112 to have a positive impact on the rhizosphere of red-pepper. This study investigated whether signal molecules of the quorum sensing AHLs are produced in order to confirm biofilm formative ability. Through the use of Petri dish bioassays a blue circle formed evidence of AHLs. It was confirmed that P. fluorescens 2112 produced six-carbon-chain-long AHLs by TLC bioassay. The bacterial density of P. fluorescens 2112 on the top and bottom of pepper plant roots was estimated as 3× 105 and 8× 103 CFU/g root, respectively. P. fluorescens 2112 exist more with high-density of 3.5 × 106 CFU/g soil at a depth of 1 cm but at a low-density of 1.1× 10 CFU/g soil at a depth of 5 cm, from the surface of rhizosphere soil. In addition, biofilm formation of P. fluorescens 2112 on the epidermises and the tips of the red-pepper roots were confirmed visually by SEM. Thus, the production of AHLs by P. fluorescens 2112 brings about quorum sensing signaling and the formation of biofilm on the roots which has a positive effect on economically important crops such as red-pepper by additionally producing a variety of antifungal substances and auxin.
Keywords: Quorum sensing, biofilm, PGPR, biological control, P. fluorescens 2112
*Corresponding author
Tel: +82-53-810-3053, Fax: +82-53-810-4663 E-mail: [email protected]
식물을보호하는다양한기능을가진다[6]. 그리고 PGPR은 quorum-sensing의 autoinducer인 AHLs을생산하여자신 의밀도를조절함과동시에식물과상호작용을가지는데, 작 물의뿌리근처의공간을차지하기위한근권착생능으로인
해생물막을 형성한다[13]. 즉, PGPR은 식물의 근권에서
quorum sensing 기작을 이용하여 식물의 뿌리에 군집
(colonization)을형성하여상호작용함으로써식물의면역성
이나생장촉진에직접적으로관여할가능성이높다. 본연구는이등[9]에의해이미선발된항진균항생물질 인 2,4-diacetylphloroglucinol (2,4-DAPG)[8, 10]과 항진 균물질인 siderophore (pyoverdin2112) [11] 및식물생장촉 진호르몬인 auxin [12] 등을생산하는 다기능 PGPR균주 Pseudomonas fluorescens 2112을 대상균주로 quorum- sensing과 colonization에대한연구를수행하였다. 각종항 균기작과식물성장촉진능이발휘됨과동시에근권정착도작 물의미생물제제시용의성공여부에무엇보다중요하므로근 권정착능에주요영향을미치는 quorum sensing에의해생 산되는 autoinducer인 AHLs의생산을확인하고, 근권정착 능검증시험및주사전자현미경을사용하여고추의뿌리에 서의실제생물막형성능을알아보고자하였다.
재료 및 방법
사용균주 및 균주의 배양
본 연구에서 사용된 균주는 Table 1과 같이 quorum
sensing을통한생물막형성의확인을위해서항진균항생물
질인 2,4-DAPG와식물병원성진균의생육을억제하는물질
인 siderophore를 생산하는 다기능 PGPR 균주인 P.
fluorescens 2112를사용하였으며[8-12], 이균주의 AHLs 생 산확인을위해창원대학교이경교수연구팀으로부터분양 받은 Agrobacterium tumefaciens NT1 (pDCI41E33) 균주 를 bioreporter 지시균주로써사용하였다[14]. P. fluorescens 2112 균주의 배양은 Luria-Bertani (LB) broth (Difco Co.
Detroit, MI) 배지를사용하여 30oC에서 180 rpm으로 10시 간동안 배양하였으며, A. tumefaciens NT1(pDCI41E33) 균 주는 0.2% mannitol이포함된 ABM (autoinducer bioassay minimal) agar (5% phosphate buffer 용액, 5% trace element 용액) 배지에 cabenicillin (50µg/ml)을 첨가하여
30oC에서 180 rpm으로 24시간동안배양하였다. 또한대조 구로는 Escherichia coli ATCC 28922를사용하였으며 28oC 에서 160 rpm으로 12시간동안배양하였다.
Autoinducer petri dish bioassay
P. fluorescens 2112 균주의 autoinducer 생산유무를확인 하기위하여배양상등액을시료로사용하여 petri dish에서 bioassay [14]를실시하였다. 먼저대수증식기와정지기초반 의배양액 500 ml를원심분리(959×g, 20 min)하여상등액 을취한다음 1 L의 ethyl acetate와 100µl의 acetic acid를 첨가하여교반후상층액을획득하였다. 동일한방법으로 ethyl acetate와 acetic acid를 첨가하여총약 2 L의 ethyl aceta 층을회수한다음감압농축기(Rotary vacuum evapo- rator N-N series, EYELA, Japan)를 이용하여 37oC에서 ethyl acetate를증발시킨다음 1 ml의 methanol을첨가하 여최종적으로 500배농축하였으며, bioassay를위한시료 로 사용하였다. Petri dish assay의 경우 농축한 시료를 paper disc (8 mm, Toyo Roshi Kaisha Ltd, Japan)에접종 한후실온에서완전하게건조시켜 mannitol (0.2%), X-gal (60µg/ml), agar (0.8%), A. tumefaciens NT1 (pDCI41E33) 균주배양액으로구성된 soft agar에옮긴다음 30oC에서 24시간동안배양하였으며, autoinducer와반응하여분비 된β-galactosidase의활성에의해 X-gal이분해되어나타 나는 푸른색 환의 지름을 측정하였다. 기질로는 N-(3- oxododecanoyl)-L-homoserine lactone (OdDHL, Sigma- Aldrich Chemical, st Louis, MO, USA)를사용하였다.
Thin layer chromatography (TLC) bioassay TLC assay에서도 petri dish bioassay와동일한 시료를 사용하였으며, TLC silica gel 60 RP-18 F254s plate (0.2 mm thickness, Merck, Germany)에 1µl씩총5회점적 한뒤실온에서건조시킨후밀폐된용기안에서 methanol : water (6:4, v/v)를용매로하여전개시켰다. 전개된 plate는 건조시킨후 petri dish assay와 동일하게 A. tumefaciens NT1의배양액이포함된 soft agar를 plate 위로분주한다음 30oC에서 24시간동안배양하였으며, 배양후 TLC plate에 나타는 spot의위치를비교하여 autoinducer를확인하였다. 기질로는 N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone (OdDHL,
Table 1. List of strains used.
Strains Descriptions Purposes Refernces
A. tumefaciens NT1 traG::lacZ fusion (pDCI41E33) AHLs biosensor Lee et al. [14]
P. fluorescens 2112 Antibiosis, PGPR Confirmation of quorum sensing and col- onization
Lee et al. [9]
E. coli ATCC 28922 AHLs non-producer Negative control for bioassay This study
Sigma, USA)과 N-hexaonyl-DL-homoserine lactone (HHL, Fluka, Tokyo, Japan)를사용하였다.
Double Layered Filter Paper 법을 이용한 고추근권정 착능 조사
PGPR인 P. fluorescens 2112 균주의근권에서의정착능을 조사하기위해 double layered filter paper (DLF) 법[1]을 실시하였다. 먼저살균된 petri dish에 filter paper (90 mm, Whatman Co., No. 2, UK)를올린뒤증류수 4 ml를첨가한 다음 P. fluorescens 2112 균주의배양액(108 CFU/ml)에한 시간동안침지시킨중앙종묘사의청양품종고추(Capsicum annuum L.) 종자를위치시켰으며, 종자위에 filter paper를 덮은뒤 parafilm으로감아서 28oC의암조건에서 72시간동 안배양하였다. 배양한후뿌리의시작점에서끝부분까지 1 cm 간격으로절단하여분쇄한후멸균된 0.1 M MgSO4용 액에단계희석하여도말한후형성된 colony 수로뿌리의부 위별로정착한균주의밀도를 3반복측정하였다.
Ahmad와 Baker's method를 이용한 고추근권정착능 조사 근권정착능을조사하는다른방법인 Ahmad와 Baker’s (A
& B) 법[1]을이용하여근권주위의토양에서존재하는 P.
fluorescens 2112 균주의밀도를조사하였다. Polypropylene 재질의원심분리관(28.6×103.6 mm)을세로로반을절단한 후 멸균된 상토를 채운 다음, 하나의 원심분리관에 P.
fluorescens 2112 균주의배양액에 1시간동안침지된고추종 자를심었다. 그리고나머지하나의원심분리관을조심스럽 게종자를심었던관에부착한후고무줄을이용하여고정
을시킨다음플라스틱포트에옮겨심었으며, 8일간 5,000
lux 광도에서 30oC, 습도 40%, 12시간일장인항온항습실에 서배양하였다. 배양후플라스틱포트로부터원심분리관을 제거한다음종자를심지않았던관을분리하여지면을기 준으로하여뿌리의상, 중, 하부 1 cm 간격으로절단하였다. 그리고절단된뿌리단편에부착되어있는 토양을멸균된 0.1 M MgSO4용액에단계희석하여도말한후 colony 수를 3반복측정하였다.
주사형전자현미경(SEM)을 이용한 생물막형성조사 P. fluorescens 2112 균주배양액에한시간동안침지시켜 발아시킨고추종자를플라스틱포트에옮겨심은후대수증 식기까지배양시킨균주를처리(108 CFU/g soil)하였으며, 10 일후 뿌리를 절단하였다. 절단된 뿌리는 혼합고정액(2%
glutaraldehyde, 2% formaldehyde)으로 4oC에서 3시간 동 안전고정한후, 0.2 M phosphate buffer (pH 7.0)에서세척 한다음 2% OsO4로후고정하였다. 고정된시료는 50~100%
의 ethanol로단계적으로각각 20분간탈수시킨뒤 isoamyl
acetate로 20분간 3회 침지시켰으며 Critical point dryer (HCP-2, Hitachi, Japan)로임계점에서건조시켰다. 건조된 시료는 Pt-coating하여주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, FE-SEM/EDS, S-4100, Hitachi, Japan)으로 관찰하였다.
결과 및 고찰
Petri dish bioassay를 이용한 AHLs 생산의 확인 A. tumefaciens NT1 (pDCI41E33) 균주는 lacZ 유전자를 보유하고있으며, 그람음성세균에의해생산되는 AHLs에 의해 lacZ 유전자가발현되어β-galactosidase를생산함으로 써 AHLs의생산유무를판별하는 biosensor 균주로사용되 고 있다. 본 연구에서는 biosensor 균주를 사용하여 petri dish bioassay를통해 PGPR인 P. fluorescens 2112 균주의 quorum sensing 신호분자인 AHLs의시간대별생산유무와 생산량을확인하였다. 그결과, 배양초기부터 5시간까지의
배양액을접종한 paper disc에서푸른색환이나타나는것
이확인됨으로써 AHLs의생산유무을확인할수있었다(Fig.
1). 또한 AHLs의생산량을간접적으로알수있는푸른색환 의지름을측정하였을때 5시간을배양한배양상등액에서지
름이 25 mm로가장넓은환의크기를가지는것으로확인
되었으며, 배양시간과비례하여배양초기부터꾸준히증가 하는확인하였다(Fig. 2). 그러나 P. fluorescens 2112 균주를 6시간이상배양한상등액을접종하였을경우 biosensor 균 주의생육이억제된것으로보이는투명환이형성되어푸른 색환을확인할수없었다. Brelles-Mariño 등[2]에의하면
Fig. 1. Petri dish bioassay of AHLs produced by P. fluore- scens 2112 with A. tumefaciens NT1(pDCI41E33).
50µl of 500-fold supernatant concentrates was loaded on paper disc. P, 10µM N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone; N, E.
coli ATCC 28922; A, 1 h incubation; B, 3 h incubation; C, 5 h incubation.
Pseudomonas fluorescens 종들이 quorum sensing 신호분
자를생산함과동시에 phenazine이라는항생물질을생산한
다고보고되어있다. 때문에 P. fluorescens 2112의생장곡선 중정체기에생성되는 2차대사산물인항생물질의생산으로 인하여 A. tumefaciens NT1 (pDCI41E33)의생육이억제되 었을것이라사료된다.
TLC bioassay에 의한 AHLs 생산의 확인
TLC bioassay는균주로부터 AHLs의생산확인이가능할
뿐만아니라구조가밝혀진 AHLs을표준물질로점적하여
비교함으로써 acyl기의탄소길이를간단히확인할수있다 는장점이 있다. Ethyl acetate를 사용하여 P. fluorescens 2112의배양상등액을농축한후메탄올과물의 6:4 혼합용 액을전개용매로하여역상 TLC에서전개를실시하였다. 전 개시킨 TLC 위에 bioreporter 균주를도포하여배양한결 과, Rf값이 0.6인위치에서푸른색 spot을확인하여 AHLs 의존재를확인할수있었다(Fig. 3). 또한 N-hexaonyl-DL- homoserine lactone (HHL, Fluka, USA)과동일한위치에 전개된것으로보아탄소가 6개인 AHLs인것으로생각된다. Double Layered Filter Paper 법을 이용한 고추근권정 착능 조사
다기능 PGPR 균주인 P. fluorescens 2112의근권정착능을 DLF법을이용하여조사한결과, 고추종자로부터발아된뿌 리와줄기의경계지점인하배축을기준으로하여 1 cm 씩절
단한부위의 CFU 값을비교하였을경우뿌리말단에서는
8×103 CFU/g root로측정되었으며, 이에비해가까운상단 에서는 3×105 CFU/g root로약 100배정도높게측정되었 Fig. 2. Time course for the production of AHLs by P. fluo- rescens 2112.
P. fluorescens 2112 was grown in LB broth at 30oC and the measurement of blue zone diameter was assayed by petri dish bioassay with A. tumefaciens NT1(pDCI41E33). ○: Cell growth;
●: Blue zone diameter.
Fig. 3. TLC bioassay of AHLs produced by P. fluorescens 2112 with A. tumefaciens NT1 (pDCI41E33).
S, authentic AHLs molecules; P, P. fluorescens 2112; C6, N-hex- aonyl-DL-homoserine lactone; C12, N-(3-oxododecanoyl)-L- homoserine lactone.
Fig. 4. Population density of P. fluorescens 2112 from root segment of red-pepper.
The population of P. fluorescens 2112 was determined by dilu- tion plate method on Pseudomonas isolation agar medium.
Fig. 5. The plant growth promotion by P. fluorescens 2112 on the seed germination of red-pepper.
A, only water treated; B-E, P. fluorescens 2112 treated; B, 102 CFU/ml; C, 104 CFU/ml; D, 106 CFU/ml; E, 108 CFU/ml.
다(Fig. 4). 또한종자를균주의배양액에침지시킬때균주 의밀도가높을수록뿌리의생장을촉진시킨다는것을확인 할수있었다(Fig. 5, 6). Whipps[22]에의하면미생물제제의 중요한특징중하나가종자에군집을형성(colonization)하 여토양유래의병원균을방제한다고알려져있다. 결국작물 의모종을정식한후미생물제제를처리하기전에종자를 균배양액에침지후발아시키는과정을거친다면뿌리에 quorum sensing에의한군집을이룬 PGPR 균주와의상호 작용으로인하여생장촉진및전신획득저항성(SAR), 유도 전신저항성(ISR)과같은방어기작이조기에유도되어식물
의건강성에유익한영향을미칠것이라생각된다[4, 21].
Ahmad와 Baker 법을 이용한 고추근권정착능 조사 P. fluorescens 2112 균주의근권토양에서의정착능을알 아보기위해배양액에서침지시킨고추종자를이용하여포
트상에서조사한결과, 표면으로부터 1 cm 깊이의근권토 양에서 3.5×106 CFU/g soil의높은밀도로존재하고있었 으나깊이가먼 5 cm 지점인근권토양에서는 1.1×10 CFU/g soil의낮은밀도로존재하는것을확인할수있었다(Fig. 7).
이것은 Pseudomonas 종의경우절대호기성으로알려져있
으며[18], 토양의표면에비해주근의말단부위에가까울수
록산소가부족한환경이기때문에깊이가깊어질수록균주 의밀도가감소하는추세를보이는것으로생각되어진다. 주사전자현미경(SEM)을 이용한 생물막 형성의 관찰
식물생장촉진근권세균인 P. fluorescens 2112 균주배양액 에침지시킨고추종자를플라스틱포트에심은다음 10일후 뿌리를회수하여주사전자현미경을사용하여관찰한결과, 뿌리의표피(Fig. 8A) 및말단(Fig. 8B)에서생물막과유사 Fig. 6. The plant growth promotion by P. fluorescens 2112
on the roots development of red-pepper.
Roots length was measured after incubating for 72 h at 28oC.
Fig. 7. Population density of P. fluorescens 2112 from rhizosphere soil of red-pepper.
The population of P. fluorescens 2112 was determined by dilu- tion plate method on Pseudomonas isolation agar medium.
*Rhizosphere soil.
Fig. 8. Scanning electron microscope micrographs of red-pepper roots colonized by P. fluorescens 2112 biofilm.
Micrographs were taken at the rood tip-distal (A) and tip region (B).
한형태를이루고있음을확인할수있었다. 이러한결과는 식물뿌리의생장점을둘러싸고있는말단부위에생물막형 태의군집을형성함으로써식물생장촉진호르몬인 auxin을 공급할수있다는것이밝혀졌다는점에서[12] 뿌리의생장 을더욱촉진할수있으며, 이미보고된항진균물질의생산
능으로인해[10, 11] 뿌리에질병을발생시키는병원성진균
으로부터뿌리를보호하는역할을할수있을것이다. 이는 임등[12]에의해보고된 P. fluorescens 2112 균주가식물병 원성진균인 Phytophthora capsici에의해발생되는고추역 병을억제하는기능을가지며고추의생장을촉진시킨다는 결과를뒷받침할수있을것이다.
요 약
다기능 식물생장촉진근권세균(PGPR)인 P. fluorescens
2112 균주가고추의생물방제와성장촉진에긍정적인영향
을주기위해서는생물막을형성하여근권에정착하는 coloni-
zation이필수조건이다. 따라서근권정착능에주요한생물막
형성에필요한 quorum sensing의신호분자인 AHLs의생산 유무를조사한결과, petri dish bioassay에서 AHLs를생산 하여푸른색환을형성하는것을확인할수있었으며아울러 P. fluorescens 2112 균주의생장곡선에서대수증식기중반
에서정체기초반에가장많은 AHLs를생산함을확인하였
다. 또한탄소길이가 6개인 AHLs를생산한다는사실을 TLC bioassay를통해확인하였다. 그리고고추의뿌리및근권토 양에서의정착밀도를 Double layer filter paper와 Ahmad와 Baker 법으로분석하여확인하였다. 그결과, 뿌리상단과 말단에서각각 3×105 CFU/g root와 8×103 CFU/g root로 확인되었으며, 근권토양에서균주는표면으로부터가까운 1 cm 깊이에서는 3.5×106 CFU/g soil의높은밀도로존재 하였으나, 먼 5 cm 깊이의근권토양에서는 1.1×10 CFU/g soil의낮은밀도로존재하였다. 그리고주사전자현미경을통 해고추뿌리의표피및말단에서처리한균주가생물막형 태의 군집을 형성하는 것을 확인하였다. 결과적으로 P.
fluorescens 2112 균주가 AHLs를 생산하여 quorum
sensing이이루어졌으며, 이로인해고추의뿌리에생물막과
유사한군집을형성하여고밀도로 colonization이일어났을
것으로생각된다. 따라서 P. fluorescens 2112 균주의특징인 다양한항진균물질과 auxin을생산함과동시에 colonization 을통해고추의생육촉진이나생물방제에긍정적인효과를 줄수있을것이다.
Acknowledgments
This research was supported by Basic Science Research Pro-
gram through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education, Science and Technology (NRF-2012-0001795).
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