서론
생촉매인 효소는 기존의 화학촉매와 비교하여 다양한 기질 특이성, 높은 광학 선택성, 빠른 반응속도, 환경 친 화성, 낮은 부반응, 높은 반응 수율 등의 다양한 장점을 가지고 있다. 이러한 반응 특성으로 인해 실제 산업공정 에서 쓰이고 있는 화학촉매를 효소로 대체하려는 시도들 이 이루어 지고 있다. 그러나 대부분의 산업공정은 높은 수율을 얻기 위해 고온 혹은 유기 용매의 사용 등과 같이 효소 안정성과 활성을 저하시키는 극한 환경에서 운영된 다. 효소 공정에서 효소 가격이 차지하는 비중이 가장 높 은 만큼 효소의 안정성과 활성을 증가시키는 것은 효소 의 산업적 이용에 매우 중요한 과제이다. 안정성 또는 활 성이 높은 효소를 얻기 위해서 전통적으로 극한 환경에 서 사는 미생물(extremophile)로부터 효소를 탐색 (screening)하거나, 효소에 첨가제(additive)를 넣거나 화학적 수식(chemical modification)을 할 수 있으며 다 양한 형태의 담체에 효소를 고정화(immobilization)시키 기도 한다. 그러나 최근에는 효소 개량 기술(enzyme engineering)의 급격한 발전으로 인해 효소자체를 개량 하는 전략이 더욱 각광을 받고 있다. 본 칼럼에서는 효소 개량 기술 중에서 효소 구조와 기능의 이해를 토대로 한 컴퓨터 효소 설계 기법(computational enzyme design) 을 이용한 효소의 열 안정성, 유기용매 안정성과 활성 향 상전략을 소개하고자 한다.
본론
1) 효소개량
효소 개량 기술은 크게 효소의 구조 정보를 기반으로 한 컴퓨터 효소 설계 기법과 유전자의 임의적 개량을 기 반으로 한 방향적 진화 기법(directed evolution)으로 나 뉜다[표 1]. 구조 분석 및 모델링 기술의 발달로 효소 구 조 예측이 용이해진 만큼 본 칼럼에서는 종래의 합리적 효소 설계 기법(rational enzyme design)도 컴퓨터 효소 설계 기법에 포함시키기로 한다. 방향적 진화 기술의 경 우, 무작위적 유전자 조작을 통해 효소의 안정성과 활성 을 증가시킬 수 있으나 효과적인 발현(expression) 및 선
2002 연세대학교 화학공학과 학사 2011 서울대학교 화학생물공학부 박사 현 재 서울대학교 화학생물공학부 박사후 연구원
주 정 찬
서울대학교 화학생물공학부 [email protected]
별(selection) 시스템이 필요하며 많은 시간과 노력 이 소요된다. 반면 컴퓨터 효소 설계의 경우, 효소 3 차원 구조와 기능 관계를 분석하고 효소의 안정성과 활성에 관련된 잔기(residue)들을 찾아내어 변이 (mutation)시킴으로써 좀더 용이하게 효소를 개량 할 수 있다. 또한 구조 분석 기반의 효소 안정성 혹 은 활성 증대 전략은 다른 효소에도 적용할 수 있는 가능성도 있다. 하지만 성공적인 효소 설계를 위해 서는 효소 구조를 정확하게 모델링 할 수 있는 소프 트웨어가 필요하며 구조와 기능을 관계를 명확하게 이해하고 있어야 한다. 따라서 효소의 안정성과 활 성에 관련된 구조적 특징을 정확히 이해한다면 시간 과 노력을 최소화하여 효소의 안정성과 활성을 성공 적으로 향상시킬 수 있다.
2) 열 안정성 향상전략
효소의 열 안정성은 매우 고전적인 연구주제이지 만 효소의 산업적 이용 측면에서는 여전히 중요한 연구과제로 남아있다. 효소 구조에 대한 오랜 연구 를 통해서 효소의 열 안정성에 중요한 역할을 하는 구조적 인자는 잘 알려져 있다. 대표적인 구조적 인 자로 소수성 결합(hydrophobic interaction), 수소결 합(hydrogen bond), 정전기적 인력(electrostatic interaction), 이황화 결합(disulfide bond) 등이 있 다. 기존 효소 설계 전략은 이들 구조적 인자를 효소 내 불안정한 부위에 도입함으로써 효소의 열 안정성 을 향상시키는 것이다. 하지만 예상보다 그 성공확 률이 높지 않으며 열 안정성이 향상되더라도 구조적 경직성(rigidity)향상으로 인해 효소의 활성이 감소 되기도 한다. 따라서 열 안정성과 관련된 구조적 인 자를 도입하되 열 안정성은 향상시키면서 효소의 활 성은 저하시키지 않는 전략을 개발할 필요가 있다.
다양한 구조적 인자 중에서 효소에 존재하는 빈 공 간인 공동(cavity)은 효소의 안정성과 활성에 중요 한 역할을 한다. 효소 내 공동은 효소의 활성에 필요 한 유연성(flexibility)을 부여하지만 공동 내부의 잔 기들은 상호작용이 적어 구조적으로 불안정할 수 있 다. 따라서 공동을 이루는 잔기는 변이를 통해서 안 정화 시킬 수 있다. 기존의 연구에서는 효소 중심부의 공동을 채우는 전략(cavity-filling)을 기반으로 주로 공동 내의 작은 잔기를 더 큰 잔기로 치환하였는데 이 전략은 효소의 열 안정성은 향상시키지만 효소 내부의 표 1. 방향적 진화와 컴퓨터 효소 설계의 특징 비교
Directed evolution Computational enzyme design
·No need of knowledge on enzyme structure/sequence and mechanism
·Detailed information on the relationship between structure and function/
mechanism
·Library of diversity gene (Random mutagenesis or recombination)
·Effective searching algorithm and accurate scoring function
·Cover whole sequence but sometimes biased mutations
·Cover whole sequence but more effective on specific motif or domain
·High-throughput selection method
·Moderate selection method but sometimes high-throughput selection method
그림 1. 컴퓨터 설계에 의한 자일라나제의 열 안정성 향상 전략 (A) 효소 표면에 존재하는 유연성이 높은 공극, 야생 종과 사중 변이주의 구조적 유연성(B)과 열 안정성(C) 차이.
구조적 경직성이 증가하여 대부분의 경우 활성이 저하 되는 문제점을 가지고 있다. 효소의 활성은 유지하며 열 안정성을 향상시키기 위해서는 활성과 관련이 없지만 열 안정성을 향상시킬 확률이 높은 공동을 선택하여 변 이시켜야 한다. 효소 내부 잔기보다는 외부 잔기기 변이 에 유연하여 원래의 활성을 잘 보존하는 것으로 알려져 있으며 구조적 유연성이 높은 잔기가 높은 온도에서 구 조의 풀림(unfolding)을 촉진하여열 안정성을 저하시키 는 것으로 알려져 있다. 본 저자는Bacillus circulans 유 래의 자일라나제(xylanase)를 대상 효소로 하여 효소 외부에 존재하며 효소의 활성에 중요한 잔기를 포함하 지 않고 구조적 유연성이 높은 공동을 찾아내어 변이의 대상으로 하였다[그림 1]. 대상 공동 잔기와 주변 잔기 의 상호작용을 최적화하기 위해서 분자동역학 시뮬레이 션(molecular dynamics simulation)을 수행하여 유연성 이 높은 4개의 잔기를 찾아내고 컴퓨터 설계 소프트웨 어인 RosettaDesign으로 최적화하였다. 그 결과 총 20여 개의 변이주만 제작하여 활성은 유지하고 열 안정성은 30배 향상된 사중 변이주(F48Y/T50V/N52Y/T147L) 를성공적으로설계하였다.
3) 유기용매 안정성 향상전략
유기 합성 공정에서는 소수성이 강한 기질의 용해 도를 높이기 위해서 극성 유기용매(polar organic solvent)를 많이 사용되며 이러한 환경 하에서 효소 는 쉽게 안정성을 잃는다. 효소의 열 안정성 향상 연 구와 달리 유기용매 안정성을 컴퓨터 설계 기법으로 증가시킨 사례는 거의 없다. 그 이유는 열 안정성의 경우, 효소 잔기 자체의 구조적 상호작용만을 고려하 면 되지만 유기용매 안정성의 경우, 효소 표면 잔기, 물 분자, 유기용매 분자 간의 상호작용을 모두 고려해 야 하기 때문이다. 실험과 모델링 결과에 의하면 극성 유기용매는 효소 표면 잔기와 결합을 위해 물 분자와 경쟁하여 효소 표면으로 침투한 뒤 효소 표면 구조를 풀리게(unfolding)하여 효소 내부로 침투한 후 효소 내부의 소수성 결합을 붕괴시켜 효소를 불안정화시 키는 것으로 알려져 있다. 이 일련의 불안정화 과정에 서 최초의 시작점이 되는 효소 표면에 존재하는 유기 용매가 쉽게 침투할 수 있는 잔기들을 유기용매의 접 촉이 약한 잔기들로 치환하면 효소의 유기용매 안정 성을 향상시킬 수 있다. 본 저자는 이러한 전략을 Bacillus subtilis 유래의 리파제(lipase)를 대상 효소로
그림 2. 컴퓨터 설계에 의한 리파제의 에탄올 안정성 향상 전략 (A) 에탄올 결합력이 강한 리파제 표면 잔기들, (B) 리파제의 유기용매 상에서의 분자동역학 시뮬레이션, (C) 에탄올 용매 상에서 구조적 안정성이 약한 잔기들, (D) 에탄올 안정성이 향상된 변이주들.
하여 적용시켰다. 유기용매와 효소 표면 잔기가 가질 수 있는 상호작용을 명확하게 예측하기 위해 에탄올 을 대상 극성 유기용매로 선정하였다. 에탄올의 하이 드록실기는 수소결합을, 에틸기는 소수성 결합을 효 소 표면 잔기와 가질 수 있다. 컴퓨터 모델링을 통해 리파제 표면 잔기와 에탄올과의 상호작용을 분석하 여 에탄올이 쉽게 결합할 수 있는 잔기들을 찾아내고 이 잔기들을 다른 19개의 아미노산으로 모두 치환한 뒤 다시 에탄올과 상호작용을 분석하여 에탄올과 결 합이 약해진 변이주를 찾아내었다. 이렇게 찾아낸 잔 기들이 수용액보다 에탄올 용매에서 더 구조적 유연 성이 높아 불안정한 지를 분자동역학 시뮬레이션으 로 확인하였다. 컴퓨터 모델링에 의해 에탄올 용매상 에서 에탄올과 쉽게 결합하지만 그 구조적 안정성이 낮은 잔기를 찾아내어 변이의 대상으로 하였다[그림 2]. 총 11개의 변이만을 제작하여 에탄올 안정성이 향상된 4개의 변이주(S16G, A38G, A38T, L108N) 를 성공적으로 설계하였다. 본 연구는 컴퓨터 설계 기 법을 이용하여 효소의 유기용매 안정성을 향상시킨
최초의 사례로 특정한 효소에만 국한되지 않고 다양 한 효소에 적응시킬 수 있을 것으로 기대된다.
4) 효소 활성 향상전략
효소의 산업적 이용을 위해서는 안정성뿐만 활성 도 매우 중요하다. 하지만 안정성 향상과는 달리 효 소의 활성을 컴퓨터 모델링을 예측하는 것은 매우 어렵다. 효소의 활성은 실험적으로 kcat/Km으로 표 현되며 반응속도 상수에 해당하는 kcat은 컴퓨터 모 델링으로 예측이 불가능하지만 기질 친화력에 해당 하는 Km은 효소와 기질의 결합에 대한 모델링으로 해석이 가능하다. 따라서 컴퓨터 모델링을 이용하여 효소와 기질의 결합에 대한 구조 정보를 정확하게 이해하여 기질 결합력을 향상시킬 수 있다면 효소의 활성도 증가시킬 수 있다. 효소 활성을 향상시키기 위한 기존의 효소 설계 연구는 기질이 결합하는 입 구(substrate binding pocket) 또는 활성 부위 (active site)에 존재하는 잔기와 기질간의 결합을 모사(docking study)하여 기질 친화력이 향상된 변
그림 3. 컴퓨터 설계에 의한 자일라나제 활성 향상 전략 (A) 기질 결합을 위한 구조변화 및 유연성 변화 예측. 기질
을 받아들이는 부분(노란색과 분홍색). 기질 결합을 위한 구조적 변화를 조정하는 경첩부분(파란색). 활성 잔
기(빨간색: 78Glu와 172Glu), (B) 경첩부위의 구조적 유연성을 제약하는 정전기적 인력(49Arg-4Asp)과 cation-pi 작
용(49Arg-42Trp), (C) 분자동역학 시뮬레이션에 의해 밝혀진 49Arg와 변이주간의 유연성 차이, (D) 변이주의 증
가된 활성도.
이주를 예측하는 전략이 대부분이다. 하지만 이러한 전략의 경우 기질 친화력은 향상하였으나 반응 속도 상수의 감소로 인해 활성(kcat/Km)이 많이 증가되지 않는 경우가 많다. 따라서 효소의 활성 부위에 존재 하지 않지만 기질과의 결합에 중요한 역할을 하는 잔기를 치환하여 효소의 활성을 효과적으로 증가시 키는 전략을 개발할 필요가 있다. 본 저자는Bacillus circulans 유래의 자일라나제 대상 효소로 하여 기질 친화력을 향상시키는 컴퓨터 설계를 수행하여 효소 의 활성을 증가시켰다. 자일라나제의 기질이 결합한 상태(holo enzyme)와 결합하지 않은 상태(apo enzyme)간의 구조적 차이와 유연성 차이를 분석한 결과, 기질을 받아들이기 위해서는 자일라나제는 오 른손과 같이 생긴 구조에서 엄지손가락(노란색)과 아래손가락(분홍색)이 상하운동을 반복한다[그림 3]. 이러한 상하운동은 효소 활성부위 반대편에 있 는 경첩부위(파란색: hinge residue)에 유연성에 의 해서 조절된다. 그러나 이 경첩부위의 중심 잔기인 49Arg이 정전기적 인력과 cation-pi 결합에 의해 그 유연성이 제한되고 있어 이 잔기를 치환하여 경첩부 위에 유연성을 증가시켜줄 경우 엄지손가락과 아래 손가락의 상하운동이 촉진되어 기질이 더욱 빠르게 결합할 수 있어 효소의 기질 친화력을 증가시킬 수 있다. 이러한 컴퓨터 모델링 결과를 토대로 49Arg를 실험적으로 다른 19개의 아미노산으로 치환하고 kcat/Km을 측정한 결과, Gly, Leu, Pro을 제외한 17 개 변이주의 Km이 향상되었고 12개 변이주의 kcat/Km이 증가하는 것을 확인하였다. 기질 결합에 관련된 효소 구조 변화를 예측하여 활성부위와 멀리 떨어진 경첩부위 잔기를 변이시키는 전략은 매우 새 로운 시도로써 기질과 결합 시 구조변화를 가지는 여러 효소에 적용할 수 있을 것으로 기대된다.
결론: 향후 연구 방향
지금까지 컴퓨터 설계 기법을 이용하여 효소의 열 안정성, 유기용매 안정성, 활성 향상 전략에 대한 예
를 살펴보았다. 효소 3차 구조 수의 폭발적 증가와 컴퓨터 소프트웨어 기술의 비약적인 발전으로 인해 컴퓨터 설계 기법의 정확도와 효율성이 매우 높아졌 다. 그리고 효소 설계 대상이 종래의 안정성에 국한 되는 것이 아니라 기질특이성, 광학순수성, 최적 pH 조절 등 다양한 연구 주제로 확대되고 있다. 하지만 컴퓨터 설계의 경우, 기능에 관련된 중요한 잔기들 을 효과적으로 찾을 수 있지만 기능 향상 폭이 크지 않은 단점이 있고 방향적 진화의 경우, 기능에 관련 된 중용한 잔기를 찾기 위해 많은 변이주를 검증해 야 하는 어려움이 있지만 많은 노력과 시간을 들이 면 비교적 기능이 크게 향상된 변이주를 얻을 수 있 는 장점이 있다. 따라서 두 가지 기술이 가지는 단점 을 극복하고 장점을 극대화하기 위해 두 기술을 융 합할 필요가 있다. 먼저 컴퓨터 설계 기술을 통해 기 능에 중요한 잔기들을 찾아낸 뒤 이 잔기들을 포화 돌연변이(saturation mutagenesis) 등의 방향적 진 화 기술로 최적화한다면 종래의 개별적 접근보다 좀 더 용이하면서도 뛰어난 개량 결과를 얻을 수 있을 것이다[그림 4]. 효소는 현재 생물공학이 적용되는 모든 분야에 쓰이는 가장 중요한 기본 재료이다. 따 라서 본 칼럼에 소개된 컴퓨터 설계 기술은 생물공 학이 적용되는 모든 산업분야에 유용하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
