Effect of Cinnamomi Ramulus Herbal Acupuncture on the Type 1 Hypersensitivity

이 Type 1 Hypersensitivity 에 미치는 영향 桂枝藥鍼

김동훈

¹

․ 송춘호

^1,2

1동의대학교 한의과대학 경락경혈학교실, ²동의대학교 한의학연구소

Effect of Cinnamomi Ramulus Herbal Acupuncture on the Type 1 Hypersensitivity

Dong-Hoon Kim¹, Choon-Ho Song^1,2

1Dept. of Meridian & Acupoint, College of Oriental Medicine, Dong-Eui University

2Institute of Oriental Medicine, Dong-Eui University Abstract

Objectives : We studied anti-allergic effects of

Cinnamomi Ramulus

(CR) herbal acupuncture and

Cinnamomi Ramulus

extract.

Methods :

In vivo

, animals were herbal-acupunctured with CR at both ST36s three times for 5 days. Then, we induced active systemic anaphylatic shock using compound 48/80 in ICR mice, and passive cutaneous anaphylaxis using anti-DNP IgE in Sprague Dawley rat.

In vitro

, we measured cell viability, β -hexosaminidase release and the expressions of IL-4, TNF- and COX-2 mRNA in RBL-2H3 cells afterα treatment of various concentrations of CR extract.

Results :

In vivo

, CR herbal acupuncture pretreatments at both ST36s inhibited compound 48/80-induced active systemic anaphylatic shock. Passive cutaneous anaphylaxis was inhibited by CR herbal acupuncture pretreatments at both ST36s and optional points.

In vitro

, CR extract treatments did not affect on cell viability and inhibited -hexosaminidase release. CR extract treatments also decreased the expressions ofβ IL-4, TNF- and COX-2 mRNA in RBL-2H3 cells.α

Conclusions : These results suggest that CR herbal acupuncture and CR extract should be beneficial in the inhibition of allergic inflammatory response.

Key words :

Cinnamomi Ramulus

, herbal acupuncture, allergy, RBL-2H3 cells

. 서 론

Ⅰ

은 침구요법과 약물요법을 결합 藥鍼療法

하여 시술자의 변증 결과를 토대로 氣味論 에 의거하여 치료약물을 선정하고 經絡論 에 따라 치료부위를 택하여 장부와 연계된 經 을 자극할 뿐만 아니라 한약의 작용 絡 經穴

을 동시에 얻음으로써 일반적인 치료법으로 는 효과를 보기 어려운 질환을 치료하는데

뛰어난 효과를 나타내고 있다

¹⁾

.

알러지성 비염 아토피성 피부염과

, ,

喘息

같은 알러지 질환은 환자의 삶의 질을 저하 시킬 뿐만 아니라 엄청난 사회 경제적 비용 부담을 유발하고 있다

²⁾

. 지난 20 년 동안 알 러지 질환은 전 세계적으로 급격한 증가 양 상을 보이고 있으며 한국 어린이와 청소년 의 알러지 질환에 관한 전국적 역학 조사에 의하면 우리나라에서도 알러지 질환이 증가 하고 있음이 보고되고 있다

³⁾

.

(

桂枝 Cinnamomi Ramulus , ^이하 CR) ^는

⋅교신저자: 송춘호 부산시 부산진구 양정 동 산 동의대학교 한, 2 45 의과대학 경락경혈학교실, Tel. 051-850-8643, Fax. 051-853-4036, E-mail :

[email protected]

투고: 2009/02/28 심사: 2009/03/12 채택: 2009/03/20

․

(

桂樹 Cinnamomum cassia Blume) ^{또는 기} 타 동속 근연 식물 녹나무과 ( Lauraceae) 의 어린 가지로서

⁴⁾

임상에서 진정 진통 해열 , , , 소염 항균 항바이러스 항암 건위 강심 , , , , , , 이뇨 지해 등에 이용되고 있다 ,

⁵⁾

. 桂枝 를 이 용한 실험적 연구로 血栓症 과 高粘度血症 에 미치는 영향

⁶⁾

, 家兎 의 腎 脾 · 및 循環系機能 에 미치는 影響

⁷⁾

, Angiogenesis 抑制機轉 의 에 미치는 영향

⁸⁾

, 항염 효과

⁹⁾

등이 보고되 어 있으나 桂枝 를 활용한알러지에 대한 연 구보고는 활발하지 못한 실정이다 .

는 의 로

(ST36)

足三里 足陽明胃經 合土穴

주치범위가 광범위하여 消化 循環 呼吸 泌 , , , 계통의 질환 등을 다스리며 또한 ,

尿生殖 强

의 로 임상에서 가장 많이 활용되는 壯 要穴

중의 하나이다

經穴

¹⁰⁾

.

이에 본 연구에서는 桂枝 의 효능과 桂枝 치료에 대한 근거를 마련하고자 알러 藥鍼

지 질환 모델을 이용하여 桂枝藥鍼 의 足三 처치에 대한 효과를 살펴보고

(ST36) ,

里穴

이 rat basophilic leukemia cell 桂枝抽出物

에서 와

line(RBL-2H3) β -hexosaminidase

와 발현에 미

IL-4, TNF- α COX-2 mRNA

치는 영향을 조사하여 유의한 결과를 얻었 기에 보고하는 바이다 .

재료 및 방법 II.

1. 재료

1) 桂枝藥鍼液 과 桂枝抽出物 (CR)

본 실험에 사용된 桂枝 는 주 광명제약에 ( ) 서 구입하여 사용하였으며 , 桂枝藥鍼液 桂 과

은 300 g 을 증류수로 하

枝抽出物 桂枝 水洗

여 1 ℓ 의 증류수를 加 하여 3 시간 동안 가 열 추출하였다 추출된 용액을 원심분리를 . 통하여 상층액을 분리하고 , 0.2 mm 여과지 에서 여과하여 rotary evaporator 로 200 ㎖ 가 되도록 減壓濃縮 한 후 냉동 건조하여 5.2

의 을 얻었다 에 보관하였다

g 抽出物 . -20 ℃

가 실험직전 생리식염수나 배지에 희석하여 후 실험에 사용하였 0.2 ㎛ syringe filtering

다 .

2) 실험동물

실험에 사용한 동물은 ICR 계 mouse(male, 30 ± 2 g) Sprague Dawley 와 계 rat(male, 200 ± 20 g) ( ) 을 주 샘타코 바 이오 코리아에서 구입해서 사용하였고 사육 , 은 온도 22 ± 2 , ℃ 습도 55 ± 5%,

시간 조건 하에서 고형 dark/light(12 ) pellet 사료 주식회사 샘타코 바이오 코리아 와 물 ( ) 은 자유 섭취하도록 하였으며 구입 후 , 2 주 간 실험실 환경에 적응 후 실험에 사용하였 다 .

3) 세포주

은 한국세포주은행 RBL-2H3 cells (Korea

에서 분양받아 배양 Cell Line Bank, KCLB)

하였다 .

4) 藥鍼器

는 30 gauge insulin syringe 藥鍼器

를 사용하였다

(Becton Dickinson, USA) .

5) 시약

본 실험에 사용된 compound 48/80, a n t i - d e o x y n u c l e o p r o t e i n ( D N P ) immunoglobulin E(IgE), DNP-HSA, Evans blue, KOH, acetone, phosphoric acid, acetic acid, PMA(phorbol-12-myristate-13 acetate), A23187(calcium ionophore), Naphthylethylene diamine dihydrochloride, Sulfonylamide 및 H

3

PO

4

는 Sigma 로부터 , FBS(fetal bovine serum), penicillin, streptomycin, DMEM(Dulbecco's modification Eagle medium) 및

은 로부

trypsin-EDTA solution Gibco BRL 터 , tetrazolium bromide salt(MTT) 및

는 로부

dimethylsulfoxide(DMSO) Amresco 터 , Interleukin(IL)-4 와 Tumor Necrosis Factor alpha(TNF- ) kit BD Biosciences α 는

으로부터 와

Pharmingen , cAMP PGE

2

kit 는 으로부터 구입하여 사용하였 R&D Systems

다 .

2. 방법

검액의 처치 1)

실험군은 mouse rat 와 에서 인체의 정강뼈 거친면과 종아리뼈머리의 중점에서 解谿 까 지의 연결선상에서 犢鼻 아래 3 촌으로 앞정 강근 부위에 相應 하는 양쪽 足三里 (ST36)

¹⁰⁾

부위에 처치하였으며 임의혈군은 , mouse 와

의 둔부를 취하여

rat 任意穴 (Optional Point:

이하 , OP) 에 처치하였다 .

실험군의 구성 2)

실험군은 족삼리혈 (ST36) 과 任意穴 에 생리식염수군

(OP) (Saline), 桂枝藥鍼群 으로 구분하여 처치하였다 대조군은

(CR) .

아무런 처치를 하지 않은 군으로 하였으며 , 각 혈자리에는 생리식염수나 桂枝藥鍼 (20 μ

을 격일로 회 처치하였다

g/kg) 3 .

3) Active systemic anaphylatic shock

마리를 군으로 하여 실 ICR mouse 10 1

험군 별로 약침 처치 부위를 제모한 후 격 일로 3 회의 약침을 처치하였다 마지막 처 . 치 1 시간 경과 후 compound 48/80 (8 을 복강 내에 투여하고 mg/kg, Sigma)

의 치사율을 분 동안 관찰하였다

mouse 60 .

4) Passive cutaneous anaphylaxis

의존형 피부과민반응에 대한 영향을 IgE

알아보기 위하여 Katayama 등의 방법에 준 하여 Sprague Dawley 계 rat 3 마리를 1 군 으로 하고 실험군 별로 5 일간 격일로 총 3 회의 藥鍼 을 처치하였다 실험 . 3 일째 되는 날 rat 의 다리 부위를 제모하고 0.5 mg 의 를 네 군데 피하주사한 후 감 anti-DNP IgE

작된 부위를 표시하였다 . 48 시간 경과 후

과 를

DNP-HSA 0.5 mg 4% evans blue 1:1 로 혼합하여 rat 의 미정맥에 주사하였다 . 30 분 후 rat 을 도살하고 청색으로 착색된 등 부위의 피부를 채취하여 1 N KOH 용액 100 에 침적시켜 37 에서 24 시간 방치하였

㎕ ℃

다 . Acetone phosphoric acid (5:13) 과 혼합

액 900 ㎕ 를 첨가하여 원심분리한 후 상층

액을 Microplate reader (Molecular Devices,

에서 흡광도를 측정하였다

USA) 620 nm .

세포 배양 5)

은 한국세포주은행 RBL-2H3 cells

에서 분양받았으며 세포의 배양을 (KCLB)

위하여 10% heat-inactivated FBS (Gibco

과 및

BRL, USA) 1% penicillin 을 포함한 streptomycin (Gibco BRL, USA)

배양액에서 배 DMEM (Gibco BRL, USA)

양하였다 세포는 . 37 , 5% CO2 ℃ 조건하에 서 배양하였고 세포의 증식에 따른 과밀도 , 현상을 해소하기 위하여 0.05%

trypsin-EDTA solution (Gibco BRL, USA) 을 처리하여 세포를 부유시킨 다음 계대 배 양하였다 .

6) MTT assay

RBL-2H3 cells 24 well plate (Corning, 을 USA) 2 × 10 에

⁵

cells/㎖ 의 세포수가 되도 록 DMEM 배양액에 분주하여 24 시간동안 안정화시킨 후 , 桂枝藥鍼液 을 농도별 (0,

및 로 처리한 후

0.1, 0.25, 0.5, 1 2 / ) ㎎ ㎖ 1 시간동안 반응시켰다 배양액을 제거 한 후 . 의 를 각 에 넣고 잘 섞어 5 ㎎ ㎖ / MTT well

준 후 최대 4 시간 37 incubator ℃ 에서 배양 한 후 tetrazolium bromide salt 를 제거하고

를 씩 분주하여 에 생성

DMSO 300 ㎕ well

된 formazin 이 잘 녹을 수 있게 충분히 흔 들어 모두 녹인 후 96 well plate 150 ㎕ 에 씩 옮긴 후 Microplate reader (Molecular

를 사용하여 에서 흡

Devices, USA) 540 nm

광도를 측정하였으며 , 3 회의 측정으로 그에

대한 평균값과 표준 오차를 구하였다 .

7) -Hexosaminidase release β

의 는

-Hexosaminidase release Dastych β

등의 방법에 의해 측정하였다 간략히 요약 . 하면 RBL-2H3 을 10% FBS 를 포함한

에 현탁시킨 후 에 각

DMEM 24 well plate well 당 2 x 10

⁵

개의 세포가 들어가도록 한 다음 37 ℃ 5% CO

₂

incubator 에서 하룻밤 배양한다 각 . well 의 세포들을 extracellular buffer (5 mM KCl, 12.5 mM NaCl, 20 mM HEPES, 1.5 mM MgCl, 1.5 mM CaCl

2

, 1 로 번 세척한 다음 mM dextros, pH 7.4) 2

각 well 당 extracellular buffer 와 桂枝藥鍼

및 을 처리한

(0, 0.01, 0.1, 0.25 1 / )

液 ㎎ ㎖

후 1 시간동안 반응시켰다 이후 . PMA(50

와 을 사용하여 세포를

nM) A23187(1 mM)

37 5% CO ℃

₂

incubator 1 에 시간 반응시키 고 ice bath 에서 10 분 동안 배양한 후 반응 을 종결시켰다 . Supernatant 20 ㎕ 를 96

에 옮기고 은

well plate , pellet Triton X-100 를 에 넣고 녹인 후 (0.1%) 1 ㎖ 24 well 96

에 넣는다 와

well 20 ㎕ . supernatant pellet 이 담긴 96 well 에 substrate buffer ( 4 - p - N i t r o p h e n y l - N - a c e t y l - β -D-glucosaminide 1 mM, sodium citrate

를 넣고 에서

0.05 M, pH 4.5) 100 ㎕ 37 ℃ 시간 배양시킨 다음 각 당

1 well stop

를 첨가하여 반응을 종결시 solution 200 ㎕

켰다 . Microplate reader (Molecular

를 사용하여 에서 흡

Devices, USA) 405 nm

광도를 측정하였다 시료와 대조군의 흡광도 .

값으로 다음 식에 의해 net percent

를 산출하였다 release(%) . net percent release(%) =

[S/(S+P)-S

control

/(S

control

+P

control

)]×100 S : supernatant, P : pellet S

control

/(S

control

+P

control

)(%) is spontaneous release of mediator without a stimulus

8) RT-PCR

를 에

RBL-2H3 cells 6 well plate 5 × 10

⁵

의 농도로 분주한 후 시간 동안 cells/well 24

배양한 다음 새로운 DMEM 배지에 桂枝藥 을 농도별 (0, 0.25 및 1 / ) 로 세포

鍼液 ㎎ ㎖

에 처리하였다 . 1 시간 동안 배양한 후 자극 제 A23187 (1 M) μ 를 처리하고 8 시간 동안 배양하였다 . 상층액을 제거한 후 1 ㎖ 의

을 넣고 분간 방치한 후

TRizol 2

을 넣고 초간 하고

chloroform 10 vortexing 에서 분간 원심분리한 후 상

12,000 rpm 15 ,

층액을 취하여 동량의 isopropanol 을 혼합하 여 흔들어 주었다 . 12,000 rpm 에서 10 분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 pellet 은 DEPC (diethyl pyrocarbonate)-DW 20 l μ 에 녹여 RT-PCR 에 사용하였다 .

를 사용하 RT-PCR kit (Bioneer, Korea)

여 45 ℃ 에서 30 , 94 분 ℃ 에서 5 분간 반응시 킨 후 94 ℃ 에서 30 초간 denaturation 시키 고 , 55 62 ～ ℃ 에서 30 초간 annealing 시킨 다 음 , 72 ℃ 에서 1 분간 extension 시키는 cycle 을 30 35 ～ 회 반복한 뒤 마지막 , extension 은 72 ℃ 에서 5 분간 PCR machine (GeneAmp, PCR system 9700, USA) 에서 수행하였다 . 각 PCR products 는 2%

에 하여 조건에서

agarose gel loading 100 V

분간 전기영동을 통하여 분석하였다 각

30 .

각의 primer 의 염기서열은 다음과 같다 . Table 1. Primers for RT-PCR analysis

9) 統計 분석

은 SPSS 12.0K for Windows 통계 成績

프로그램 패키지를 사용하여 평균치 ± 표준 오차로 나타내었고 유의수준은 P<0.05 로 하 였다 각 실험군 간의 통계학적 분석은 . one

와 검정을 실시

way-ANOVA Scheffe test 하였다 .

. 결 과

Ⅲ

1. Active Systemic Anaphylaxis (ASA) 에 미치는 영향

에 의한 에서 아무 Compound 48/80 ASA

런 처치를 하지 않은 대조군은 100% 의 치 사율을 보인데 반해 , ST36 saline CR 에 과 을 처치한 군은 각각 90% 와 70% 의 치사율을 보였으며 , OP saline CR 에 과 을 처치한 군은 각각 90% 80% 와 의 치사율을 보였다 (Table 2).

Table 2. Effect of CR herbal acupuncture on the

compound 48/80 induced active systemic

anaphylaxis in mice

Data represent the mean ± S.E. of 10 mice.

Mice were treated at both sides of ST36s or optional points (Ops) with saline or CR

herbal acupuncture 3 times for 5 days every other days. On day 5, mice were injected

with compound 48/80 (8 mg/kg,

i.p.

).

2. Passive Cutaneous Anaphylaxis 에 미치는 영향

(PCA)

를 이용한 에서 청색 Anti-DNP IgE PCA

반의 누출량은 아무런 처치를 하지 않은 대 조군은 20.14 ± 0.72 /site ㎍ 으로 나타났다 . 반면 ST36 에 saline 과 CR 을 처치한 군은 15.32 ± 1.43 /site 14.96 ± 0.62 /site, ㎍ 와 ㎍

에 과 을 처치한 군은

OP saline CR 16.32 ±

와 로 모두

0.56 /site 17.52 ± 1.39 /site ㎍ ㎍

대조군에 비해 유의한 억제를 나타내었다 (Fig. 1).

3. MTT assay

의 생존률에 미치는 영향 RBL-2H3 cells

을 알아보기 위하여 MTT assay 를 실시하 였다 아무런 처리를 하지 않은 대조군에서 .

의 흡광도를 나타내었으며

2.34 ± 0.06 , CR

의 농도를 처 (0.1, 0.25, 0.5, 1 and 2 / ) ㎎ ㎖

리한 세포에서 각각 2.35 ± 0.07, 2.40 ± 0.01, 2.43 ± 0.05, 2.49 ± 0.05 및 2.32 ±

의 흡광도를 나타내어 모든 농도에서 정 0.04

상세포에 비해 유의한 영향을 보이지 않았 다 (Fig. 2).

Fig. 1. Effects of CR herbal acupuncture on passive cutaneous anaphylaxis in rats.

Rats were treated at both sides of ST36s or optional points (Ops) with saline or CR

herbal acupuncture 3 times for 5 days every other days. On day 3, rats were passively

sensitized by i.d. injection of anti-DNP IgE (0.5 mg), and challenged by DNP-HSA (0.5

mg, i.v.) containing 4% Evans blue after 48 hours.

The areas of dye were measured

after sacrificing the animals later 30 minutes from antigen challenge.

Each column represents the mean ± S.E..

a, P<0.05; significant as compared to the untreated group

Fig. 2. Effects of CR extract on the cell viability of RBL-2H3 cells.

Each column represents the mean ± S.E. of 3 independent experiments.

The absorbance was measured at 540 nm using ELISA reader.

4. -Hexosaminidase release β

에서 누출된

RBL-2H3 cells β

의 양은 아무런 처리를 하 -hexosaminidase

지 않은 세포에서 8.46 ± 0.80% 이었으며 , 와 로 자극한 세포에서

PMA A23187 37.19 ± 로 아무런 처리를 하지 않은 세포에 1.12%

비해 유의한 (p<0.05) 증가를 나타내었다 반 . 면 PMA 와 A23187 자극 30 분 전 CR 의 농도로 처리 (0.01, 0.1, 0.25, and 1 / ) ㎎ ㎖

한 세포에서 각각 33.60 ± 1.37%, 29.27 ±

및 로 모든

1.24, 23.32 ± 1.09 11.29 ± 1.38%

농도에서 PMA 와 A23187 로 자극한 세포에 비해 유의한 (p<0.05) 감소를 보였다 (Fig.

3).

Fig. 3. Effects of CR extract on the β -hexosaminidase release from RBL-2H3 cells.

Each column represents the mean ± S.E. of 3 independent experiments.

The absorbance was measured at 405 nm using ELISA reader.

Release (%) = S/(S+P) x 100, S : supernant, P : pellet

a, P<0.05; significant as compared to the untreated group

b, P<0.05; significant as compared to the PMA+A23187-stimulated group

5. RT-PCR

에서의 와

RBL-2H3 cells IL-4, TNF-α 의 의 발현에 대해 조사한 결 COX-2 mRNA

과 아무런 처리를 하지 않은 세포와 , 1 ㎎ / 의 CR 을 단독으로 처리한 세포에 비해

㎖

로 자극한 세포에서 의 발현

A23187 mRNA

량이 현저하게 증가하였으며 , A23187 자극

분 전 와 의 을 처

30 0.25 ㎎ ㎖ / 1 ㎎ ㎖ / CR 리한 세포에서 IL-4, TNF- α 와 COX-2

모든 유전자의 발현이 이상 감

mRNA 50%

소하는 것으로 나타났다 (Fig. 4).

Fig. 4. Effects of CR extract on the induction of the IL-4, TNF- α and COX-2 mRNA expression in RBL-2H3 cells.

Expression of the cytokines IL-4, TNF- and COX-2α was induced following A23187 stimulation in RBL-2H3 cells. The time of maximal mRNA induction was 8 hours after pre-treated with 0.25 and 1 / CR.㎎ ㎖ IL-4, TNF- , and COX-2 mRNAs were expressed byα RT-PCR method.

. 고 찰

Ⅳ

는 녹나무과 ( 과 : Lauraceae) 에 속

桂枝 樟

한 常綠喬木 인 桂樹 및 同屬 近緣植物 의 嫩

이다 . 는 하고 으

枝 性味 辛甘溫 無毒 心肺膀胱

로 歸經 하며 發汗解肌 溫通經脈 通陽化氣 의 이 있고 임상적으로는 , 즉

效能 風寒表證 感

과 의 과 같은

冒風寒 傷寒論 桂枝附子湯 風濕

의 과 같은

,

痺痛 金匱要略 桂枝茯苓丸 經閉腹

이나 , 과 같은 으

痛 痛經 苓桂朮甘湯 陽氣不行

로 인한 痰飮 이나 蓄水 그리고 水濕停滯 의 을 다스리는데 응용된다

病症

¹¹⁾

.

문헌을 고찰해보면 , < 本草綱目 >

¹²⁾

에서 桂

는 하고 하며

枝 辛甘 溫無毒 入肺膀胱經 利

肝肺氣 心腹寒熱冷疾 霍亂轉筋 頭痛腰痛出 汗 止煩止唾 咳嗽 溫中 堅筋骨 通血脈 利疏 泄止渴 去營衛中風寒 表虛自汗 秋冬下部 滲

腹痛 益火消陰 寒痺風暗 陰盛失血 瀉痢驚 등을 한다고 하였다 . < >

癎 主治 東醫寶鑑

¹³⁾

에서 桂枝 는 枝上 을 取 하니 性質 이 輕薄 하 여 能 히 發散 한다 하였고 足太陽經 의 血分

를 히 한다 하였다 . 가 모두

寒邪 能 散 氣味 輕

하여 能上行 하여 表 를 發散 하니 表虛 自汗 의 要藥 이라 하였다 . < 本草求眞 >

¹⁴⁾

에서는

으로 에 하여 하고 에

有升無降 肺 入 利氣 膀胱

하여 하고 또 , 히 에 하

入 化氣利水 能 臂 橫行

여 調和營衛 하니 痛風脇風 을 治 하며 止煩出

의 으로 의

汗 驅風散邪 效能 解肌作用 第一要 이라 하였다 임상에서 . 는 진정 진통 , ,

藥 桂枝

해열 소염 항균 항바이러스 항암 건위 , , , , , , 강심 이뇨 지해 등에 주로 이용되고 있어 , ,

⁵⁾

알러지질환에도 응용할 수 있을 것으로 생 각된다 .

를 이용한 실험적 연구로 문 등

桂枝

⁶⁾

의

과 에 미치는 영향 양 등 , 血栓症 高粘度血症

7)

의 家兎 의 腎 脾 · 및 循環系機能 에 미치는 , 안 등

影響

⁸⁾

의 Angiogenesis 의 抑制機轉 에 미치는 영향 박 등 ,

⁹⁾

의 桂枝 의 항염 효과

등이 보고되어 있었으나 알러지에 대한 연 구보고는 활발하지 못한 실정이었다 .

는 주치가 광범위하여

(ST36) ,

足三里 消化

계통 등의 질환을 다스 , ,

循環 呼吸 泌尿生殖

리고 理脾胃 調中氣 和腸消滯 疏風化濕 , , , ,

, , , ,

通調經絡 調和氣血 扶正培元 祛邪防病 强 하는 효능이 있어

健脾胃

¹⁰⁾

, 면역기능을 강화 시킬 수 있는 經穴 중의 하나

¹⁵⁾

로 알려져 있으며알러지성 紫瘢病 에 足三里 등을 사용 한 증례

¹⁶⁾

가 보고되었다 .

은 의 원리에 따라

藥鍼療法 經絡學說 患者

의 體質 疾病 , 의 상태 등을 辨證 한 後 治療 , 및 반응점에 특정 한약에서 정제

經穴 體表

추출한 약물을 주사기로 일정량 注入 하여 질병을 치료하는 한방의료 행위로서 鍼灸療

과 을 결합한 의 이

法 藥物療法 新鍼療法 一種

다 약침은 치료 영역이 다양하고 효과가 . , 빠르며 악성 종양 자가면역계 질환 퇴행성 , , 관절염 추간판 탈출증 등 기존의 치료법으 , 로 효과를 보기 어려운 난치병에 유용하다 . 특히 기존의 약재를 약침으로 조제할 수 있 으며 현재 사용되고 있는 약침보다 더욱 효 과가 우수한 약침제재가 개발될 가능성이 높다는 점이 장점이다

¹⁾

.

알러지는 체내로 들어온 세균이나 바이러

스를 공격하여 파괴시켜버리는 면역 반응이

생체 내에서 부정적인 방향으로 반응이 일

어나 세균과 바이러스를 파괴시킴과 동시에

자신을 공격하는 것이다

¹⁷⁾

. 한국의 소아 알

러지 질환에 관한 전국적 역학 조사에 의하

면 우리나라에서도 알러지 질환이 증가하고

있음이 보고되고 있다

³⁾

. 그러나 알러지 질

환에 대한 연구가 활발해지고 알러지학을

비롯한 면역학의 발전에도 불구하고 알러지 질환의 원인 악화인자 치료 예후 등에 대 , , , 한 연구가 더 필요한 실정이다

²⁾

.

본 연구의 목적은 알러지 질환에 대한 桂 의 효능과 응용의 가능성을 검증하고

枝 藥鍼

자 하였으며 알러지 동물모델과 , RBL-2H3

을 사용하여 에 의 처치

cells ST36 桂枝藥鍼

와 桂枝抽出物 이 알러지 반응을 효과적으로 억제할 수 있는지 조사하였다 .

전통적으로 아나필락시스는 비만세포와 호염기구로부터 분비되는 화학매체에 의해 발생하는 급성 전신성 알러지 반응으로 보 통 원인 항원에 노출된 후 피부증상 호흡기 , 증상 심혈관 증상 위장관 증상 등 다기관 , , 증상을 보이며 원인은 식품 약물 곤충독 , , 등으로 알려져 있다

¹⁸⁾

. Active systemic 는 즉시형 전신성 아나필락시스 anaphylaxis

반응으로 알러지 반응 개시 수 분 이내에 발생하여 심하면 사망에 까지 이르는 것으 로 알러지 실험 모델로 많이 사용되고 있다 .

Active systemic anaphylactic shock 을 유 도하기 위해 사용된 compound 48/80 은 혼 합 다당체 성분으로 세포내 Ca

²⁺

을 증가시 키거나 비만세포의 세포막 및 수용체에 작 , 용하여 세포내로의 Ca

²⁺

유입을 증가시켜 비 만세포의 탈과립을 유도한다

¹⁹⁾

.

Compound 48/80 에 의한 active systemic 을 실시한 결과 아무런 anaphylactic shock

처치를 하지 않은 대조군은 100% 의 치사율 을 보인데 비해 , ST36 에 saline 과 CR 을 처 치한 군은 각각 90% 70% 와 의 치사율을 보 였으며 , OP 에 saline 과 CR 을 처치한 군은 각각 90% 와 80% 의 치사율을 보였다

(Table 2).

는 수동피 Passive cutaneous anaphylaxis

부면역반응으로 특정 원인물질에 대한 알러 지 소인의 유무를 검사하는 방법으로 임상 에서 많이 사용되고 있는 방법이다

²⁰⁾

. 이미 생성된 IgE 항체를 피부에 주입하여 48 시간 동안 감작한 후 원인물질에 노출시켜 알러 지 증상의 발현 정도를 살펴보는 방법이다 . 따라서 본 연구에서는 이 두 가지 동물모델 을 사용하여 알러지 반응에 대한 억제효과 를 조사하였다 .

를 이용한

Anti-DNP IgE passive 에서 청색반의 누출 cutaneous anaphylaxis

량을 조사한 결과 아무런 처치를 하지 않은 대조군은 20.14 ± 0.72 /site ㎍ 으로 나타났 다 반면 . ST36 에 saline 과 CR 을 처치한 군 은 15.32 ± 1.43 /site 14.96 ± 0.62 ㎍ 와 ㎍

에 과 을 처치한 군은

/site, OP saline CR

16.32 ± 0.56 /site 17.52 ± 1.39 /site ㎍ 와 ㎍ 로 모두 대조군에 비해 유의한 억제를 나타 내었다 (Fig. 1).

이러한 결과는 ST36 에 대한 桂枝藥鍼 처 치가 알러지 반응 억제 효과 면에서 다른 군에 비해 우수하다는 것을 나타낸다 또한 . 와 아무런 처치를 하지 않은 대조군에 OP

비해 유의한 억제효과를 나타낸 것은 桂枝 의 본초학적 약리효과에 기인한 결과로 사 료된다 따라서 . 桂枝藥鍼 이 compound 48/80 과 IgE 면역반응에 의한 비만세포의 탈과립 을 억제하고 혈관 투과성을 억제하는데 효 과가 있다고 생각된다 .

알러지 반응의 호염기구와 비만세포는 가

장 중심적인 역할을 하는 세포인데 IgE 항

체의 Fc 부분이 호염기구와 비만세포의 세포 막 표면에는 FceRI 수용체와 결합하면 항원 을 매개로 주변의 분자와 교차결합이 일어 나 탈과립을 유발한다

²⁰⁾

. 이 외에 호염기구 와 비만세포를 활성화시키는 기전이 존재하 는데 외부자극과 약물 등에 의한 Ca

²⁺

의 세 포내 유입에 의해 탈과립이 발생한다 본 연 . 구에서 in vitro ^{실험에 사용된} PMA ^및

은 비만세포를 자극하여 세포내

A23187 Ca

²⁺

유입과 증가를 유도하는데 증가된 Ca

²⁺

은 비만세포를 활성화시키는 필수적인 매개인 자로 여겨지고 있다

²¹⁾

.

비만세포의 탈과립에 의해 유출되거나 세 포막지질에서 새로 합성되는 대표적인 물질 은 histamine, leukotriene, IL-3, IL-4, IL-5, 등으로 항체생산 기관지평활근 TNF- α IgE ,

의 수축 점막 표면에 대한 선세포의 분비 , 항진 작용 등을 나타내어 즉시형 알러지 및 염증반응을 일으켜 알러지 초기 반응을 유 도한다

²²⁾

. RBL-2H3 cells 는 mucosal type 과 유사한 특징들을 나타내고 세

mast cell ,

포표면에 수십만 개의 IgE 수용체가 존재한 다 . IgE 에 감작된 후에 이 세포는 항원에 반응하고 histamine 을 방출하는데 β 는 비만세포의 분비과립에 -hexosaminidase

저장되어 있다가 비만세포가 면역학적으로 , 활성화될 때 histamine 과 함께 부수적으로 분비되므로 β -hexosaminidase 의 활성화는 비만세포 탈과립의 표지인자로서 사용된다

23,24)

. 따라서 RBL-2H3 cells histamine 는 과 분비에 알려지지 않은 -hexosaminidase

β

약물의 효과를 연구하는데 좋은 실험모델로 알려져 있다 .

본 실험에서 桂枝抽出物 이 RBL-2H3 의 생존률에 미치는 영향을 알아보기 cells

위하여 MTT assay 를 실시한 결과 아무런 , 처리를 하지 않은 대조군에서 2.34 ± 0.06 의 흡광도를 나타내었으며 , CR (0.1, 0.25, 0.5, 의 농도를 처리한 세포에서 1 and 2 ㎎ ㎖ / )

각각 2.35 ± 0.07 및 2.40 ± 0.01, 2.43 ± 의 흡광도를 0.05, 2.49 ± 0.05, 2.32 ± 0.04

나타내어 모든 농도에서 정상세포에 비해 유의한 영향을 보이지 않았다 (Fig. 2).

에서 분비된

RBL-2H3 cells β

의 양은 아무런 처리를 하 -hexosaminidase

지 않은 세포에서 8.46 ± 0.80% 이었으며 , 와 로 자극한 세포에서

PMA A23187 37.19 ± 로 아무런 처리를 하지 않은 세포에 1.12%

비해 유의한 (p<0.05) 증가를 나타내었다 반 . 면 PMA 와 A23187 자극 30 분 전 CR 의 농도로 처리 (0.01, 0.1, 0.25 and 1 / ) ㎎ ㎖

한 세포에서 각각 33.60 ± 1.37% 및 29.27

± 1.24, 23.32 ± 1.09, 11.29 ± 1.38% 로 모든 농도에서 PMA 와 A23187 로 자극한 세포에 비해 유의한 (p<0.05) 감소를 보였다 (Fig.

3).

법과 역전사효소반응을 혼합한 PCR

RT-PCR (revers transcription-polymerase 법은 세포에서 추출한 chain reaction)

에서 를 합성하고 이것을 주형 mRNA cDNA

으로 하여 PCR 법으로 증폭하고 전기영동으로 분석하는 기 polyacrylamide

술이다 이 방법으로 . mRNA 양을 추정하고 전사 레벨의 유전자 발현을 정량할 수 있다

25)

.

에서의 와

RBL-2H3 cells IL-4, TNF-α

의 발현에 대해 조사한 결과

COX-2 mRNA ,

아무런 처리를 하지 않은 세포와 1 ㎎ ㎖ / 의 을 단독으로 처리한 세포에 비해

CR A23187

로 자극한 세포에서 mRNA 의 발현량이 현 저하게 증가하였으며 , A23187 자극 30 분 전

과 의 을 처리한 세포

0.25 ㎎ ㎖ / 1 ㎎ ㎖ / CR

에서 IL-4, TNF- α 와 COX-2 mRNA 모든 유전자의 발현이 50% 이상 감소하는 것으로 나타났다 (Fig. 4).

이 PMA 및 A23187 로 자극한 桂枝抽出物

에서 와

RBL-2H3 cells IL-4, TNF- α COX-2 모든 유전자의 발현을 억제시킴을 mRNA

볼 때 , 桂枝抽出物 은 알러지 염증반응을 억 제시키는 기전을 가지고 있음을 알 수 있다 . 이상의 연구결과를 살펴볼 때 桂枝藥鍼 의

처치와 에

ST36 RBL-2H3 cells 桂枝抽出物 의 전처치가 알러지 반응을 억제시킴을 알 수 있었으며 향후 桂枝藥鍼 이 알러지 질환 치료에 응용가능할 것으로 판단된다 .

. 결 론

Ⅴ

이 type 1 hypersensitivity 에 미 桂枝藥鍼

치는 영향을 연구한 결과 다음과 같은 結論 을 얻었다 .

에 의한 에서 아무 1. Compound 48/80 ASA

런 처치를 하지 않은 대조군은 100% 의 치사율을 보인데 비해 , ST36 에 saline 과 을 처치한 군은 각각 와 의

CR 90% 70%

치사율을 보였으며 , 임의혈에 saline 과 을 처치한 군은 각각 와 의

CR 90% 80%

치사율을 보여 ASA 에 대한 억제 효과가

나타났다 .

를 이용한 에서 2. Anti-DNP IgE PCA ST36

군과 임의혈군 모두 아무런 처치를 하지 않은 대조군에 비해 유의성 있는 청색반 의 누출량 감소를 보였다 .

를 실시한 결과 모든 농도에 3. MTT assay

서 아무런 처리를 하지 않은 대조군에 비해 유의한 영향을 보이지 않았다 .

에서 분비된

4. RBL-2H3 cell β

의 양은 와

-hexosaminidase PMA A23187 로 자극한 후 CR 0.01, 0.1, 0.25 and 1

의 농도로 처리한 세포에서

/ PMA

㎎ ㎖

와 A23187 로 자극한 세포에 비해 유의한 감소를 보였다 .

에서 은 와

5. RT-PCR CR IL-4, TNF-α 의 발현을 농도 의존적으 COX-2 mRNA

로 감소시키는 것으로 나타났다 .

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