Ethanol extract of medicinal herbal mixture accelerates hair growth and melanogenesis in vivo and in vitro

한약재 복합추출물이 모발 성장 및 멜라닌 생성 촉진에 미치는 영향

김지윤^1#, 김유진², 김문주¹, 김미려^2*

1 : 동방문화대학원대학교 뷰티예술학과, 2 : 대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실

Ethanol extract of medicinal herbal mixture accelerates hair growth and melanogenesis

in vivo

in vitro

Ji Yoon Kim

, Yoo-Jin Kim

, Moon Ju Kim

, Mi Ryeo Kim

1 : Department of Beauty science of Arts, Dongbang Culture University, Seoul, Korea 2 : Department of Herbal Pharmacology, Daegu Haany University, Daegu, Korea

ABSTRACT

Objectives : This study was performed to determine the transdermal effects of ethanol extract from medicinal herbal mixture (SHJ) on hair growth in C57BL/6 mice and melanogenesis in melanoma cells.

Methods : Mice were divided into 3 experimental groups including vehicle (CON), SHJ extract and 5% minoxidil (MNXD, positive control)-treated group. SHJ was applied topically on the hair-shaved skin of C57BL/6 mice everyday for 15 days. The thickness and density of hair with a folliscope and morphometry of hair follicle with a H&E staining were monitored at last day. Also then, hair growth-associated gene expressions were measured by immunoblot assay.

Results : The MNXD or SHJ–treated group promoted on hair growth compared to that of vehicle-treated group (CON).

Hair density and thickness of MNXD or SHJ treated-group increased compared to that of vehicle application on the 15 days, respectively. Induction of insulin-like growth factor (IGF)-1 and vascular endothelial growth factor (VEGF) were also accelerated by application of SHJ extract compared to those of CON group. But expression of transforming growth factor (TGF)-β 1 decreased in SHJ treated-group compared to that of CON group. Furthermore, SHJ extract showed to increase melanin contents in a dose-dependent manner. Tyrosinase activity significantly increased in SHJ-treated group compared with CON group in dose-dependant manner.

Conclusions : These results suggest that SHJ can be used as a component of cosmeceuticals for hair care via promoting growth and melanogenesis of hair.

1)

Key words : Medicinal herbal mixture (SHJ), IGF-1, VEGF, TGF-β1, melanin, tyrosinase

Ⅰ. 서 론

모발은 외부로부터의 충격 흡수 작용이나, 태양광선, 추위 등과 같은 외부 위험요인들로부터 머리를 보호하는 일차적인 역할을 한다

. 또한 매스미디어의 영향으로 외모에 대한 의식도 변하면서 장식적인 기능의 의미가 극대화되고

미의 기준에서 메이크업이나 패션과 함께 중요한 역할을 하게 되었다

. 따라서 탈모, 백모 등의 모발상태는 외모에 대한 사회적, 심리적 문

제를 유발하기도 한다

.

과거에는 탈모증이 노화로 인한 원인으로만 생각하여 독립 된 질환으로 인식되지 않았지만 최근에는 사회적 스트레스, 불규칙한 생활습관, 다이어트나 인스턴트 섭취로 인한 영양 불균형, 질병, 출산, 호르몬 등과 같은 원인으로 탈모 환자가 증가하고 있다

. 또한 탈모의 원인인 산화적 스트레스는 멜 라닌이 합성될 때 멜라닌세포의 핵과 미토콘드리아 DNA에 돌연변이를 생성하여 염증으로 인한 백모도 초래한다

. 최근

*Corresponding author : Mi Ryeo Kim, Department of Pharmacology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University ·Tel : +82-53-770-2241 ·Fax : +82-53-770-224 ·E-mail : [email protected]

#First author : Ji Yoon Kim, Department of Beauty science of Arts, Dongbang Culture University.

·Tel : +82-31-249-6333 ·E-mail : [email protected]

·Received : 12 June 2018 ·Revised : 25 June 2018 ·Accepted : 25 September 2018

국내의 탈모 치료제 시장은 2015년 상반기 기준으로 1조원에 육박하는 것으로 추정되었다. 국민건강보험공단에 따르면 탈모 질환으로 진료를 받은 환자가 2012년부터~2016년까지 매년 0.2~1.8%의 증가율을 보이고 있으며, 탈모 관련 헤어케어제 품의 시장규모는 2010년 이후로 연평균 10%로 성장하고 있다.

또한 해외의 경우도 중국, 미국, 유럽 등에서 탈모의 인구가 증가하고 있으므로, 탈모관련 세계 시장규모도 꾸준히 증가할 것으로 예상된다

.

백모는 노화가 진행되면서 정상적인 모발의 모구에서 멜라닌 세포가 감소함으로써 발생된다. 백모의 진행은 측두부에서 후 두부로 나타나는데, 남녀 간의 발생 시기는 차이가 없으나 백 인이 흑인보다 일찍 시작한다고 알려져 있다

. 특히 흑색 모발을 가진 동양인에게 백모가 발생하면 뚜렷이 드러나므로 심리적으로나 미용적으로 문제가 될 가능성이 크다

. 백모를 해결하기 위한 방안으로 쉽게 사용되는 것은 염모제이다. 염 모제는 금속성, 합성, 식물성 염모제 등으로 분류된다. 염모 제는 영구적이지 않을 뿐더러 화학성분이 주성분인 합성 염모 제의 경우 화학작용에 의한 모발과 두피의 손상, 자극 등의 부작용이 나타난다

. 따라서 백모를 감소시키기 위해서는 생 물학적인 접근을 통해 멜라닌을 증가시키는 연구가 이루어져 야하며 멜라닌 세포가 존재하는 모구에 존재하는 세포들 간의 상호작용 및 조절 메커니즘에 대한 분석이 필요하다.

본 연구에서는 이전 연구

를 토대로 한약재의 복합 에탄올 추출물을 사용하여 모발성장 촉진제로 알려진 3% minoxidil 또는 멜라닌세포 자극호르몬인 α -MSH를 양성대조군으로 하여 한약재 복합추출물이 모발 성장 및 멜라닌 생성에 미치는 영 향을 알아보고자 한다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 시료 추출

본 실험의 시료로 사용한 복합추출물은 하수오(Polygoni mulitiflori Radix, 중국산), 검정콩(Glycinis Semen Praeparatum, 한국산), 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata, 중국산), 생지황(Rehmanniae Radix, 한국산), 천문동(Asparagi Radix, 중국산), 맥문동(Liriopis Tuber, 한국산), 당귀(Angelicae Gigantis Radix, 한국산), 구기자 (Lycii Fructus, 중국산), 여정자(Ligustrum lucidum Aiton, 중국산)로 구성되어 있으며, 모두 대원 약업사 (대구, 대한민국)에서 구입하였다 (Table 1). 혼합한약재에 에탄올과 물을 5:5 비율로 혼합한 액 7 L를 한약재가 충분히 잠기도록 가하고, 100℃에서 10시간 1회 추출(COSMOS-660, 경서기 계산업)하였다. 추출 후 여과, 농축(rotary evaporator, N-1110V, Eyela, Japan)을 거쳐 7,000 rpm에서 20분 동안 원심분리(Large capacity refrigerated centrifuge, Continent R, Hanil, Korea)하여 얻은 추출물을 2차 여과한 후, 동결 건조(Freeze Dryer, PVTFD10R, 일신랩, Seoul, Korea)한 뒤 148.6 g의 분말을 얻었다. 시료의 수율은 29.7%로 실험에 사용할 때까지 -80℃에 보관하여 시료로 사용하였다(Table 1).

Korean medicinal herb Dose (g) Polygoni mulitiflori Radix 214.2 Glycinis Semen Praeparatum 142.8 Rehmanniae Radix Preparata 107.2

Rehmanniae Radix 107.2

Asparagi Radix 107.2

Liriopis Tuber 107.2

Angelicae Gigantis Radix 71.4

Lycii Fructus 71.4

Ligustrum lucidum Aiton 71.4

Total 1000

Table 1. Composition of SHJ extract

2. 실험동물

20g 내외의 6주령 female C57BL/6 마우스(오리엔트 바 이오, Busan, Korea)를 온도 23±3℃에 상대습도 50±10%로 12시간 조명주기 조건으로 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용 하였다. 식이(Formula : Ain-76A based cereal feed, Research diets, New Brunswick, USA)와 식수는 자유롭게 섭취토록 하였다. 실험 계획 및 수행의 전 과정은 동물실험윤 리위원회의 심의를 받은 후에 진행되었다(DHU 2016-060).

3. 도포와 희생

실험 동물을 isoflurane (JW pharmaceutical, Seoul, Korea)으로 흡입 마취시킨 다음 animal clipper (Oster, A6 comfort, 0.25 ㎜, McMinnville, USA)를 이용하여 피부에 손상이 가지 않게 주의하여 마우스 등 부위의 털을 1차적으로 제모하였다. 제모제(니크린, 일동제약, Seoul, Korea)를 제 모한 부위에 재차 도포하여 5분간 방치시킨 후, 피부에 잔존 하는 일부 모낭 또는 미세모는 제모주걱을 사용하여 제거하였다.

제모부위에 잔류하는 제모제를 온수로 세정한 뒤, 피부 안정 화를 위해 24시간 휴식시켰다. 제모한 배부 쪽 피부색이 pink color인 휴지기 체모를 가진 6주령의 마우스는 난괴법에 따라 군당 9마리씩(male 5마리, female 4마리) 3군으로 분류하였다.

도포액은 Vehicle액(D.W. (3) : poly ethylene glycol (1) :

99.9% 에탄올(1)의 혼합액), SHJ 도포액(SHJ 추출액 분말을

vehicle액에 녹인 15% 도포액)으로 제조하였다. 이전의 연구

를 바탕으로 SHJ의 처리농도를 결정하였으며, 양성대조군은

3% 목시딜(한미약품, Seoul, Korea)을 사용하였다. Control군

(vehicle액), 양성대조군인 MNXD (3% 목시딜액)처리군, SHJ

군 (15% SHJ액)을 오전 일정한 시간에 실험동물의 등 부위에

각각 200 ㎕씩 2주간 매일 경피 도포하였다. 실험동물을 희생

전 12시간 절식하고 isoflurane 흡입을 통해 마취 시킨 후 복부

하대 정맥으로부터 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 heparin

sodium (Acros, New Jersey, USA) 처리 후 1000 ×g, 4℃

에서 15분간 원심 분리(Centrifuge 5415R, Eppendorf, Hamburg, Germany)한 후 혈장을 수집하였고 시료 분석 시 까지 -80℃ (Ultra-low temperature freezer, Thermo Forma, Massachusetts, USA)에 보관하였다. 실험동물의 피부조직은 saline에 수차례 헹군 뒤 표면의 수분을 제거하여, 각 실험의 분석용으로 나누어 적출 즉시 액체질소에 급냉하여 시료 분석 시까지 -80℃에 보관하였다.

4. 육안적 관찰

실험기간 동안 등 피부에 시료를 도포한 뒤 모발의 성장 변 화를 관찰하였다. 15일 이후 자연적 발모가 일어나므로 관찰 데이터는 15일까지 제한하였고, 제모한 등 부위의 모발성장에 대한 변화양상을 육안으로 관찰하여 발모 정도에 따라 0-19%

(1점), 20-39% (2점), 40-59% (3점), 60-79% (4점), 80- 100% (5점)로 판정하였으며, 각 군별 마우스의 평균치로 나타 내었다. 또한 평가는 맹검된 숙련 연구원 10명의 판정 점수를 평균하여 산출하였다.

5. Folliscope 관찰

시료 도포 종료 후 피부 조직을 적출한 뒤, 시료 분석 시까지 4% formaldehyde solution (Junsei, Tokyo, Japan)에 고정 하였다. 보관된 채취 시료는 동일한 시점에 분석하였고, 적출한 조직은 와트만 종이(Watman, 1140-320, GE Healthcare, Shanghai, China)에 평평하게 펼친 뒤, Folliscope (ver. 2.8, Lead M, Seoul, Korea)로 측정하였다. 촬영 영상 중 시료당 동일한 2 부위를 정하고 2부위의 단위 면적(㎠)당 모발 밀도와 굵기를 평균값으로 산출하였다.

6. 피부조직 염색

시료의 도포가 모낭 수 및 크기 변화에 미치는 영향을 관찰 하기 위해서 SHJ 도포처리 15일 이후 희생하여 마우스 피부 조직을 적출하여 whatman paper에 말리지 않도록 잘 펴서 붙인 채로, 4% Formaldehyde solution에 24시간 이상 고정 하였다. 파라핀으로 포매하여 microtome (Leica, RM2255, Chicago, USA)으로 피부 조직을 세 절편으로 제작하였다.

제작한 슬라이드를 1시간 동안 가열한 다음 xylene (Samchun chemical co., Suncheon, Korea)으로 탈파라핀 시키고 70%, 80%, 90%, 100% 알코올 순서대로 함수시켰다. 이를 hematoxylin (Muto pure chemicals, Tokyo, Japan)과 eosin (Source medical products, Illinois, USA)으로 염색한 후 봉입하였다. H&E 염색된 피부 조직 슬라이드를 10 × 0.25 배율로 microscope (Motic AE31, XiangAn, China)을 사용 하여 촬영하였다.

7. 단백질 발현 관찰

적출한 조직을 lysis buffer (50 mM Tris pH 7.8, 120 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100)를 첨가하여

Homogenizer (Tissue tearor, Biospec, Korea)로 간 후 13,000 rpm, 4℃에서 30분간 원심분리 후 상층액을 채취하 였다. Bradford법을 이용하여 단백질을 정량하였으며, 12%

SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis gel (30%

acylamide/Bis solution, 37.5 : 1 (Bio-rad, California, USA), resolving gel buffer (1.5 M Tris-HCl buffer, Bio-rad, California, USA), stacking gel buffer (0.5 M Tris-HCl buffer, Bio-rad, California, USA), 10% SDS (Generay biotech, Shanghai, China), 10% ammonium persulfate (Generay biotech, Shanghai, China), TEMED (Tetramethylethylenediamine, Generay biotech, Shanghai, China))로 전기 영동하여 크기별로 단백질을 분리시킨 뒤 전 기적 방법을 이용하여 PVDF (Polyvinylidene fluoride) microporous membrane (Millipore, Darmstadt, Germany) 으로 분리된 단백질을 옮겼다. PVDF microporous membrane 을 5% skim milk (Becton, Dickinson and company, New Jersey, USA) 용액에 담구어 1시간 동안 blocking 시킨 뒤 1차 항체로 insulin-like growth factor (IGF)-1 antibody와 vascular endothelial growth factor (VEGF) antibody와 transforming growth factor (TGF) β1 antibody (Santa Cruz bio technology, Bergheimer, Germany)를 각기 1 : 1,000 및 1 : 250으로 희석시켜 4℃, 12시간 동안 반응시켰다.

반응종료 된 PVDF microporous membrane을 1x PBST (PBS (Biosesang, 경기도 성남, Korea), Tween 20 (Generay biotech, Shanghai, China)) 로 10분간 3회 세척하여 2차 항체를 1 : 1,000으로 희석하여 RT에서 1시간 반응시켰다.

1시간 뒤, 1x PBST로 10분간 3회 세척하여 소량의 ECL substrate (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)로 형광 발색하여 Image 분석기 (Sensi Q 2000, Lugen Sci, 경기도 부천, Korea)를 이용하여 각각의 factor의 발현 정도를 분석 하였다.

8. 세포 배양

본 실험에 이용한 mouse melanoma cell (B16F10)은 ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) 세포주 은행으로부터 분양받아 10% FBS (fetal bovine serum, Hyclone, Victoria, Australia)와 1% penicillin (Hyclone, Logan, Utah, USA)을 첨가한 DMEM (Hyclone, Logan, Utah, USA) 배지를 배양액으로 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO

조건에서 cell confluence가 80-85% 될 때 계대배양 하였으며 계대배양 시 trypsin-EDTA (Gibco, Burlington, Canada)을 처리 후 25℃, 1,300 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 얻었다. 세포 확인 시 microscope를 사용하였으며 세 포는 2일 주기로 배양하였다.

9. 세포 독성

세포 생존율 측정은 B16F10을 24 well plate에 2.5 × 10

cells/well이 되게 500 ㎕씩 분주하고 48시간 동안 37℃, 5%

CO

incubator에서 적응시켰다. 이후 시료를 농도별로 처리 하였고 대조군은 시료를 용해한 증류수를 사용하여 48시간 더 배양하였다. 1 ㎎/㎖의 농도인 MTT 용액(Sigma, st. Louis, MO, USA)을 250 ㎕씩 첨가하여 4시간동안 처리하였다.

MTT 용액을 제거하고 DMSO (Dimethyl Sulfoxide, Sigma, st. Louis, MO, USA) 500 ㎕를 가하여 침전물과 혼합시킨 뒤 96 well plate에 옮겨 ELISA plate reader를 이용하여 540 ㎚ 에서 OD값을 측정하였다.

10. 멜라닌 함량

멜라닌 함량 측정은 Hosoi 등

의 방법을 참고하여 사용하 였다. 100 ㎜에서 80% 자란 mouse melanoma cell (B16F10) 을 60 ㎜에 2.5 × 10

cells/well으로 분주한 후 24시간 배양 하였다. 24시간 후 시료를 농도별로 처리한 후 48시간 동안 배양한 뒤 PBS로 2번 washing 한 후 ripa buffer (50 mM Tris pH 7.8, 120 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, Thermo, Rockford, USA)을 300 ㎕씩 첨가하여 cell을 scraper (Sarstedt, Newton, USA)로 긁어 1.5 ㎖ tube에 옮겨 담았다. 옮긴 cell을 1,500 rpm에서 30분 원심 분리하여 상층액을 제거한 후 세포침전물을 10% DMSO (Junsei, Tokyo, Japan)가 첨가된 1 N NaOH (Sodium hydroxide, Generay biotech, Shanghai, China) 용액 200 ㎕ 을 첨가하여 85℃에서 1시간 용해시킨 후 405 ㎚에서 OD값을 측정하였다.

11. Tyrosinase 활성

Tyrosinase 활성 측정은 Choi 등

의 방법을 변형하여 사용 하였다. 100 ㎜에서 80% 자란 mouse melanoma cell (B16F10)을 60 ㎜로 2.5 × 10

cells/well으로 분주한 후 24시간 배양하였다. 시료를 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양한 뒤 PBS로 2번 세척한 후 Ripa buffer를 300 ㎕씩 첨가 하여 cell을 얻었다. 얻은 cell을 1,500 rpm에서 30분 원심 분리한 후 Bradford assay를 사용하여 단백질 정량을 한 상 층액에 0.1 M Sodium phosphate buffer (pH 6.8, Sigma, Lower Saxony, Germany)를 혼합하여 효소시액을 만들었다.

L-DOPA (3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine, Sigma, Shanghai, China)를 2 ㎎/㎖농도로 0.1 M Sodium phosphate buffer에 녹여 L-DOPA buffer를 만든 후, 효소 시액 50 ul와 L-DOPA buffer 150 ㎕을 96 well plate에 분주 하여 37℃ incubator에 가온하여 생성된 DOPA chrome의 양을 475 ㎚에서 OD값을 측정하였다.

12. 통계분석

실험결과 통계 처리는 SPSS 11.5 (SPSS Inc., USA)를 사용 하여 분석하였다. one-way-ANOVA를 실시하여, 분석결과에 대한 p<0.05 수준에서 Duncan 사후 검정을 통하여 각 군 간의 평균값에 대한 유의성을 나타내었다.

Ⅲ. 결 과

1. 육안적 관찰

7주령의 휴지기 털을 가진 마우스를 제모 했을 때 등 부위 피부는 연한 분홍빛을 띠었으며, 복합추출물의 발모 효과를 보기 위해 15일 동안 시료를 도포 하였을 때 등 부위 피부색이 검정색으로 변하는 것을 관찰할 수 있었다. 제모 후 5일까지는 군간 차이는 나타나지 않았으나 모든 군에서 등 피부색이 푸 른빛을 띠며 발모 징후를 보였다. 10일째 등피부의 발모가 관찰 되기 시작했으며, 정상대조군인 CON군은 1.34점으로 처방군인 SHJ군의 값인 1.66점이 더 높은 점수를 나타냈다. 도포 15일 째 양성대조군인 MNXD군은 5.00점이고, SHJ군은 4.58점 으로 군간 차이가 크게 나타나지 않았으며, 종료시점까지 도포 하였을 때 피부 두드러기, 경화 및 발진 등의 증상은 관찰되지 않았다(Table 1).

Type Hair growth score

0 day 5^th day 10^th day 14^th day CON 1.00±0.00 1.00±0.00 1.34±0.09 3.67±0.14 MNXD 1.00±0.00 1.00±0.00 1.81±0.09^* 5.00±0.00^***

SHJ 1.00±0.00 1.00±0.00 1.66±0.14^* 4.58±0.23^* Data represent the mean ± S.E. of 9 mice per group. * : p < 0.05,

*** : p < 0.001 vs CON. CON ; vehicle-treated group, MNXD ; 3%

minoxidil-treated group, SHJ ; 15% SHJ ethanol extract-treated group.

Table 2. Effects of SHJ ethanol extract on hair growth score in alopecia model of C57BL/6 mice.

2. 밀도 및 굵기

SHJ 도포가 모발 밀도와 굵기에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 15일간 도포한 피부조직을 고해상도 모발분석 기기인 folliscope로 촬영하였다. 그 결과, CON군과 비교하여 SHJ 군에서의 모발 밀도가 높음을 육안으로 관찰 할 수 있었다.

밀도를 측정하였을 때, MNXD군은 40.17 ㎠이고 SHJ군은 32.33 ㎠으로 25.67 ㎠인 CON군에 비해 높은 값을 나타내 었으며, 두께를 측정하였을 때, SHJ군은 0.17 ㎜, MNXD군은 0.19 ㎜로 0.16 ㎜인 CON군에 비해 높게 측정되었다. 밀도와 두께의 값 모두가 SHJ군과 MNXD군이 CON군에 비해 유의 적인 증가를 보였다. 양성대조군인 MNXD군과 SHJ 도포군 과의 변화수준이 유사하게 관찰됨으로써 한약재 복합추출물 이 모발의 밀도 및 굵기 증가에 영향을 미친다는 것을 확인하 였다(Figure 1, 2).

3. 피부조직 염색

JHU 도포가 모낭 수와 크기에 미치는 영향을 살펴보기 위 하여 15일간 도포한 피부조직을 H&E 염색하여 관찰하였다.

그 결과, CON군에 비해 MNXD 및 SHJ 도포군의 모낭의 수와

크기가 증가함으로써 한약재 복합추출물이 모발 성장에 영향을

미치는 것을 확인하였다(Figure 3).

Figure 1. Effect of SHJ on quantified hair density by folliscope in alopecia model of C57BL/6 mice.

Data represent the mean ± S.E. of 9 mice per group. * : p < 0.05 vs CON. CON ; vehicle-treated group, MNXD ; 3% minoxidil- treated group, SHJ ; 15% SHJ ethanol extract-treated group.

Figure 2. Effect of SHJ on quantified hair thickness by folliscope in alopecia model of C57BL/6 mice.

Data represent the mean ± S.E. of 9 mice per group. CON ; vehicle-treated group, MNXD ; 3% minoxidil-treated group, SHJ ; 15% SHJ ethanol extract-treated group.

CON MNXD SHJ

1

2

3

Figure 3. Effect of SHJ on the number and size of hair follicle in alopecia model of C57BL/6 mice by H&E staining.

CON ; vehicle-treated group, MNXD ; 3% minoxidil-treated group, SHJ ; 15% SHJ ethanol extract-treated group.

4. 단백질 발현

모발성장에 대한 SHJ의 작용기전을 살펴보기 위하여 실험 종료 후 피부 조직에서 모발 성장 관련 인자들의 단백질 변화를 관찰한 결과, 모낭 및 상피세포의 세포의 성장을 촉진하여 모발 성장의 촉진에 영향을 미치는 Insulin-like growth factor (IGF)-1의 단백질 발현양은 MNXD에서 2.02 unit를 나타냈 으며, SHJ 도포군에서는 2.47 unit를 나타내 1.95 unit인

CON군에 비해 통계적인 유의성을 보이지는 않았지만 단백질 발현이 증가되는 것을 확인하였다 (Figure 4).

또한 혈관내피 성장인자 중 하나로서 혈관 내피의 성장을

도와 혈액 순환을 개선, 모발의 성장과 모근세포 분화를 촉진

시키는 대표적 모발성장인자로 알려진 vascular endothelial

growth factor (VEGF)의 단백질 발현양을 측정한 결과,

1.99 unit인 CON군에 비해 MNXD군에서는 2.83 unit,

SHJ 도포군에서는 2.55 unit로 단백 발현이 증가되는 것을 확인하였으나 통계적 유의성은 나타나지 않았다(Figure 5).

한편 모발 성장기에 작용하여 성장기를 단축시키고 빨리 퇴행기로 접어들게 하여 탈모를 발생시키는 모발성장억제인 자인 transforming growth factor β1 (TGF-β 1)의 단백질 발현양을 관찰한 결과, CON군의 1.58 unit에 비해 MNXD군 과 SHJ 도포군에서는 각각 1.29 unit와 1.29 unit로 CON군 에 비해 단백발현양이 감소하였지만 통계적으로 유의하지는 않았다(Figure 6).



β actin IGF-1



CON MNXD SHJ

Figure 4. Effect of SHJ on IGF-1 protein expression in alopecia model of C57BL/6 mice.

Data represent the mean ± S.E. of 9 mice per group. CON ; vehicle-treated group, MNXD ; 3% minoxidil-treated group, SHJ ; 15% SHJ ethanol extract-treated group.



β actin VEGF



CON MNXD SHJ

Figure 5. Effect of SHJ on VEGF protein expression in alopecia model of C57BL/6 mice.

Data represent the mean ± S.E. of 9 mice per group. CON ; vihecle-treated group, MNXD ; 3% minoxidil-treated group, SHJ ; 15% SHJ ethanol extract-treated group.



β actin TGF- β1



CON MNXD SHJ

Figure 6. Effect of SHJ on TGF-β1 protein expression in alopecia model of C57BL/6 mice.

Data represent the mean ± S.E. of 9 mice per group.

CON ; vihecle-treated group, MNXD ; 3% minoxidil-treated group, SHJ ; 15% SHJ ethanol extract-treated group.

5. 세포 독성

B16F10 melanoma cell에서 SHJ군의 독성을 확인하기 위해 MTT assay를 실시하였다. CON군을 100으로 보았을 때 SHJ군이 각 농도별로 116.83%, 123.52%, 126.96%, 127.57%, 129.29%의 값으로 모든 농도에서 세포 생존율이 모두 유의하게 증가한 것으로 보아 세포에 대한 독성이 나타 나지 않았다는 것을 확인하였다(Figure 7).

Figure 7. Effects of SHJ ethanol extract on cell viability in B16F10 melanoma cells. Data represent the mean ± S.E. of triplicate determinations from three separate experiments. *:p < 0.05 vs CON.

CON ; distilled water-treated group, SHJ ; SHJ ethanol extract- treated group.

6. 멜라닌 함량

모발의 흑화를 유도하는 melanin의 함량을 측정한 결과,

CON군에 비하여 양성대조군인 α -MSH군에서는 185.48%였

으며, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖ 처리 농도의 SHJ

군에서는 각각 118.05%, 131.48%, 142.25%로 α -MSH 처

리군의 melanin 함량보다는 작았지만 CON군에 비해 농도 의존적으로 유의한 증가를 보임으로써 SHJ 처리는 melanin 생성을 유도한다는 것을 알 수 있었다(Figure 8).

Figure 8. Effects of SHJ ethanol extract on melanin contents in B16F10 melanoma cells.

Data represent the mean ± S.E. of triplicate determinations from three separate experiments. * : p < 0.05 vs CON. CON ; distilled water-treated group, α-MSH ; 100 nM alpha-melanocyte- stimulating hormone-treated group, SHJ ; SHJ ethanol extract- treated group.

7. Tyrosinase 활성

Melanin 생성 과정에 중요한 효소인 tyrosinase 활성을 확인한 결과, 양성대조군인 α -MSH 처리군에서 321.87%의 활성을 보여 CON군에 비해 유의적으로 증가하였으며, SHJ군 에서도 처리농도별로 각각 162.20%, 286.78%, 410.23%를 나타내 CON군에 비해 유의적인 활성 증가를 보였다. 따라서 SHJ처리는 B16F10 melanoma cell에서 melanin 합성에 중요 한 tyrosinase 활성을 촉진한다는 것을 알 수 있었다(Figure 9).

Figure 9. Effects of SHJ ethanol extract on tyrosinase activity in B16F10 melanoma cells.

Data represent the mean ± S.E. of triplicate determinations from three separate experiments. * : p < 0.05, *** : p < 0.001 vs CON.

CON ; distilled water-treated group, α-MSH ; 100 nM alpha- melanocyte-stimulating hormone-treated group, SHJ ; SHJ ethanol extract-treated group.

Ⅳ. 고 찰

잦은 염색, 퍼머, 다이어트, 스트레스 등으로 인한 탈모 환

자가 증가하고 있으므로 탈모는 남성들에게만 나타나는 현상이 아니라 여성들에게도 나타날 수 있는 심각한 모발 문제로 작용 하고 있다

. 탈모에서 남성형 탈모증(androgen alopecia)은 안드로겐 호르몬의 성분인 testosterone과 dihydrotestosterone 중 dihydrotestosterone이 많이 나타 나는 경우에 발생한다. Testosterone은 5 α-reductase에 의 해 dihydrotestosterone으로 전환되므로 5 α -reductase가 많을 경우에도 남성형 탈모증이 발생할 수 있다

. Finasteride는 5 α-reductase 저해제로서 testosterone으 로부터 dihydrotestosterone로의 전환을 억제하여 남성형 탈 모증의 치료제로 사용되고 있다

. 이것 외에도 Food and Drug Administration (FDA, USA)로부터 공인 받은 모발 성장 촉진제로는 Minoxidil이 있다. Minoxidil은 최초에 칼륨 채널을 열리게 하는 고혈압 치료제로 개발되었으나 모낭 세포의 성장을 자극하고 모발 주기를 성장기로 전환하는 역할을 하기도 한다. Minoxidil의 발모효과에 관한 작용 기전은 명확하게 밝 혀져 있지 않지만 vascular endothelial growth factor (VEGF)의 발현 유도 및 혈관확장을 통해 영양을 공급하고, 혈관내피세포, 평활근세포 활성화로 인해 혈액순환을 개선하며 모발 성장 세포들의 성장을 촉진시켜 발모를 촉진하는 것으로 예측된다

. 또한 Han 등

은 minoxidil이 dermal papilla cell에서 세포 증식과 항 세포사멸 효과를 가진다고 보고하였다.

그러나 탈모 치료제를 장기간 복용할 경우 피부염증, 가려움증 (pruritus), 홍반(erythema), 표피 벗겨짐(scaling)과 건성화 (dryness), 남성 성기능 장애, 기형아 출산 등과 같은 부작용을 초래할 수 있어 부작용을 최소화시킬 수 있는 천연물에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다

.

in vivo

실험에서 사용된 C57BL/6 mouse는 6주령의 암컷 블랙마우스로 6주령부터 모발 주기 중 휴지기가 시작된다고 알려져 있다. 마우스를 제모하였을 때 체표면의 색이 분홍색을 띠면 휴지기가 시작된 것이며, 시간이 지나 성장기로 접어들 면서 검정색의 색소를 띠는데 이는 melanocyte가 한정적으로 모낭에 존재하면서 성장기 동안에만 멜라닌이 생성되어 발모 실험 동물로서 적합하다는 것을 알 수 있다

.

최근 모발 성장에 관련된 다양한 인자들과 작용기전에 대해

연구가 활발히 진행되고 있다. 모발 성장 주기에 따라 세포성

장에 관여하는 cytokine으로 인해 탈모나 양모가 발생하는

것으로 보고되었다. 즉, 퇴행기에는 세포 증식이 감소하고 세포

사멸이 발생하는데 이를 촉진하는 인자는 inteleukin (IL)-1α ,

tumor necrosis factor (TNF)-α, endothelial growth factor

(EGF)-5, transforming growth factor (TGF)-α , -β1 등

으로 알려져 있다. 또한 모유두 세포 증식 및 분화를 활발히

하여 성장기를 유도하고 탈모를 방지시켜 주는 성장인자에는

insulin-like growth factor (IGF)-1, keratinocyte growth

factor (KGF), vascular endothelial growth factor (VEGF)

등이 있다

. VEGF는 모낭이 빠르게 세포 분열이 되어 혈액

순환을 개선하면서 angiogenesis가 유도될 때 모낭 성장을

촉진시켜 모낭의 크기와 모발의 굵기를 증가시키는 인자로 알

려져 있다

. IGF-1는 모유두 세포로부터 분비되어 상피계

세포의 증식을 촉진시키고, 모낭 조직의 길이를 증가시키는

것이 보고되었다

. 또한 마우스의 피부에 IGF-1을 과발현

시킨 결과, 모낭의 발달이 빨라졌다고 보고된바 있으며,

survival factor인 IGF-1은 세포사를 방지하여 모낭세포의 퇴화를 억제할 것으로 추측되고 있다

. 이를 고려하여 마우 스의 조직으로 western blot을 통해 TGFβ1, IGF-1, VEGF 를 측정하였는데, Control군과 비교하였을 때 SHJ군은 TGF β 1의 발현이 감소하였고 IGF-1, VEGF의 발현은 증가하였 다. 또한 김 등

의 연구와 비교하였을 때 VEGF의 발현도가 비슷하였으며 IGF-1의 발현도는 본 연구에서 더 높게 나타난 것으로 보아 한약재 복합추출물이 모발성장에 중요한 역할을 할 것이라고 생각된다.

시료의 도포 종료 후 마우스 털의 밀도와 두께를 측정하기 위해 사용한 folliscope는 phototrichogram의 종류로서, 특 수 외부센서인 디지털 프로브가 대기 상태를 감지하여 온도, 습도와 같은 환경적 요인을 반영하여 피부조직에 대해 정확히 측정할 수 있어 탈모 치료 및 발모 제품의 임상 실험시 쓰이는 장비이다

.

모발의 노화 과정 중에 나타나는 백모는 멜라닌 생성의 감소, 성장기 모구에서 멜라닌 세포의 활성 감소, 활성 산소종에 의한 tyrosinase 활성 저해, 멜라닌 세포와 멜라닌 소체 수의 감소, 노화, 스트레스, 유전, 질병 화학물질 등의 원인으로 발생된다.

특히, 활성 산소종으로 인한 백모의 원인은 모구 멜라닌 세포의 핵과 미토콘드리아의 DNA의 손상과 외측 모근초 주위의 멜 라닌 세포들이 모구로 이동하는 수가 감소하여 멜라닌 수도 감소된다고 알려져 있다

. 모발의 색을 결정하는 중요한 인자인 멜라닌은 모발상부의 melanocyte에서 생성되어 keratinocyte로 이동 후, 모발의 성장과 함께 위쪽으로 이동 한다. 따라서 모발의 melanocyte의 수가 증가하거나 기능이 활성화되면 멜라닌 생성이 증가하게 된다

. 또한멜라닌은 멜라닌 세포의 melanosome에서 tyrosinase에 의해 tyrosine 이 DOPA로 전환되고 연이어 DOPA quinone, DOPA chrome, DHI (5,6-dihydrosyindole)의 생성을 거쳐 최종 생합성된다

.

양성 대조물로 사용된 α -MSH (alpha-melanocyte- stimulating hormone)는 다면발현성 분자로서, 뇌하수체, 피부 등 여러 가지 말초조직에서 분비되어 멜라닌 색소 생성, 표피세포의 성장 및 증식 등에 생리적으로 관여한다

. α -MSH 는 CREB, MITF 단백질 발현을 증가시켜 멜라닌 합성에 작 용하는 TRP-1, TRP-2을 유도하게 되면서 tyrosinase가 활 성화 되고 eumelanin 생성이 촉진된다

. 또한, MC1R과 결합하여 G단백질을 활성화시키고 adenylate cyclase 활성에 의한 cAMP를 증가가 유도되고 PKA, tyrosinase가 활성화 되면서 멜라닌 생성이 촉진된다

. 따라서 본 실험에서는 α - MSH를 양성대조군으로 사용하여 SHJ 처리후 멜라닌 생성과 tyrosinase 활성 비교를 통해 흑화능을 확인하였다.

in vivo

및

실험을 통해 SHJ이 모발 성장과 멜라 닌생성에 미치는 영향을 연구한 결과 CON군에 비해 SHJ군이 모두 우월하였으므로 한약재 복합추출물인 SHJ는 백모와 탈모 치료 및 예방을 위한 천연 소재로 이용될 것으로 사료된다.

Ⅴ. 결 론

본 연구에서는 발모효과 및 흑화효능을 가지는 새로운 천연

소재의 개발을 위하여 복합한약재의 에탄올 추출물을 시료로 사용하여

및

에서 실험한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. 제모한 실험동물(C57BL/6)을 이용하여 한약재 복합추 출물의 발모효과를 확인한 결과 하수오를 포함한 복합 추출물을 도포한 실험군은 vehicle 도포군에 비하여 육 안적인 발모현상이 빠르게 나타났다.

2. 도포 종료 후 체모의 밀도와 두께를 folliscope로 측정 한 결과, 한약재 복합추출물 도포군이 vehicle 도포군에 비해 유의한(p < 0.05) 증가를 보였으며, 양성대조군인 Minoxidil 도포군과 유사한 효능이 관찰되었다.

3. 한약재 복합추출물군의 모낭의 수 및 크기를 H&E staining으로 관찰한 결과, Minoxidil 도포군과 비슷한 양상을 보였다.

4. Western blot 실험을 통하여 대표적 모발성장인자로 알려진 IGF-1 및 VEGF 단백질 발현도를 측정한 결과, 한약재 복합추출물 도포군이 vehicle 군에 비해 높았으며 모발성장억제인자인 TGF-β 1의 발현을 측정한 결과, vehicle 군에 비해 낮게 나타났다.

5. MTT assay를 통해 세포 독성을 검사한 결과, 한약재 복합추출물의 모든 농도에서 농도 의존적으로 유의하게 나타나 세포 독성이 없음을 확인하였다.

6. 멜라닌 함량 및 tyrosinase 활성을 통해 흑화능을 실험 한 결과, 한약재 복합추출물을 처리한 군이 농도 의존적 으로 유의하게 증가함을 나타냈으며 tyrosinase 활성 측정 시 고농도에서는 양성대조군인 α-MSH보다 높게 측정되었다.

위의 결과로 보아 한약재 복합추출물인 SHJ는 발모 촉진과 melanogenesis를 통해 탈모 예방 양모, 흑화에 도움이 되는 천연 소재로서 모발 관련 기능성 화장품 소재로 이용될 가능 성이 있을 것으로 사료된다.

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