수종 탄닌의 역전사효소와
HIV-1복제 저해활성
김영호 • 이 성 우 • 김항섭 • 이 승 호 * ■ 송 만 기 **
KIST 생명공학연구소. •영남대학교 약학대학. (Received July 25. 1995)
• 성 영 철 ** • 이 정 준 *
•포항공과대학
In h ib ito ry A ctivities of T an n in s ag ain st Reverse Transcriptase a n d HIV-1 R eplication
Y o u n g Ho K im . S u n g W o o Lee, H a n g S u b K im , S e u n g H o Lee*, M a n K i Song**, Y o u n g C h u l Sung** a n d J u n g J o o n Lee*
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KIST, Taejon 305-606, Korea
^College of Pharmacy, Yeungnam University, Kyongsan 712-749, Korea
**Dept. of Life Science, Pohang University of Science and Technology, Pohang 790-784, Korea
Abstract— Thirty ellagitannins originated from some Euphorbiaceous plants were tested for the in hibitory activities against AMV reverse transcriptase and replication of HIV-1 using syncytia form ing as
say. Most of ellagitannins showed strong inhibitory activities against AMV reverse transcriptase. Some ellagitannins including geraniin. m allotusinin. daeocarpusin. euphorscopin and jo lkianin, showed sig
nificant inhibitory activities of syncytia form ation of supT l cell line.
Keywords □ AMV reverse transcriptase. Euphorbia sp.. ellagitannin. h u m a n im m unodeficiency virus type 1 (HIV-1). syncytia form ation.
탄닌은 식물체에 널리 분포하고 있으며 다양한 구조를 갖는 polyphenol 화합물군으로서 최근 식물화학적 연구 를 통하여 새로운 구조의 탄닌이 계속 보고되고 있으며, 홍미있는 활성돌이 속속 밝혀지고 있다. 지금까지 알려 진 탄닌의 생물활성으로는 지 질과산화 저해"\ Ca^-ac- tivated hyaluronidase 활성저해오\ protein kinase C 저해하, antitumor activity신, antiviral activity크^ 등이 있다. 일부 탄닌의 역전사효소 저해활성은 Kakiuchi®*
및 Nishizawa 등 ^ 의 하 여 보고된바 있으며. 본 실험 에서는 천연에서 항바이러스 활성물질 탐색연구외 일환 으로 주로 대국과의 Euporbia 속 식물에서 분리된 탄닌 을 시료로 하여 retrovirus 의 RN A 가 DN A 로 복제하 는 과정에 관여하는 reverse transcriptase에 대한 저해 활성을 검색한 후 . 활성을 나타낸 시료에 대하여 in vi-
본 논문에 관한 문 의 는 이 저 자 에 게 로 (전 화) 042-860-4360 (팩 스) 042-860-4595
tro 에서 항바이러스 활성을 확인하기 위하여 HIV-1 외 복제 저 해 활성을 조사하였다.
실험방법
바이러스 및 세포 - 실험에 이용한 바이러스는 HIV-l/HTLV-IIIB(pSVC21) 의 nef gene 을 chlo- ramphenicol acetyltransferase (CAT) gene 으로 처환한 pHXB-CATl 을 사용하였다.®* 세포는 HIV-1 에 의해 syncytium 형성이 잘 이루어지는 CD4"" h u m an T cell line 인 supT l 을 이용하였다. 세포배양 배지는 10% fetal calf serum (FCS) 이 돌어간 R P M I 1640 을 이 용 하 였 다 .
시약 및 기기 - A M V reverse transcriptase는 Promega 에서 구입하였고. ['H]-TTP 는 N E N 제품 을 사용하였다. Polyadenylic acid 와 oligodeoxy- thymidylic acid 는 Pharmacia 에서 구입하였고. di-
2 \ 3'-dideoxy thym idine 5 -phosphate (AZT) l-O -galloyl-3, 6-(R)-H H D P-p-D -glucose (corilagin) 1, 2. 3-tri-0-galloyl-3, 6-(R)-H H D P-p-D -glucose
1. 2-di-0-galloyl-3, 6-(R )-H H D P -p시D-glucose (tercatain)
l-O-galloyl-2, 3-{R)-D H H D P-3, 6-(R)-H H D P-p-D -glucose (geraniin) m allotusinin
1-0-galloyl-2.3-(R)-D H H D P-3. 6-(R)-H H D P-p-D -glucose (elaeocarpusin) bixanin
putranjivain A acetonylgeraniin
3-0-galloy-l-2, 4 -(R )-D H H D P -l. 6-(-S)-HHDP-p^D-glucose (carpinusin) acetonylcarpinusin
acetonylhelioscopin A
2-0-galloyl-4, 6-(S)-HHDP-D-glucose (hippom anin A) gemin D
2, 3-(S)-H H D P-4. 6-(S)-HH D P-D-glucose (pedunculagin) 2, 3-di-0-galloyl-4. 6-{S)-HH DP-glucose ( 1-desgalloyleugeniin) 1, 2, 3-tri-0-galloyl-4, 6-(S)-HH D P-p-D -glucose (eugeniin) casuariin
2. 4-(S)-H H D P-3. 6-anhydromannofuranose rugosin E
excoecarianin m acaranganin
1. 6-(S)-H H D P-3~0-galloyl-2. 4-(S)-D H H D P-p-D -glucose (helioscopinin A) 1. 6-(S)-H HD P-3-O -galloy 1-4. 6-(S)-H H D P-p-D -glucose (helioscopinin 8) 1. 3-(S)-D H H D P-2-0-galloyl-4. 6-(S)-H H D P-p-D -glucose (euphorscopin) helioscopin A
jolkianin jo lkin in
terchebin supinanin
Vol. 39, No. 5, 1995
수종 탄닌외 역전사효소와 HIV-1 복제 저해활성 561
thiothreitol T T R ddTTP 등은 모두 Sigm a 제품을 사용하였다. Scintillation cocktail 로는 N E N 에서 pre-mixing 한 Econofluoi맹 를 사용하였으며. scin
tillation counter 로는 Beckman LS 6000LL analyzer 를 이용하였다.
시료의제조 - 실험에 사용한 탄닌 화합물은 주로 대 국과의 Euporbia 속 식물에서 분리된 화합물을 사용하 였다. 시료는 20 m g/m /의 농도가 되도록 D M S O 에 녹 여 stock solution을 제조하였다. Reverse transcri- ptase에 대한 저해활성을 측정하기 위해서는 최중농도 가 80, 20, 5, 1.25 |Xg/m/이 되도록 stock solution 을 증류수로 희석하여, 각 성분에 대한 저해활성을 측정하 였다. 세포득성의 측정과 syncytia forming assay 를 하기 위해서는 stock solution을 최중농도가 5, 2.5, 0.5. 0.25,0.05 ug/m lo] 되도록 R P M I 1640 m edi
u m 으로 희석하여 각 시료에 대한 세포득성과 syn- cytia 의 수를 counting 하였다.
Reverse transcriptase inhibition assay - 30중외
polyphenol 화함물들에 대하여 A M V ( a v ia n m y elo - brastosis virus) 의 reverse transcriptase 를 이용 하여 각 화합물의 in h ib itio n 정도를 측 정 하 였 으 며 . tem plate-prim er 로는 poly(rA)-oligo(dT)를 사 용 하였다 . 저해활성외 측정은 N a k a m u ra 둥^^이 기존에 쏘고 있던 방법을 Prom ega 사의 sta n d a rd assay condition 을 참고로 하여 최 중농도를 50 m M Tris- H C l (pH 8.3), 6 m M M g C l2, 1 m M dith io th re ito l, 40 m M K C l, 0.1 m M TTP. 5.0 g/m / p o ly (rA ), 0.02 U /m l oligo(dT)i2-i8, 5 [^H]~TTP, 0.1 m g/m / BSA, 3 U /m l reverse transcriptase 로 변 경하여 사용 하 였다. Reverse transcriptase l U 는 stan da rd assay condition 에서 37°C로 10분 간 반 웅시켰을 때 1 m M 외 dTTP가 acid insoluble form 으로 흔입 되도록 하는 enzym e의 양으로 하 였 다 . 반응 의 적정도를 확인하기 위하여 2',3'-dideoxyth- ymidine-5'-triphosphate 를 지표물질로 이용하였 으며 , 각 시료의 저해활성을 percentage로 계산하였
Table I— Inhibitory effects of ellagitannins against AM V reverse transcriptase
compound IC5o( 나 g /m /)
^ r o
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
W
^ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 0 E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E
c
^ 4- 4- 0
^ 0
^ 4- 0
^ 40 72
9 7 4 0 4 7 9 1 8 2 0 5 4
^
9
^
_ o-
1-
1- 4 - 7 -
2 - 0
^
o o
1- 9
^ 4 - 5 - 1 - 8 - 2 - 1 - 9
^ o 0
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o o _ 2
1
7
1
8 8 1 3
1
2
8 1 &
8
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AZT corilagin punicafolin tercatain geraniin mallotusinin elaeocarpusin bixanin putranjivain A acetonylgeraniin carpinusin hippomanin A gemin D pedunculagin 1-desgalloyleugeniin eugeniin
casuariin
2. 4-(S)-HHDP-3. 6- anhydromannofuranose rugosin E
excoecarianin macaranganin helioscopinin A helisocopinin B euphorscopin jolkianin
* aA)(a： number of large syncytia, b ： number of small syncytia)
#+ ： 25% death . + + ： 50% death of cell
다 .
세포독성검사 - 각 시료의 세포에 대한 득성을 검사 하기 위해 24-well 세포배양 plate 에 2.5x10=개의 supT l cell을 넣고, 단계별로 희석한 시료를 처리하여 3일 배양한 후 생존한 세포의 수를 계산하여 시료의 득 성여부를 판정하였다.
Syncytia forming inhibition assay - Reverse transcriptase 에 대하여 높은 저 해활성을 보인 화합물 들에 대하여 in vitro 에서 HIV-1 에 대한 직접적인 저해 활성을 즉정하기 위하여 syncytia forming in hibi
tion assay 를 실시하였다, 24 well 세포배양 plate에 2 .5 x l(/개의 supT l 과 50TCID5o(50%-tissue cul
ture infective dose) 의 HIV-1 그리고 단계벌로 희석 한 시료를 함께 처리한 뒤 3일 후에 HIV-1 에 의해 유도 된 syncytia 의 겟수를 측정하여 저해정도를 측정하였 으며 , control 로는 azidothymidine을 사용하였다. 세 포에 대한 득성은 적으면서 HIV-1 의 복제를 효과적으 로 저해하는 시료를 선벌하기 위하여 각각의 시료에 대 해 selective index (SI) 를 계산하였다.
Selective index(SI) =
50% cytotoxic dose in supTl cells (CC50) 50% inhibitory dose of syncytium formation CIC50)
결과 및 고찰
Reverse transcriptase는 virus의 R N A genome 을 DN A 로 복제하는 역할을 담당하는 효소로서 anti-- H IV drugs을 개발하는데 가장 매력적인 target으로 꾸준허 연구되어왔다. 지금까지 밝혀져 있는 reverse transcriptase 저해제로는 방선균에서 분리된 strep- tonigrin과 sakyomycin 해조류에서 분리된 sul- fated polysaccharides비. 고둥식물 유래외 ful- voplumierin^오\ salaspermic acid효크' 등외 많은 화합 물이 보고되었다. 최근 polyphenol 화합물이 다양한 생러활성을 나타내는 것에 착안하여 주로 대극과의 Fm- phorbia 속 식 물에 서 분리 한 30 중의 ellagitannin 류에
대하여 reverse transcriptase 저해 활성을 측정하여 본 결파 분자내에 hexahydroxydiphenoyl(HHDP) Table II ~ Cytotoxicity and inhibitory effects of syncytia formation of ellagitannins___________________________
syncytia formation
어 "삐 에 크 ^ ^ ^ ^ ~ 5 (ug/m/)
•ntrol
0 3 4 5 6 7 8 0
0 1 2 3 4 5 7
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 1 1 1 1 1
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2 2 2 2 0
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XI IX 1± 1± H 1-
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수종 탄닌외 역전사효소와 HIV-1 복제 저해활성
group 을 갖는 ellagitannin의 경우 거외 모든 시료에 서 높은 활성을 보였으며 분자량외 크기에 따른 (E2 0"
E22. E27은 dimeric ellagitannin) 뚜렷한 활성의 차 이는 없었다. 또 분자내에 H H D P 이외에 H H D P group의 산화형인 dehydrohexahydroxydiphenoyl (D H H D P ) group이 ascorbic acid, acetone 등과 같 은 acyl group과 coupling 하여 좀더 bulky 한 group 으로 번한 경우 활성 이 현저하게 저하되었다가 9<E4, E1KE10. E12<E23. E26<E23, E28<E4). El- lagitannine 류외 화함물이 reverse transcriptase에 대하여는 높은 활성을 보였으나 실제로 항바이러스 활 성을 측정해 본 걸과. geraniin(E4), m allotusinin (E5), elaeocarpusin(E6) , euphorscopin(E25) 와 jolkianin(E 27)등의 화함물이 각각 15.0, 13.0. 18.0, 12.0, 18.0 등외 높은 SI 값을 나타내면서 syncytia의 형성을 유외성있게 저해하였다. 일반적으로 식물 po- ly p h e n d 인 ta n n in 은 template primer-enzyme- nucleotide complex의 형성을 저해함으로 reverse transcriptase 저해 활성을 나타낸다고 보고되었다.®*
그러나 탄닌의 이러한 저해활성 m echanism 으로 인하 여 탄닌이 항 virus 활성을 나타낸다고는 생각되지 않 고 있으며, 탄닌외 항 virus 활성은 탄닌이 virion에 tight하게 걸합함으로 virus 와 cell 외 interaction을 방해하여 항 virus 활성을 나타낸다고 하며^^\ 특히 functional group을 많이 가진 high molecular weight ta n n in 이 nucleotide나 protein과 더 강력하 게 반응하여 항 virus 활성을 나타낸다고 알려져 있다.
최근 탄닌외 다양한 생리활성들이 계속 밝혀지고 있어 이 분야외 계속적인 연구가 기대된다.
결 론
대극과의 Euphorbia 속 식물로부터 분러된 30 여중의 ellagitannin돌에 대하여 A M V reverse transcrip
tase 저해활성과 H IV- 1 의 복제 저해활성을 측정하였 다. 대부분외 ellagitannin 외 경우 A M V reverse transcriptase 에 대하여 1.4^20.0 ug/m /외 낮은 농도 에서 ICso 치를 나타내었다. 분자내에 D H H D P group 이 다른 acyl group에 의 해 coupling 되 어 있는 화합물 외 경우 활성 이 현저하게 서 하되 었다. 높은 활성을 보인 ellagitannin돌에 대하여 세포득성과 syncytia 의 형성 저해 확성을 조사하여 본 결과 geraniin. m allotu
sinin, eiaeocarpusin. euphorscopin 과 jolkianin 등 의 화합물이 syncytia 의 형성을 저해함으로서 유외성 있는 HIV-1 외 복제 저해활성을 나타내었다.
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