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Effect of Snail Extract on Bone Growth in Vitro and in Vivo

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(1)

Kor. J. Pharmacogn.

49(1) : 28∼ 39 (2018)

28

달팽이 추출물이 골 성장에 미치는 in Vitro 및 in Vivo 영향

손기호1*·김태희2

1

경성대학교 약학대학,

2

㈜네이처텍

Effect of Snail Extract on Bone Growth in Vitro and in Vivo

Kieho Sohn1* and Taehee Kim2

1

College of Pharmacy, Kyungsung University, 309, Suyeong-ro, Nam-gu, Busan, 48434 Korea

2

29-8, Yongjeong-gil, Chopyeong-myeon, Jincheon-gun, Chungcheongbuk-do, 31257 Korea

Abstract − This study investigated the effect of snail extract on the growth parameters of old female rats (27 weeks). Rats were administered orally with snail extract at a dose of 100 mg/kg, 200 mg/kg, chondroitin sulfate 10 mg/kg and 0.9% saline (con- trol) for 8 weeks. Bone mineral density (BMD) and serum concentrations of insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and insulin- like growth factor-binding protein 3 (IGFBP-3) were significantly higher in rats exposed to snail extract for 8 weeks. MG-63 cells (human osteoblast-like cells) were treated with snail extract for 48 h. Their differentiation and proliferation was inves- tigated with Western blot and morphological changes observed via immunofluorescence staining of β-catenin. Treatment with snail extract significantly increased the levels of growth factors including β-catenin and IGF-1. The snail extract affected osteo- blast formation. Morphological changes in MG-63 cells were observed via immunofluorescence staining. Treatment with snail extract increased the expression of β-catenin in MG-63 cells. Results suggest that the treatment of MG-63 cells with snail extract increased the longitudinal growth and growth factor levels. Snail extract may be pharmacologically effective in osteo- genic differentiation in vitro and represents a potential therapeutic agent for bone formation.

Keywords − Snail, Fruticiola sieboldiana, Bone growth

국내에서 골다공증 환자 수는 인구의 급속한 고령화에 따 라 해마다 증가하고 있다. 전 국민에게 일반화할 수 있는 국 민건강영양조사의 2008~2011년 데이터를 통합하여 50대 이 상 남성과 여성의 골다공증을 분석한 결과, 골다공증 유병 률이 남성 7.0%, 여성 40.1%로 나타났다.

1)

일반적으로 골 량은 20대 초반에 최대치의 90%에 도달하였다가 30세를 전 후하여 최대치를 찍고 그 후 노화가 진행됨에 따라 감소하 기 시작한다. 여성의 경우, 폐경전까지는 골량의 변화가 최 소화되다가 폐경기에는 에스트로겐의 결핍에 의해 골 흡수 를 촉진하는 작용을 가지는 물질의 생산이 증가하여, 골 흡 수가 항진하기 때문에 폐경 전후에 골 량이 급속도로 감소 한다. 폐경 직전, 폐경 후 2~3년 이내에는 골 흡수의 항진 이 현저하여 연간 약 3~5%씩 골 량이 감소한다. 그 후 골 대사 회전은 저하되지만, 폐경 후 10년 동안에 15~20%의 골 량이 감소하여, 극단적인 예에서는 성인 평균치의 1/2~1/

3으로도 되는 경우가 있다.

2)

골다공증은 세계보건기구(WHO) 의 정의에 의하면 [골 량의 감소와 미세구조의 이상을 특징 으로 하는 전신적인 골격계 질환으로 결과적으로 뼈가 약 해져서 부러지기 쉬운 상태가 되는 질환]이라고 하며「골 강도는 골밀도와 골의 질에 의해 규정된다」라고 생각되고 있다. 대한골다공증학회 진료지침에 의하면 골다공증의 진 단기준을 WHO기준에 따라 T값 -2.5이하로 규정하고 있다.

특히 대퇴부 경부 골밀도의 저하가 사망률을 유의하게 증 가시키는 것으로 알려지고 있으며 골다공증은 생활기능이 나 삶의 질을 저하시킬 뿐 아니라 장기적으로는 골절의 유 무와는 관계없이 사망위험을 상승시킨다. 약물치료지침으로 는 기존 약물치료의 경험이 없는 경우에는 일반적 원칙에 의거하여 비스포스포네이트, 선택적 여성호르몬 수용체 조 절제, RANKL 단클론항체, 갑상선호르몬 등의 치료제를 권 장하며 진행성 중증 골다공증의 경우 또는 기존의 약물치 료에 반응이 불충분한 경우에는 골형성촉진제(부갑상선호르 몬), 또는 더욱 효과적인 골흡수억제제(RANKL 단클론항체

·비스포스포네이트)를 권장하고 있다.

3)

*교신저자(E-mail):khosohn@ks.ac.kr (Tel): +82-51-663-4887

(2)

한편, 식용달팽이(Fruticiola sieboldiana)는 유폐복족류로 나선형의 외각을 가지고 있으며 세계도처에서 고급 식품원 료로서 뿐만 아니라 황산콘드로이틴이 함유되어 있으며 강 장 및 강정식으로도 널리 이용되고 있다.

4-6)

식용달팽이에 들어있는 황산 콘드로이친은 D-glucurunic acid, N-acetyl-D- glucosamine, 그리고 sulfate가 등량의 몰수로 구성되어 있는 다당류이며, 동물 등의 세포간 조직, 연골조직 및 신경조직 등에 존재하며, 대부분은 다른 glycosaminoglycan과 함께 단 백질에 공유 결합하여 proteoglycan으로 존재하는 것이며, 식용달팽이의 점질 다당체의 주성분으로 알려져 있다.

7-9)

러나 달팽이의 주성분인 황상 콘트로이친의 생체내 투여에 의한 생체 내에서의 기능은 거의 알려져 있지 않다.

따라서 본 연구에서는 저자등이 확인한

10)

달팽이 추출물 이 활성 산소종에 미치는 영향과 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)이 파골세포 생성의 신호전달에 관여 하여 파골세포의 생성을 촉진한다는 연구 결과를

11,12)

바탕 으로 항산화 활성을 지닌 달팽이 추출물이 골 형성과 흡수 기전에 긍정적인 효과를 제시할 것으로 사료되어 노령기 rat 을 사용한 in vivo 실험과 조골세포인 MG-63을 사용한 in vitro 실험을 통하여 골 성장에 작용하는 작용기전을 확인하 여 이에 보고하는 바이다.

재료 및 방법

시약 및 기기 − 시약 중 bovine serum albumin(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. USA), MG-63 Human osteoblast-like cell(KCLB:한국세포주은행), fetal bovine serum (FBS: Corning, Manassas, VA, USA), Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM: Corning, Manassas, VA, USA), WST-1 용액(Daeil Lab Service, Seoul, Gyeonggi, Korea), anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP: Cell signaling Technology Inc., Beverly, MA, USA), enhanced chemiluminescence(AbFontier, Gyeonggi, Korea), Alexa 488-conjugated goat anti-rabbit IgG secondary antibody(Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA), DAPI(Roche Diagnostics GmBH, Mannheim, Germany), ProLong

®

Gold Antifade Mounting media(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), 0.1%

SDS(Intron biotechnology, Gyenggi, Korea), Commasie Blue Briliant solution(Dojindo Molecular Technologies, Rockvile, MD, USA)로부터 공급받아 사용하였다. 실험에 사용된 기기로는 glass teflon homogenizer(대한과학, Korea), UV- spectrophotometer(Shimadzu UV-1201, Japan), hultra centrifuge(Hitachi 695-7, Japan), water bath(Jeio tech Co., Korea), medical freezer(Sanyo, Japan), Elisa kit(Christal chem., USA), microplate Reader(Bio-TEK, USA), digital

calipers(Mitutoyo, Japan), 부검 저울(satorius, USA), 양에너 지 방사선 골밀도 측정기(dual energy x-ray absorptiometry, DEXA:Madison. WI, USA), 전기 회화로(Naberther furnace L1/12, Germany), XRD(Rigaku(D/MAX3A), USA), 광학현 미경(Nikon Co., Tokyo, Japan), microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA), SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE), Laser Scanning Confocal Microscope(Carl Zeiss LSM 700; Carl Zeiss, Jena, Germany)를 사용하였다.

실험 재료 − 본 실험에 사용한 달팽이와 쥐(노령쥐와 성 장쥐)는 본 연구실에서 확인한 활성 산소종 평가에 사용한 것을 각각 활용하였다. 즉, 본 실험에 사용한 달팽이(F.

sieboldiana) 시료는 ㈜ 천호식품에서 구입하여 경성대학교 약학대학 손기호 교수가 정확히 감정 한 후 열처리 및 가수 분해한 것을 사용하였으며 이는 달팽이와 정제수를 각각 1:3 비율로 넣고, 40

o

C에서 protease로 4시간 분해한 후, 95

o

C 서 5분 실활 시킨 뒤 동결 건조하여 최종산물을 얻었으며 최종 수율은 15%였다.

실험동물 − 실험동물(효창사이언스㈜, 대구, 한국)은 고형 사료와 물을 자유공급하면서 (주)동남의화학연구원 동물사 (부산, 한국)에서 일정한 조건(온도: 22±1

o

C, 습도: 55±3%, 명암: 12시간 light/ dark cycle)으로 1주일간 적응시킨 후 식 이를 투여하였다.

성장기 모델의 경우 12주령 SD-rat female를, 노령기 모 델은 27주령 SD-rat female로 8주간 시료 물질을 처리하여 실험시간 전 24시간 동안 물만 주고 절식하였다. 이때 효소 활성의 일중변동을 고려하여 실험동물을 일정시간(오전 10:00~12:00) 내에서 처치하였다. 본 연구는 ㈜동남의화학 연구원 동물실험위원회(SEMI, Institutional Animal Care and Use Committee)의 방침 및 법규에 따라 진행되었다.

동물실험 디자인 및 처치 − 시험동물 군 구성은 female SD-rat으로 성장기 모델 쥐인 4주령, 8주령, 12주령 및 노령 기 모델 쥐인 27주령으로 구성하였으며, 8주간 아래와 같이 시료 물질을 투여군의 투여량에 맞게 칭량하여 주사용 멸 균 증류수에 용해하여 조제하였으며, 위내에 강제 경구투여 방법으로, 각 개체별로 각각 56일(8주) 투여하였다(Table I).

실험디자인은 27주령 female SD-rat에 saline만 투여한 Normal(정상)군, 달팽이 추출물 100 mg/kg 투여군, 달팽이 추출물 200 mg/kg 투여군, 황상 콘트로이친 10 mg/kg투여 군 으로 구성하였다. 황상 콘트로이친은 달팽이 100 g에 존 재하는 황상 콘트로이친의 용량을 참고하여 설정하였다.

달팽이 추출물이 흰쥐의 골 생육에 미치는 In Vivo 영향 대퇴부 무게 및 대퇴부 길이의 측정 − 부검 후 대퇴부를 적출하여 근육을 제거한 후 대퇴골 길이(femur length)를 계 측하였으며, 각 대퇴부의 무게를 측정하였다.

IGFBP-3, IGF-1 측정 − 혈액 중 성장인자의 변화량을

(3)

관찰하기 위하여 실험동물의 혈청에서 성장호르몬 지표인 IGFBP-3, IGF-1의 측정은 Elisa kit를 사용하였으며, 이를 plate reader기로 측정하였다.

대퇴부 무기질밀도(Bone Mineral Density), Micro CT 관찰 − 성장상태를 확인할 대퇴부(오른쪽, 왼쪽)를 적출하여 무게 및 길이를 측정한 후, 10% formaldehyde 처리하여 BMD 및 micro-CT측정용으로 사용하였다. 양에너지 방사 선 골밀도 측정기(dual energy x-ray absorptiometry, DEXA) 를 이용하여 대퇴부의 micro CT를 관찰하였으며 small animal software로 총 골밀도(bone mineral density: BMD) 를 측정하였다.

X-ray Diffraction(XRD)관찰을 통한 대퇴부 구성 물질 확인 − 대퇴부 구성 물질 확인을 하기 위해 군별 다리를 24 시간 3차 증류수 처리 후, 48시간 과산화수소에 정치시켜 유기물을 없앤 다음, 600

o

C 전기 회화로에서 1시간 열을 가 해 뼈를 분쇄한 후, XRD로 분석하였다.

H&E염색을 통한 성장판 관찰 − 대퇴부를 적출한 다음 10% formalin에 넣어 조직을 고정한 후 수세하고 60%에서 100% alcohol로 순차적으로 탈수하여 파라핀에 포매하고 block을 만들었다. 이것을 rotary microtome을 사용하여 5 µm의 두께로 조직절편을 만들어 Hematoxylin & Eosin으 로 염색한 후 광학현미경으로 100배 및 200배 확대하여 관 찰하였다.

달팽이 추출물이 조골세포에 미치는 In Vitro 영향 조골세포(MG-63 Human Osteoblast-like Cell) 배양 − MG-63 Human osteoblast-like cell은 한국세포주은행로부터 분양받아 사용하였다. 세포배양에는 10% fetal bovine serum(FBS)와 1% penicillin-streptomycin(PAA Laboratories GmbH, Austria)을 포함하는 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM) 배지를 사용하였으며, 37

o

C, 5% CO

2

, humidified atmosphere에서 배양하였다. 현미경을 통해 세포 의 상태와 오염 여부를 확인한 뒤 3~4일 간격으로 계대 배 양하였다.

세포 독성 검사 − 각 추출물의 MG-63 cell에 대한 독성 은 WST-1 용액 을 이용하여 대조군에 대한 생존율을 백분 율로 표시하여 나타내었다. 96well plate에 0.5×10⁴cells/

well의 MG-63 cell을 seeding하고, 24시간 동안 배양한 후 농도별(100, 300, 600, 900 µg/mL)로 추출물을 첨가한 배지 로 교체한 뒤 48시간 동안 배양하였다. 그 후, WST-1 용액 을 10 μL 첨가한 배지로 교체하여 준 뒤, 37

o

C에서 3시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 microplate reader로 460 nm에 서 흡광도를 측정하였다.

Western Blot Analysis− 각 추출물을 400 µg/mL로 48시 간 처리한 MG-63 cell을 iced-cold 1 × phosphate - buffered saline(PBS) 용액으로 씻어 낸 뒤, lysis buffer[50 mM Tris- Cl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1mM DTT, 0.5% NP-40, 1%

Triton X-100, 1% Deoxycholate, 0.1% SDS로 용해하였다.

세포 용해액을 4

o

C에서 30분간 반응시킨 후, 14,000 rpm 에서 20분 동안 원심 분리하여 상등 액만 회수하였다. 단백 질의 정량은 Commasie Blue Briliant solution을 처리하여 595 nm의 흡광도를 측정하였고, 이에 대한 standard로는 bovine serum albumin(BSA)를 사용하였다. 단백질을 정량 한 후 동량의 단백질을 sample buffer에 넣고 5분간 끓인 뒤 12% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)을 이용하여 전개하였다. 전개된 gel을 nitrocellulose membrane 에 transfer한 후, 비특이적인 단백질에 대해 5% 탈지분유로 blocking을 1시간 동안 상온에서 실시하였다. Blocking이 끝 난 membrane은 완충액(1 × PBST: 4.3 mM NaPO

4

, 1.4 mM KH

2

PO

4

, 135 µM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.5% Tween-20)으 로 10분간 3번씩 세척하였다. 준비된 membrane에 각각의 1차 항체를 첨가하여 4

o

C에서 over night로 반응시켰다. 이 후 2차 항체로는 anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP)를 사용하였으며, enhanced chemiluminescence를 이 용하여 감광시켰다.

면역형광 염색(Immunofluorescence Staining) − MG-63 cell을 confocal dish에서 24시간 동안 배양한 다음 각 추출 Table I. Design of experimental group

시험동물 군 구성 처 치 마리수

1 SD-rat 4주령, female 4W Saline 0.9% 6

2 SD-rat 8주령, female 8W Saline 0.9% 6

3 SD-rat 12주령, female 12W Saline 0.9% 6

4

SD-rat 27주령 female

Normal Saline 0.9% 6

5 Snail extract 100 mg/kg 달팽이추출물

100 mg/kg 투여군 6

6 Snail extract 200 mg/kg 달팽이 추출물

200mg/kg 투여군 6 7 Chondroitin sulfate 10 mg/kg Chondroitin sulfate

10 mg/kg 투여군 6

(4)

물을 400 µg/mL의 농도로 처리하였다. 24시간 후, 4%

formaldehyde로 15 분 동안 고정시킨 다음 완충액(1 × PBS) 으로 세 번 세척하였다. 5% BSA로 실온에서 1시간 동안 blocking한 다음 각 1차 항체로 4

o

C에서 over night로 반응 시켰다. 완충액(1 × PBS)으로 세 번 세척한 다음 Alexa 488- conjugated goat anti-rabbit IgG secondary antibody를 1시 간 동안 상온에서 처리한 후 세 번 완충액(1 × PBS)으로 세 척하였다.

DAPI로 20 분 동안 37

o

C에서 핵을 염색 시킨 후, 마찬가 지로 완충액(1 × PBS)을 이용해 세척하였다. 마지막으로 ProLong

®

Gold Antifade Mounting media를 cover glass 위 에 떨어뜨린 다음 slide glass 위에 부착시켰다. 형광의 발현 은 Laser Scanning Confocal Microscope로 관찰하였다.

통계학적 방법 − 통계적 검정은 SPSS통계 프로그램을 이 용하여 수행하였으며, p<0.05 이하일 경우 통계적으로 유의 한 것으로 검정하였다. 각 항목에 대한 유의한 차이를 나타 내는지의 비교분석은 student’s t-test one-way ANOVA (Duncan’s multiple comparison test)를 이용하여 통계적 유 의성을 검증하였다.

결 과

달팽이 추출물의 골 성장 유효성 평가

대퇴부 무게 − 대퇴부 무게 및 길이를 측정한 결과 Fig. 1

과 같았다. 성장이 진행됨에 따라 대퇴부의 무게는 12주령 까지 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 노화가 진행된 27주령의 쥐에서의 대퇴부 무게는 감소한 것 으로 나타났다. 한편 달팽이 추출물 및 황상 콘트로이친 8 주 투여에 의해 오른쪽 및 왼쪽 모두 대퇴부 무게가 증가하 였으며 이는 대퇴부의 밀도와도 관계있는 것으로 사료된다.

대퇴부 길이 − 대퇴부 길이 측정은 Fig. 2와 같았다. 정상 군(4주, 8주, 12주, 27주)의 대퇴부 왼쪽, 오른쪽 무게와 길 이 및 노령 쥐인 27주령에 시료를 8주간 처리한 각 군들의 무게 및 길이를 각각 나타난 결과이다. 각 주령별 정상군에 는 대퇴부의 길이가 8주, 12주군에는 각각 유의적으로 차이 가 났으나 성장이 끝난 27주령에 saline을 투여한 군에서는 대퇴부의 길이가 감소한 것을 확인할 수 있었다. 한편 노령 쥐에 시료를 8주간 처리하였을 때 대퇴부 길이에는 크게 유 의성이 없었다.

Insulin-like Growth Factor Binding Protein-3(IGFBP-3) 농도 − IGFBP-3(insulin-like growth factor binding protein- 3)는 간과 여러 조직에서 합성되는 호르몬으로 75~80%가 IGF-1과 결합하고 있으며, IGF-1의 작용을 억제·자극하는 지표이다. 본 실험에서 혈청에서 IGFBP-3을 측정한 결과 Fig. 3와 같다. 성장이 가장 많이 되는 12주령 군에서 가장 혈청 IGFBP-3 농도가 높았다. 한편 노령 쥐인 27주령 군에 서 혈청 중 IGFBP-3의 농도가 유의적으로 낮아진 것을 확 인할 수 있었으며, 8주간 달팽이 추출물의 투여로 농도 의

Fig. 1. Effect of weight of the femoral region fed snail extract for 8 weeks (left, right). 1) Values are expressed mean±S.D. for groups of six experiments, 2) *p<0.05 vs. 27W saline 0.9%,

p<0.001 vs. 27W saline 0.9%.

Fig. 2. Effect of length of the femoral region fed snail extract for 8 weeks. 1) Values are expressed mean ± S.D. for groups of six experiments, 2) *p<0.05 vs. 27W saline 0.9%,

p<0.001 vs. 27W saline 0.9%.

(5)

존적으로 IGFBP-3의 농도가 높아진 것을 확인할 수 있었 다(Fig. 3).

Insulin Like Growth Factor-1(IGF-1) 농도 − IGF-1 (insulin-like growth factor-1)은 성장 호르몬 결합 단백질과 결합하여 간으로 이동하며, 간세포에서 IGF-1의 유전자 발 현을 촉진하는 것으로 알려져 있다.

12)

혈중에서 IGF-1 농도 측정은 간접적으로 성장호르몬 분비를 평가할 수 있는 지 표로 성장호르몬의 영향을 받아 인슐린의 표적 조직에서 당 질, 지질, 단백질의 합성을 자극하여 세포의 증식과 분화에 관여해 성장에 직접 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

13)

IGFBP-3과 같이 가장 성장이 많이 되는 12주령에서 그 농 도가 높은 것으로 확인되었으며, 노화가 진행될수록 IGF-1 의 농도가 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 한편 27주령 쥐에 달팽이 추출물을 투여한 결과 농도별로 IGF-1의 농도 가 높게 나타났으며 p<0.05 유의수준으로 황상 콘트로이친 10 mg/kg 투여 군에서 IGF-1의 농도가 높게 나타났다(Fig. 4).

대퇴부 무기질 밀도(BMD; Bone Mineral Density) − Fig. 5는 대퇴부의 무기질 밀도를 나타난 결과이다. IGFBP- 3, IGF-1과 같이 BMD에서도 성장기인 12주령에서 가장

BMD(대퇴부 무기질 밀도)가 p<0.05 유의수준으로 높은 것 을 확인할 수 있었다. 한편 노화가 진행된 27주령의 saline 군에서는 BMD가 낮게 나타나 노화가 진행 될수록 뼈의 밀 도에 변화가 생기는 것을 확인할 수 있었다. 한편 달팽이 추 출물 8주 투여로 BMD가 높아졌으나 농도의존적인 변화는 아니었다. 이는 노령으로 인해 폐경이 된 여성은 에스트로 겐 결핍으로 인해 골 흡수가 감소되고 이로 인해 골밀도 감 소에 중요한 요인이 된다는

14,15)

보고와도 일치하는 결과였다.

XRD(X-Ray Diffraction) 촬영 − Table II~Table III은 대 퇴부의 XRD 촬영 후, 수치화시킨 결과이다. 각 군별 적출 한 대퇴부를 24시간 3차 증류수 처리 후, 48시간 과산화수 소에 정치시켜 유기물을 없앤 다음, 600

o

C에서 1시간 열을 가해 뼈를 분쇄한 뒤, 뼈 성분의 XRD를 촬영 후, 주성분 Fig. 3. Effect of IGFBP-3 level fed snail extract for 8 weeks.

1) Values are expressed mean±S.D. for groups of six experi- ments, 2) *p<0.05 vs. 27W saline 0.9%,

p<0.001 vs. 27W saline 0.9%.

Fig. 4. Effect of IGF-1 level fed snail extract for 8 weeks. 1) Values are expressed mean±S.D. for groups of six experi- ments, 2) *p<0.05 vs. 27W saline 0.9%,

p<0.001 vs. 27W saline 0.9%.

Fig. 5. Effect of BMD (bone mineral density) fed snail extract for 8 weeks. 1) Values are expressed mean±S.D. for groups of six experiments, 2) *p<0.05 vs. 27W saline 0.9%,

p<0.001 vs.

27W saline 0.9%

Table II. Experimental XRD pattern intensities relative to physeal plate

Group 2-theta Height Size (deg) (cps) (ang.) 1 4W 31.600(10) 178(24) 54.6(8) 2 8W 31.49(4) 148(22) 49.2(8) 3 12W 31.590(9) 184(25) 51.2(7) 4 27W 25.93(4) 46(12) 154(10) Table III. Experimental XRD pattern intensities relative to physeal plate fed snail extract for 8 weeks

Group 2-theta Height Size (deg) (cps) (ang.) 1 Saline 0.9% 49.48(5) 45(12) 86(6) 2 Snail extract 100 31.73(3) 186(25) 49.9(9) 3 Snail extract 200 31.66(3) 185(25) 52.2(9) 4 Chondroitin sulfate 10 31.657(8) 196(26) 52.0(6)

(6)

Fig. 6. Experimental CT pattern relative to physeal plate fed snail extract for 8 weeks.

Fig. 7. Histological morphology of the femoral region (H&E staining, ×100).

(7)

변화를 살펴보았다. 그 결과 대퇴부의 주성분은 Ca

10

(PO

4

)

6

(OH)로 나타났으며, 27주령 군에서 뼈의 성분은 가장 많은 것을 확인할 수 있었으나, 유의적인 차이는 아니었다. 한편 시료를 투여한 모든 쥐 대퇴부의 주성분은 Ca

10

(PO

4

)

6

(OH) 로 나타났으며 군별로 유의 수준은 크게 없는 것으로 확인 되었다.

대퇴부 Mirco-CT 촬영 − 각 주령별 정상군 대퇴부를 이 용하여 해면질골(Trabecular)과 피질골(Cortical)을 촬영한 결 과 Fig. 6과 같이 4주령에서 성장 판이 가장 많이 열린 모 습을 나타내었으며, 시간이 갈수록 성장 판이 닫히는 것을 확인할 수 있었다. 한편 노화가 진행된 27주령 쥐에 8주간 시료를 투여한 결과(Fig. 6) 각 군별 피질골의 두께에 변화 는 관찰되었으나, 성장판 및 해면질골의 유의적인 모습을 관찰하기는 힘들었다.

대퇴부 H&E Staining − 대퇴부의 연결부위를 H&E 염색 한 결과를 Fig. 7~Fig. 8에 나타내었다.

주령별 정상군의 성장판의 H&E staining(x100배) 관찰 결 과(Fig. 7) 성장판의 모습이 4주령에서 가장 넓게 나타나는 것으로 확인되었으며, 27주령(해부 시 35주령)에서 가장 그 띠가 얇아지는 것으로 확인되었다. 특히 성장판 부분을 200 배 확대해 조골세포를 관찰한 결과 4주, 8주, 12주령 모델 모두 조골세포가 조밀하게 형성되는 것을 확인할 수 있었 으나, 노화가 진행된 27주령의 대퇴부 H&E 염색 결과 조 골세포 사이 간격이 컸으며, 세포핵의 모양도 고르지 않은 것을 관찰할 수 있었다. 한편 달팽이 추출물 100 mg/kg 및 200 mg/kg의 8주간 투여로 인하여 조골세포의 수 및 간격

이 조밀해졌으며 이는 황상 콘트로이친에서도 유사하게 확 인되었다.

달팽이 추출물의 조골세포 증식능 측정

달팽이 추출물의 Cell Cytotoxicity Assay − 세포에 대 한 독성을 알아보기 위해 조골세포인 MG-63 cell을 배양한 후, 황상 콘트로이친 및 달팽이 추출물을 다양한 농도(μg/

mL)로 48시간 처리하였다. 세포독성은 MTT assay방법을 통해 확인하였으며 Fig. 9와 같이 시료를 높은 농도로 처리 함에도 불구하고 MG-63 cell에는 독성이 없는 것으로 확인 되었다.

달팽이 추출물이 조골세포 성장인자에 미치는 효과 β-catenin, p-β-catenin 단백질 발현 − β-catenin은 평소 Fig. 8. Histological morphology of the femoral region (H&E staining, ×200).

Fig. 9. Cytotoxicity assay in MG-63 human osteoblast-like cell line treated 48h snail extract. Values sharing the same super- script letter are not significantly different each other (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.

(8)

Fig 10. A. Immunofluorescenc of β-catenin in MG-63 24 h. B. Expression of β-catenin, p-β-catenin protein in MG-63 human osteo- blast-like cell line. 1) Values sharing the same superscript letter are not significantly different each other (p<0.05) by Duncan’s mul- tiple range test. 2)) →means β-catenin expression.

Fig. 11. A. Immunofluorescence of IGF-1 in MG-63 24 h. B. Expression of p-GSK3β, IGF-1 protein in MG-63 human osteoblast- like cell line. 1) Values sharing the same superscript letter are not significantly different each other (p<0.05) by Duncan’s multiple range test. 2)) →means IGF-1 expression.

(9)

에는 GSK-3β에 의해 억제되고 있지만 osteogenic signal에 의해 활성화되며 osteogenic gene의 발현을 증가시키는 단 백질로 본 실험에서는 달팽이 추출물을 48시간 조골세포인 MG-63 cell에 처리한 결과이다(Fig. 10). β-catenin이 증가하 는 경향을 보였고, 이를 인산화 시킨 p-β-catenin의 경우도 같은 경향을 나타냄을 확인할 수 있었다.

β-catenin 면역형광 염색 − 앞서 wesetern blot울 통해 살 펴본 단백질 발현을 면역형광염색을 통해 세포내 발현하는 양을 살펴본 결과 Fig. 10과 같았다. 달팽이 추출물 400 μg/

mL을 처리한 군과 황상 콘트로이친 처리한 군에서 가장 β- catenin 발현이 많은 것이 확인되었다.

p-GSK3β, IGF-1 단백질 발현 − GSK3β의 비활성화 형태 인 p-GSK3β(Ser9)가 증가하는 경향을 보였으며, p38MAPK 와 인산화 된 형태인 p-p38MAPK도 증가하는 경향을 보였 다. 특히 IGF-1이 달팽이 추출물에서 농도 의존적으로 증가 하는 경향을 보였으며, 황상 콘트로이친에서도 같은 경향을 보여 MG-63 osteoblast cell에서 조골세포 활성을 증가시킨 다는 것을 확인하였다(Fig. 11).

IGF-1 면역형광 염색 − IGF-1의 경우도 달팽이 추출물 400 μg/mL 투여한 군에서 가장 형광발현이 많이 되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 11).

p-p38MAPK, p38MAPK 단백질 발현 − IGF-1 단백질 발 현에 따라 증가되는 p38단백질의 경우도 앞의 단백질 발현 과 같이 달팽이 추출물 농도별 처리로 유의적으로 p-p38, p38 MAPK 단백질 발현이 증가함을 확인할 수 있었다(Fig.

12).

고 찰

본 연구에서는 달팽이 추출물의 투여가 암컷 노령흰쥐에 서 노화에 따른 골조직의 직·간접적인 변화를 살펴보았다.

먼저, 대퇴부 무게는 노령 쥐에서는 감소되었으나 달팽이 추출물 투여로 증가하는 경향을 보였으나 통계적인 유의성 은 나타나지 않았다. 또한 대퇴부 무기질 밀도(BMD)측정 또한 노령 쥐에 가장 낮은 값이 확인 되었으며 8주간의 달 팽이 추출물의 투여로 골밀도(BMD)가 높아졌으나 농도의 존적인 변화는 아니었다. 이는 노령으로 인해 골다공증으로 기전이 넘어가는 단계에 달팽이 추출물의 투여가 골밀도에 상당히 도움을 주는 것으로 사료된다. 이와 같이 노령은 직 접적으로는 골 조직에 영향을 주어 골 손실, 골 생성 억제 를 하며, 간접적으로는 활성산소에 의해 골 조직 및 기타 장 기 세포에서 산화 및 손상을 주는 것을 확인할 수 있었다.

이는 체내 활성산소가 증가할 경우 조골세포 활성에 관여 하는 fibronectin이 손상을 입게 되어 조골세포 증식 및 골 형성 과정에 부정적인 영향을 초래 하며

16)

NF-kB연관 신호 전달체계를 통하여 파골세포를 활성화시킴으로 골 흡수를 촉진한다는 결과로 추론된다.

17)

이러한 결과는 이전 연구

10)

에서 확인한 바와 같이, 우수한 항산화 활성을 가진 본 달 팽이 추출물이 전체적인 골 대사에 긍정적인 영향을 미친 다는 점과 일맥상통한 결과로 생각된다.

한편 IGF-1은 성장호르몬과 관련 깊은 성장인자로 성장 호르몬의 자극을 받은 뇌하수체 전엽에서 분비한다. IGF-1 은 특히 성장판에서 연골세포증식에 영향을 미치는 것으로 Fig. 12. Expression of p-p38MAPK, p38MAPK protein in MG-63 human osteoblast-like cell line. Values sharing the same super- script letter are not significantly different each other (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.

(10)

알려져 있다.

18)

또한 성장호르몬의 발현기제에도 관여하여 성장 호르몬의 발현과정을 조절하며 인체의 대부분의 장소 에서 세포의 분화(differentiation)와 증식(proliferation), 성숙 (maturation)을 조절 한다.

19)

IGF-1의 발현은 Wnt/β-catenin 신호전달경로를 조절하는 것으로 알려져 있으며, Wnt/β- catenin 신호전달경로에서 Wnt 단백질은 배아 및 성인에서 세포 증식, 분화, 사멸 등과 같은 필수적인 생물학적 과정 에 관여하는 성장 인자이다.

20-22)

Wnt의 신호전달 체계 중 가장 많이 알려진 부분이 Wnt/β-catenin 신호전달경로이다 (Scheme I).

23)

Wnt가 Lap5/6(in vertebrates) 또는 Arrow(in Drosophila) 및 Frizzled 단백질과 결합하면 세포내 단백질 인 Dishevelled(Dah)가 활성화되고 glycogen synthase kinase- 3β(GSK-3β)이 억제되며 β-catenin으로부터 Axin이 유리되 어 LAP5/6의 세포질 내 미부(cytoplasm tail)와 결합하게 된 다. Wnt가 결합하여 Axin이 Lap5/6과 결합하고, GSK-3β가 억제되면 β-catenin 분해 복합체가 해체되고 세포질내 β- catenin이 축적되어 핵내로 들어가 T-cell factor/lymphoiden- hancer binding factor(TCF/LEF)와 결합하여 표적유전자를 발현하게 된다. 그러나 신호가 없는 상황에서는 Axin은 scaffolding단백질로서adventitious polyposis coli(APO) 및 GSK-3β와 결합하여 세포내의 β-catenin 분해 복합체(β- catenin degradation complex)를 형성하고, GSK-3β는 β- catenin을 인산화시켜 26S proctoscope에 의해 β-catenin이 파괴된다. 이와 같이 Wnt와 β-catenin이 관여하는 canonical Wnt signaling경로는 골 조직에서 골세포의 분화, 증식, 사 멸 및 골 량의 조절에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 밝 혀지고 있어, Wnt/β-catenin 신호전달 경로는 최근 수년간

골을 연구하는 분야에서 가장 주목받는 영역 중 하나이다.

24)

본 연구에서는 Serum의 IGFBP-3, IGF-1농도변화는 12주 령 쥐에서 가장 높게 나타났으며 노화가 진행됨에 따라 그 농도가 유의적으로 낮아졌다. 그러나 8주간 달팽이 및 황상 콘트로이친 시료를 투여한 결과 성장 호르몬 양이 유의적 으로 증가하는 경향을 보여 달팽이 추출물이 뼈 조직 자체 에 큰 효과를 주지는 않았으나 관련 호르몬을 조절하는 것 으로 사료된다. 이는 대퇴부 XRD촬영 결과에서도 유사한 경향을 나타내었다. 대퇴부의 XRD 촬영으로 뼈의 구성성 분인 Ca

10

(PO

4

)

6

(OH)물질의 함유가 가장 많은 것을 확인하 였으나 8주간의 시료투여가 뼈의 구성성분 및 그 양에는 크 게 영향을 주지 않은 것으로 확인되었다. 또한 micro-CT로 각 주령별 해면질골(Trabecular)와 피질골(Cortical)을 촬영 한 결과 4주령 쥐에서 가장 성장판이 많이 열린 모습을 확 인할 수 있으며, 시간이 갈수록 성장판이 닫히는 것을 확인 할 수 있었으며 노령 쥐에 8주간 시료를 투여한 결과 군별 성장판 및 해면질골의 유의적인 모습을 관찰하기는 힘들었 다. 그러나 성장판의 H&E staining(×200배) 에서는 성장판 의 모습을 확인한 결과 조골세포가 노화가 진행됨에 따라 그 간격이 넓어지는 것을 확인할 수 있었으며, 세포의 핵의 모양도 탈락되는 모습이 발견되었다. 그러나 8주간의 시료 투여로 핵의 상태 및 조골세포의 모양이 보존됨이 확인되 었다. 한편, 인간 유래 조골세포(MG-63 cell line)에 대한 독 성을 알아보기 위해 각각의 물질을 여러 농도(µg/mL)로 48 시간 처리하였을 때 황상 콘트로이친 및 달팽이 추출물을 농도별로 처리하였음에도 불구하고 세포독성은 나타나지 않 았다. 조골세포인 MG-63 cell에 달팽이 시료를 48시간 처 Scheme I. Mechanisms of bone growth and development.

23)

(11)

리한 결과, Wnt/β-catenin 신호전달경로에서 작용하는 p-β- catenin(Ser33, 37, Tyr41), 활성화 형태인 β-catenin(Ser552) 또한 증가하는 경향을 보였다. 아울러 조골세포에 미치는 p38 MAPK Signaling Pathway에서 p38 MAPK가 β-catenin 전사 활성을 증진시킴으로써 Wnt3a에 반응하여 Wnt/β–

catenin 표준 경로와 협력하며 비표준경로와는 달리 표준 경 로만이 골형성에 관여한다는 점을 고려하면

25)

GSK3β의 비 활성화 형태인 p-GSK3β(Ser9) 및 p38MAPK와 인산화 된 형태인 p-p38MAPK도 증가하는 경향을 보인다는 것은 달 팽이 추출물이 조골세포 증식 및 성장에 직접적인 영향을 미친다는 것을 시사한다. 또한 조골세포에 β-catenin, IGF-1 을 면역형광 관찰한 결과, 달팽이 추출물 및 황상 콘트로이 친 처리에 따라 조골세포의 핵 안의 β-catenin이 많이 발광 하는 모습을 관찰할 수 있었으며, IGF-1도 이와 마찬가지로 농도 의존적으로 발광하는 모습을 관찰할 수 있었다. 이상 과 같은 결과를 정리해 보면, 달팽이 추출물 투여는 직접적 으로는 조골세포에서 성장관련 인자에 영향을 미치며, 간접 적으로는 간 조직의 활성산소의 생성계와 환원계 효소(활성 산소종)를 조절하는 것으로 생각된다.

10)

아울러 serum에서 성장관련 호르몬(IGFBP-3, IGF-1)을 조절하여 결과적으로 대퇴부의 성장판에까지 긍정적인 영향을 미치는 것으로 사 료된다.

결 론

본 연구에서는 달팽이 추출물을 사용하여 노령기(27주령) female SD-rat을 사용한 in vivo 실험과 조골세포인 MG-63 cell을 사용한 in vitro 실험을 통하여 골성장에 작용하는 기 전에 대해 살펴본 결과 다음과 같았다.

1) 달팽이 추출물의 투여로 대퇴부 무게, 대퇴부 무기질 밀도가 증가하였으며 성장판 핵의 상태 및 조골세포의 모 양이 보존됨이 확인되었다.

2) Serum의 IGFBP-3, IGF-1 농도변화는 달팽이 추출물 및 황상 콘트로이친 투여로 유의적으로 증가하는 경향을 보 였으며 대퇴부 XRD촬영 결과에서도 유사한 경향을 나타내 었다.

3) 인간 유래 조골세포(MG-63 cell line)에 대한 독성 실 험에서는 달팽이 추출물을 농도별 처리에도 불구하고 세포 독성은 나타나지 않았다.

4) 인간유래 조골세포에 달팽이 시료를 48시간 처리한 결 과 p-β-catenin(Ser33, 37, Tyr41), 활성화 형태인 β-catenin (Ser552)이 증가하는 경향을 보였으며 GSK3β의 비활성화 형태인 p-GSK3β(Ser9) 및 p38MAPK와 인산화 된 형태인 p-p38MAPK도 증가하는 경향을 보였다.

5) 조골세포에 β-catenin, IGF-1을 면역형광 관찰한 결과, 달팽이 추출물 및 황산 콘트로이친 처리로 조골세포의 핵

안의 β-catenin이 많이 발광하는 모습을 관찰할 수 있었으 며, IGF-1도 이와 마찬가지로 농도 의존적으로 발광하는 모 습을 관찰할 수 있었다.

이상과 같은 연구 결과와 달팽이 추출물의 활성 산소종에 미치는 영향을 종합하여 볼 때, 달팽이 추출물은 직접적으 로는 조골세포 성장관련 인자를 조절하고, 간접적으로는 활 성산소종을 조절함으로서 대퇴부의 골 성장에 긍정적인 영 향을 미치는 것으로 사료된다.

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80.

(2018. 1. 24 접수; 2018. 2. 23 심사; 2018. 3. 19 게재확정)

수치

Fig. 1. Effect of weight of the femoral region fed snail extract for 8 weeks (left, right)
Table II. Experimental XRD pattern intensities relative to physeal plate
Fig. 6. Experimental CT pattern relative to physeal plate fed snail extract for 8 weeks.
Fig. 9. Cytotoxicity assay in MG-63 human osteoblast-like cell line treated 48h snail extract
+2

참조

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