Study on the nNOS Expression in the Rat Spinal Cord of the Spinal Nerve Ligation Model with Neuropathic Pain and the Dorsal Rhizotomy

척수신경 결찰 만성통증모델 및 후신경근 절단 백서의 척수에서 Neuronal Nitric Oxide Synthase(nNOS) 발현에 관한 연구

충남대학교 의과대학 신경외과학교실

염 진 영·김 윤

= Abstract =

Study on the nNOS Expression in the Rat Spinal Cord of the Spinal Nerve Ligation Model with Neuropathic Pain and the Dorsal Rhizotomy

Jin Young Youm, M.D., Youn Kim, M.D.

Department of Neurosurgery, College of Medicine, Chungnam National University, Taejeon, Korea

bjective： ： ：The NOS inhibitors exhibit antinociceptive activity in rat model of neuropathic pain. NOS activity ： increases in the dorsal root ganglia(DRG) in neurop-athic pain. However, NOS activity decreases in the do- rsal horn of spinal cord in the nerve injury models of neuropathic pain. To investigate whether the mechanism of decrease of NOS expression in the dorsal horn is related to a secondary effect resulting from increased NO pro- duction and likewise in the spinal DRG in the spinal nerve ligation model of neuropathic pain.

Methods： ： ：We conducted behavioral tests for neuropathic pain, and nNOS immunohistochemistry and NADPH- ： diaphorase histochemistry after tight ligation of the 5th lumbar(L5) and 6th lumbar(L6) spinal nerves and L5 dorsal rhizotomy.

Results： ： ： ：Typical neuropathic pain behaviors occurred 7 days after post-ligation in the neuropathic surgery group, but neuropathic pain behaviors in the dorsal rhizotomy group were absent or weak 7 days after post-operation. There was a decrease in the number of nNOS immunoreactive dorsal horn neurons on the both side(especially ipsilateral side) 7 days after post-ligation. The number of nNOS immunoreactive neurons in both side of the dorsal horn was not decreased 7 days after L5 dorsal rhizotomy.

Conclusion： ： ： ：These data indicate that the changes in the injured DRG is essential for development and maintenance of neuropathic pain, and mechanism of decrease of nNOS expression in the dorsal horn is a secondary effect aga- inst the changes in the DRG including increased NO production in the spinal nerve ligation model of neuropathic pain.

KEY WORDS：Neuropathic pain・Neuronal Nitric Oxide Synthase(nNOS)・Spinal nerve ligation・Dorsal rhizotomy.

서 론

말초신경이 손상을 받으면 자극을 하지 않아도 생기는 통 증(spontaneous burning pain), 과다통증(hyperalgesia) 및 정상적으로는 통증으로 느껴지지 않던 자극이 통증으로 변하여 느껴지는 이질통(allodynia)을 특징으로 하는 만성 통증 또는 신경병성통증(neuropathic pain)이 때때로 발생

한다

. 만성통증에 대한 기전을 밝히고자 여러 가지 동물 모델이 개발되어져

연구되고 있으나, 만성통증에 대한 기전이 확실하게 밝혀져 있지 않은 상태이다.

통증을 전달하는 구심성 신경이 활성화되면 척수신경세포 의 흥분성이 항진되는 현상을 중추감작(central sensitiza- tion)이라 하며, 중추감작은 신경 손상에 의한 통증 유발에 매우 중요한 기전으로 여겨지고 있다. 중추감작은 적어도 N-methyl-D-aspartic acid(NMDA) 수용체가 관여된다는

OOOO

증거가 많으며

, 만성통증 동물모델 실험에서도 NMDA 수 용체 차단제를 투여하면 만성통증이 감소되었다는 보고가 다 수 있다

. NMDA 수용체가 활성화되면 세포내로 Ca

의 유입이 증가되어 nitric oxide synthase (NOS)의 합성 이 증가되어서 nitric oxide(NO)의 생성이 유도되므로 NO 는 NMDA 수용체와 관계된 중추 감작에 관여한다고 알려 져 있다

. 만성 통증 모델쥐의 후근신경절(dorsal root ganglia, DRG)에서 NOS의 합성이 증가되며

, NOS 억 제제인 N-omega-nitro-L-arginine methyl ester(L- NAME)

는 만성통증을 완화시킨다는 사실이 밝혀졌다.

NO는 현재 신경생물학 분야에서 관심의 대상으로 다수의 학자들에 의해 연구되고 있는 물질로서 신경계에서는 특이 한 신경전달물질로 연접소포내에 저장되어 있지 않고 필요 시에 합성되어지며, NOS에 의해 L-arginine으로부터 만들 어진다. 또한, 이 NO는 신경독작용을 나타내어 신경질환에 서 중요성이 대두되고 있다. 최근들어 NOS의 세가지 아형 (isoforms)이 발견되고 그 유전자 및 아미노산 서열이 밝 혀졌다. 신경세포에 주로 존재하는 neuronal NOS(nNOS) 또는 brain NOS(bNOS), 혈관내피세포에 주로 존재하는 endothelial NOS(eNOS) 및 대식세포(macrophage), 성상 세포(astrocyte) 및 미세아교세포(microglia)등에 존재하는 inducible or immunological NOS(iNOS)가 있다

.

제5 및 제6요수신경을 결찰하는 만성통증 모델쥐의 DRG 에서 NOS 면역활성

및 NOS 활성

이 증가되며, 말초 축 삭 절단 후 백서 DRG에서 nNOS mRNA 발현이 현저히 증가된다

. 그러나 약리학적 연구결과를 종합해 볼 때 척 수신경 결찰 모델쥐 척수에서 nNOS 활성이 증가되리라는 예상과는 달리 척수신경을 결찰한 만성통증 모델쥐의 척수 에서는 결찰한 쪽은 물론 결찰하지 않은 반대쪽 모두 NOS 활성이 수술후 2주 또는 4주 후까지 감소되며, 이는 DRG 에서 NOS 발현의 현저한 증가에 대한 이차적인 negative feedback일 가능성을 제시하였다

. 또한, 최근에 Goff 등

은 좌골신경을 결찰한 후 28일 경과 후까지 결찰한 쪽의 척 수 후각(dorsal horn)에서 nNOS 면역활성 신경세포들이 감소된다고 보고하였다. 척수신경을 결찰한 만성통증 모델 쥐에서 만성통증이 발생한 후 후신경근(dorsal root)을 절 단(dorsal rhizotomy)하면 만성통증이 현저히 감소된다

. 이는 척수신경을 결찰하는 만성통증 모델쥐에서 DRG의 변 화가 만성통증의 유발과 유지에 중요한 역할을 하고 있음을 말해주며, 척수에서의 여러 가지 중추감작과 관련된 변화가 DRG의 신경세포에 의한 이차적인 변화로 여겨진다. 후신경 근을 절단하여 DRG 신경세포의 변화된 신호 특히 과다생 성된 NO가 후근을 경유하여 척수 후각으로 들어가는 경로

를 완전히 차단한 다음 척수내 nNOS 발현변화를 관찰함으 로써 DRG에서 NO 생성증가등의 변화가 척수의 nNOS 발 현감소에 관여하는지 파악할 수 있다.

본 연구에서는 척수신경을 결찰하는 만성통증 모델쥐의 척수에서 nNOS 발현이 감소하는지 확인하고 그 기전이 DRG에서 NO 생성증가등을 비롯한 변화에 대한 이차적인 반응과 관련되어 있는지를 규명하고자 하였다.

실험재료 및 방법

1. 실험동물 및 만성통증 모델 수술

실험동물로는 Sprague-Dawley 백서(150～200g)를 사 용하였다. 수술하지 않은 정상대조군(6마리), 만성통증수술군 (6마리), 후신경근절단군(5마리)으로 나누었다. 만성 통증 수 술은 Kim과 Chung

에 의해 이미 실시된 방법대로 시행하 였다. 간단히 설명하면, halothane과 N

O/O

를 1：2로 희석 한 혼합가스로 마취하에 왼쪽 5번째 요수(L5) 및 6번째요수 (L6) 신경을 노출시키고 6～0 silk 봉합사로 이들 요수신경 을 단단하게 결찰한 다음 상처부위를 봉합하여 놓았다.

2. 만성통증에 대한 행동검사

1) von Frey test를 이용한 mechanical allodynia 측정 Mechanical allodynia를 측정하기 위하여 L5 및 L6 척 수신경이 분포하는 뒷다리 발바닥의 물리적인 자극에 대한 반응도를 측정하였다. 백서를 금속그물로 바닥이 되어있는 위에 올려놓고 von Frey filament(24.5mN, 2.5g)로 발바 닥에 대었다. von Frey filament를 수술한 쪽과 수술하지 않은 쪽의 뒷다리 발바닥에 각각 10회 대어 다리를 갑자기 드는 회수를 기록하였다. 다리를 드는 빈도는 퍼센트로 나 타내었다(〔다리를 들은 회수÷총 시도횟수)×100 ).

2) Acetone test를 이용한 cold allodynia 측정

Cold allodynia를 측정하기 위하여 발바닥의 차가운 용액 에 대한 반응도를 측정하였다. 쥐를 mechanical allodynia 측정한 같은 장소에 넣어놓고 뒷다리의 발바닥에 acetone 을 대었다. Acetone은 5분 간격으로 5번 시행하였다. Ac- etone을 댄 다음 바로 발을 급작히 드는 회수를 기록하였다.

다리를 드는 빈도는 퍼센트로 나타내었다(〔다리를 들은 회 수÷총 시도횟수)×100 ).

3. 후신경근 절단(dorsal rhizotomy)

Halothane과 N

O/O

를 1：2로 희석한 혼합가스로 마취하

에, 미세현미경 시야에서 L4～5 수준에서 L4 및 L5의 부분

추궁절제술(partial hemilaminectomy)을 실시하였다. 왼쪽

L5 후근을 확인하고 경막을 절개한후 L5 후근을 절단하였다.

2～3mm 정도 후근을 제거한 다음 상처를 봉합하였다.

4. nNOS 면역조직화학염색 및 NADPH-diaphorase 조직 화학염색을 위한 조직준비

수술후 일주일 지난 쥐를 ether로 깊게 마취시킨 후 37℃ 식염수를 좌심실을 통하여 관류하여 혈액을 제거한 다음 0.1M phosphate buffer(pH 7.4)에 4% paraforma- ldehyde와 0.1% 포화 picric acid를 더한 고정액(4℃)으로 관류고정을 실시하였다. 관류고정이 끝나면 미세해부현미경 하에서 L5 척수를 확인하고 India ink로 좌측과 우측을 표 시한 후 적출하였다. 적출한 L5 척수는 같은 고정액에 24 시간동안 후고정한 후 0.1M phosphate buffered saline (PBS)에 30% sucrose를 더한 용액에 24시간 담가두었다.

Sucrose용액에 침지된 척수 조직은 cryostat로 30μm 두 께로 잘라 0.1M PBS가 있는 24-multiwell에 옮긴다음 염 색을 시행하였다.

5. nNOS에 대한 면역조직화학염색

조직에 존재하는 peroxidase를 제거하기 위하여 meth- anol에 1% H

O

를 넣은 용액에 30분간 반응시킨후 0.1M PBS에 3% normal goat serum(NGS), 1% bovine serum albumin(BSA) 및 0.3% Triton-X를 더한 용액에 반응시 킨 다음 0.1M PBS에 1% NGS, 1% BSA를 더한 용액으로 희석한 nNOS 항체(1：200, Santacruz)를 4℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 2차항체(Verterstain kit의 biotinylated anti-rabbit IgG를 1：200으로 일차항체에 사용한 동일한 용액에 희석)에 2시간 동안 실온에서 반응시키고, ABC reagent(Vecterstain kit)를 0.1M PBS에 1：100으로 희 석한 다음 2시간동안 실온에서 처리하였다. 발색제로는 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)를 사용 하였으며 0.1M PBS에 0.05% DAB와 0.02% H

O

를 더 하여 용액을 만들어 발색 반응시켰다. 발색 반응이 끝난 조 직은 증류수로 수세한 후 조직을 슬라이드에 붙인 다음 통 상적인 방법으로 봉입하였다.

6. NADPH-diaphorase 염색

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(NA- DPH)는 NO를 합성하는 기질중의 하나로 NADPH-dia- phorase 염색법이 개발되어져 NO를 생성하는 신경세포의 발현 연구에 널리 활용되어 왔다

. 그러나 신경조직에서 는 nNOS 뿐만 아니라 eNOS와 iNOS의 세가지 아형 모두 에 NADPH가 관여하므로

전반적인 NOS의 발현양상을 관찰할 수 있다.

면역조직화학 염색을 위한 척수 동결절편의 일부를 0.1M PBS로 수세후 0.1M PBS에 1mM β-NADPH, 0.1mM nitro blue terozolium chloride(NBT) 및 0.3% Triton X-100을 더한 용액에 37℃에서 1시간동안 반응시켰다.

반응이 끝난 조직은 증류수로 수세후 조직을 면역조직화학 염색시와 같은 방법으로 슬라이드에 붙인 후 NADPH- diaphorase 음성세포를 관찰하기 위하여 0.5% methyl green용액으로 대조염색을 한 다음 봉입하였다.

7. 자료분석

정상대조군, 만성통증수술군 및 후신경근절단군에서 측정 한 von Frey test 및 acetone test의 빈도 데이터를 각군 마다 평균치를 구하였다. 척수의 후각에서 nNOS에 양성반 응을 보이는 신경세포를 정상대조군, 만성통증수술군 및 후 신경근절단군 각각의 한 척수에서 잘린 조직 절편중 5～6 개를 무작위로 골라 ×100 현미경 시야에서 핵이 보이는 신경세포만을 계수하여 평균치를 구하였다. 각군간의 비교 는 Student’s t-test를 이용하였으며 통계적 유의수순은 p 값이 0.05 미만인 경우로 하였다.

결 과

1. Mechanical allodynia 측정결과

정상대조군에서는 von Frey filament를 발바닥에 접촉시 킬 경우 통증을 느껴 급격하게 발을 들어 발을 털거나 혀로 핥는 빈도는 5% 미만이었다(수술한 쪽：2.5±6.1%, 수술 하지 않은 쪽：1.7±4.1%). L5 및 L6 척수신경을 결찰한 군은 결찰한 쪽의 발을 드는 빈도는 46.7±12.1%로 정상 대조군 및 척수신경결찰군의 수술하지 않은 쪽보다 현저히 증가하였으며(p<0.01), 결찰하지 않은 쪽의 발을 드는 빈 도도 16.7±8.2%로 정상대조군보다 증가하였다(p<0.05).

후신경근절단군의 경우에는 후신경근을 절단한쪽은 12.0±

11.0%, 절단하지 않은 쪽은 8.0±7.6%로 von Frey fila- ment에 반응하여 발을 드는 빈도가 정상대조군보다 약간 높았으나 통계적 유의성은 없었으며 척수신경결찰군의 결찰 한 쪽보다는 감소되었다(p<0.01)(Fig. 1).

2. Cold allodynia 측정 결과

정상대조군에서는 acetone을 발바닥에 소량 묻혀서 발을

드는 빈도는 5% 미만이었다(수술한 쪽：4.2±6.6%, 수술

하지 않은 쪽：1.7±4.1%). 척수신경결찰군의 경우에는 결

찰한 쪽의 발을 드는 빈도는 51.7±24.8%로 정상대조군에

비해 증가되었으며(p<0.05), 결찰하지 않은 쪽의 발을 드

는 빈도도 13.3±24.2%로 정상대조군보다 높게 나타났다.

후신경근절단군은 후신경근을 절단한 쪽은 15.0±14.1%, 절단하지 않은 쪽은 10.0±7.9%로 정상대조군보다 약간 높았지만 통계적 유의성은 없었다. 그러나 병변쪽에서 척수 신경결찰군 보다 발을 드는 빈도가 통계적으로 유의성 있게 감소되었다(p<0.05)(Fig. 2).

3. NADPH-diaphorase 조직화학 및 nNOS 면역조직화학 소견

본 실험에서 정상대조군, 척수신경결찰군 및 후신경근절 단군 모두 척수의 ADPH-diaphorase 조직화학염색 및 nNOS 면역조직화학 염색 양상, 즉 발현부위 및 세포가 거 의 일치하였다(Fig. 4A-D). 이는 척수에서 발현되는 NOS 의 아형은 대부분 nNOS임을 말해주며 iNOS나 eNOS는 거의 발현되고 있지 않음을 알 수 있다. 본 연구에서는 이 두가지 염색법이 같은 결과를 보이므로 nNOS 면역조직화 학 염색의 결과만을 가지고 분석하였다.

척수에서 nNOS 면역활성은 주로 중심관(central canal) 을 중심으로 한 지역과(Fig. 4C,D), 후각의 lamina II(Fig.

4A,B)에 집중적으로 관찰되었으며, 전각(anterior horn)등 다른 부위에서는 거의 관찰되지 않았다. 후각과 전각과의 이행부위에 nNOS 양성세포들이 소규모로 군집을 이루고 있었으며(Fig. 4C), 이들 이행부위의 신경섬유와 후각의 nNOS 양성세포 신경섬유들이 중심관을 중심으로 하는 nNOS 양성세포들과 연결되어 있는 경우가 종종 관찰되었 다(Fig. 4A,C).

정상대조군은 척수 한 조직당 한 후각에서 약 20개(수술 한 쪽：19.7±2.3개, 수술하지 않은 쪽 20.3±2.6개)의 nNOS 면역활성세포가 관찰되었다(Fig. 5A,B). 척수신경결

찰군의 경우 결찰한 쪽의 후각(Fig. 6B)에서는 약 12.3±

3.7개의 nNOS 면역활성세포가 관찰되어 정상대조군보다 현저히 감소함을 알 수 있었다(p<0.01). 척수신경결찰군의 결찰하지 않은 쪽의 후각(Fig. 6A)에서는 nNOS 양성세포 수가 척수 한 절편당 약 16.2±3.0개로 정상대조군보다는 감소하였으나 척수신경을 결찰한 쪽의 nNOS 양성세포보다 는 그 수가 적었다(p<0.05). 후신경근절단군의 L5 척수 후 각(Fig. 7A,B)에서는 nNOS 양성세포수(수술한 쪽：17.0

±2.9개, 수술하지 않은 쪽：18.4±3.2개)가 정상대조군보 다 약간 감소하는 경향을 보였지만, 정상대조군 L5 척수 후 각의 nNOS 양성세포수와 유의한 차이가 없다. 그러나 척수 신경결찰군의 결찰한쪽 L5 척수 후각(Fig. 6B) nNOS 양성 세포수 보다는 유의하게 증가되었다(p<0.05)(Fig. 3).

Fig. 1. Frequencies of foot lifting for the von frey test in each

groups. Fig. 2. Frequencies of foot lifting for the acetone test in each

groups.

Fig. 3. The number of the nNOS immunoreactive cells in the

dorsal horn of spinal cord in each groups.

Fig. 4. A：nNOS immunoreactivity in the L5 dorsal horn of the contralateral side of the neuropathic surgery group. ×100. Most of nNOS positive cells present in the lamina II(LII)(PF, posterior funiculus). B：NADPH-diaphorase histochemical reactiv- ity in the L5 dorsal horn of the contralateral side of the neuropathic surgery group. ×100. Most of NADPH-diaphorase positive neurons present in the lamina II(LII)(PF, posterior funiculus). C： nNOS immunoreactivity around central canal(vacant arrow) and the lateral part of the transition area(arrow) between the L5 dorsal horn(DH) and ventral horn(VH) of the contralateral side of the neuropathic surgery group. ×200. The nerve fibers(arrow head)of the nNOS positive cells in the transition area and in the area between dorsal horn and central canal. D：NADPH-diaphorase histochemical reactivity around the L5 central canal(vacant arrow) of the contralateral side of the neuropathic surgery group(×200).

B B B B

C C C C A A A A

D

D D

D

Fig. 5. A：nNOS immunoreactivity in the L5 dorsal horn of the right side of the normal control group(×200). B：nNOS immuno- reactivity in the L5 dorsal horn of the left side of the normal control group(×200).

Fig. 6. A：nNOS immunoreactivity in the L5 dorsal horn of the contralateral side of the neuropathic surgery group(×200). B：

nNOS immunoreactivity in the L5 dorsal horn of the ipsilateral(ligated) side of the neuropathic surgery group(×200).

Fig. 7. A：nNOS immunoreactivity in the L5 dorsal horn of the contralateral side of the dorsal rhizotomy group(×200). B：

nNOS immunoreactivity in the dorsal horn of the ipsilateral(rhizotomized) side of the dorsal rhizotomy group(×200).

이상의 결과를 종합하면, 척수신경을 결찰하면 만성통증 이 잘 나타나지만 후신경근을 절단하면 만성통증이 잘 나타 나지 않으며, 척수에서의 nNOS 면역활성은 척수신경을 결 찰하면 감소되는데 결찰한 쪽이 현저히 감소되며, 후신경근 을 절단하면 척수에서의 nNOS 면역활성은 정상대조군과 차이가 없음을 알 수 있었다.

고 찰

L5 및 L6 척수신경을 결찰하면 결찰한 쪽의 뒷다리 발바 닥에서 과다통증 및 이질통(allodynia)가 잘 나타난다. L5 및 L6 척수신경을 결찰하고 von Frey test 및 acetone test를 실시하여 연구 보고된 결과

와 본 실험 성적간에는, 본 연 구에서 결찰한 쪽의 만성통증이 약간 약하게 나타난 점이 있지만 전반적으로 큰 차이는 없었다. 만성통증이 유발된 쥐에 L-NAME등 NOS 억제제를 투여하면 만성통증이 경

감되며

, L5 및 L6 척수신경을 결찰한 DRG에서 수술

한후 3일, 7일 및 14일째에 NOS 면역활성세포가 증가된 다

. 본 실험에서도 L5 및 L6 척수신경 결찰 후 7일후에 수술하지 않은 쪽의 DRG에서 nNOS 양성세포수는 정상대 조군과 차이가 없었으나, 결찰한 쪽의 DRG에서는 현저히 증가됨을 확인하였다. Formalin을 발에 주사하여 통증을 유발시켰을 경우에는 척수에서 NOS 활성이 증가된다는 사실

과 NOS 억제제를 이용한 행동검사나 전기생리학적 연구를 종합하면 척수신경을 결찰하는 만성통증 모델쥐 척 수에서도 NOS 활성이 증가될 것이라는 예상이 된다. 그러 나, 예상과는 달리 NOS 활성 또는 nNOS 면역활성세포수 가 척수신경을 결찰한 만성통증 모델에서는 감소된다고 보 고되었고, 본 연구에서도 척수 후각 lamina II에서 nNOS 양성세포수가 감소하였다. 본 연구에서는 수술한쪽과 수술 하지 않은 쪽 모두 nNOS 양성세포 수가 감소하였으며 특 히 수술한쪽의 후각에서 현저하게 감소하였다(Fig. 3, 6A, 6B). 수술하지 않은 쪽의 후각에서 nNOS 면역활성세포 수 가 감소했다는 사실은 수술하지 않은 쪽의 nNOS 활성이 수술한 쪽으로부터 영향을 받았음을 말해주며, 수술하지 않 은 쪽에 만성통증이 나타날 수 있음을 보여준다. 본 연구에 서 후각이나 후각과 전각의 이행부위에서 nNOS 양성세포 들이 중심관 주변에 있는 nNOS 양성세포들과 연결되어 있 는 것이 관찰되었다(Fig. 4C). 이는 본 실험에서 결찰하지 않은 쪽의 발바닥에서도 일부 만성통증이 나타나며, 척수신 경결찰군에서 결찰하지 않은 쪽의 척수 후각에서도 nNOS 발현이 감소되는데 관여될 것으로 본다. Formalin 주사에 의한 염증성 통증의 경우에서는 척수신경을 결찰하는 만성

통증 모델과는 달리 척수에서 nNOS 양성세포가 증가하므 로 이 두가지 통증의 기전이 다를 것임을 보여준다.

Choi

등은 L5 및 L6 척수신경을 결찰하는 만성통증 모 델 척수에서 NOS 활성이 감소된다고 보고하면서 DRG에서 NOS 발현의 증가에 대한 이차적인 negative feedback과 관련될 것이라고 제시하는데 그쳤다. 본 연구에서는 이를 입 증하기 위하여 후신경근절단을 실시하고 척수에서의 nNOS 발현양상과 만성통증의 변화양상을 관찰하였다. L5 후신경 근절단 후에는 von Frey test나 acetone test에 반응을 나 타나는 쥐가 있었지만 척수신경을 결찰한 군의 결찰한 쪽보 다는 유의성 있게 만성통증이 감소하였다. L5 후신경근 절 단 후에 L5 척수 후각에서는 nNOS 면역활성세포수가 척 수신경을 결찰한 군의 결찰한 쪽 척수에서 보다 증가하여 정상대조군과 유의한 차이가 없었다(Fig. 3). 그러나, L5 후 신경근 절단시 인접한 L4 후신경근이나 L6 후신경근이 수 술시 접촉에 의한 직접적인 자극이나 염증 또는 L4 후신경 근 및 L6 후신경근에 분포하는 혈관 손상등에 의해 일부 L4 및 L6 척수가 중추감작이 일어나 L4, L5 및 L6 척수신 경이 분포하는 뒷다리 발바닥에 만성통증이 일부 유발된 것 으로 보인다(Fig 1, 2). 또한, L4 및 L6 척수신경의 말단은 일부 L5 척수로 들어가기 때문에 L4 및 L6 척수신경에 의 해 L5에서의 nNOS 발현이 정상대조군보다는 약간 감소하 는 경향을 보인 것으로 추정된다(Fig. 3).

본 연구의 목적은 L5 DRG로부터 L5 척수로 들어가는 신호, 특히 nNOS의 증가된 발현에 의한 NO 생성증가를 차단하여 L5 척수에서의 nNOS 발현양상의 변화를 관찰하 는 것으로 DRG에서 nNOS의 증가등의 DRG내 발현변화 신호가 척수로 들어가지 않으면 척수 후각에서 nNOS 발현 이 감소하지 않음을 확인하였다. 그러나, 척수신경을 결찰한 후 DRG에서 변화하는 물질을 NOS 이외에도 α-아드레날 린성 수용체

, prostaglandin

, sodium 및 calcium cha- nnel

, neuropeptide Y

, galanin

, calcitonin ge-ne- related peptide

, substance P

, dynorphin

등이 알려 져 있다. DRG에서 이들의 변화가 척수에서의 nNOS 발현 변화에 직접적 또는 간접적으로 영향은 미칠 가능성이 있 다. 따라서, 척수신경을 결찰한 만성통증모델 척수 후각에 서 nNOS의 발현이 감소한 것은 DRG에서의 NO 과다생성 에 대한 이차적인 negative feedback으로 여겨지지만, DRG내 NO 이외의 다른 물질등의 변화가 척수내 nNOS 감소를 유발했을 가능성에 대해서도 연구가 필요하다.

지금까지 만성통증에 대한 연구들은 척수

에 대한

것이 많다. 이는 만성통증의 유발과 유지에 중추감작이 중

요한 역할을 하기 때문이다. 그러나, 본 연구결과는 중추감

작 또는 만성통증이 손상받은 DRG의 변화 신호가 척수 후 각으로 들어가지 않으면 나타날 수 없음을 보여준다. 이와 같이 손상받은 DRG의 변화가 만성통증의 유발과 유지에 결정적인 역할을 하므로, 앞으로의 만성통증 연구에서는 척수 뿐만 아니라 DRG의 변화양상에 대한 심도있는 연구 가 요구된다.

결 론

말초신경이 손상되면 때때로 만성통증이 발생하는데 NOS 억제제를 투여하면 통증이 경감된다. 만성통증 동물모델 DRG에서 NOS 활성이 증가된다. 그렇지만, 척수신경 결찰 만성통증 모델 척수 후각에서 NOS 활성은 감소한다. 본 연 구는 척수신경 결찰 만성통증 모델 척수 후각에서 NOS 발 현이 감소하는 기전이 DRG에서의 NO 생성증가등에 대한 이차적인 변화인지를 규명하기 위하여 제5 및 제6 요수신 경을 결찰하여 만성통증 모델을 만들고 만성통증에 대한 행동검사 및 nNOS에 대한 면역조직화학염색과 NADPH- diaphorase 조직화학염색을 시행하였으며, 후신경근 절단 후 척수 후각에서의 nNOS 발현양상을 비교 관찰하였다.

본 연구의 결과를 요약하면 다음과 같다.

1) 척수신경을 결찰한 후 만 7일째에 전형적인 만성통증 이 결찰한 쪽에 나타났지만, 후신경근을 절단한 군은 만성 통증이 잘 나타나지 않았다.

2) L5 및 L6 척수신경을 결찰한 후 7일 경과 후 L5 척 수 후각 양쪽 모두 nNOS 면 역활성을 나타내는 신경세포 수가 감소하였으며 척수신경을 결찰한 쪽에서 현저 하게 감 소하였다.

3) L5 후신경근 절단후 7일 경과 후 L5 척수 후각에서 는 nNOS 양성세포수가 통계 학적으로 유의하게 감소하지 않아 정상대조군과 유사하였다.

결론적으로 척수신경 결찰 만성통증 모델쥐 DRG에서의 변화가 만성통증의 유발과 유지에 결정적인 역할을 하며, 만성통증 모델쥐 척수 후각에서 nNOS 발현감소가 나타났 고, 그 감소 기전은 DRG에서 NO 과다생성등의 변화가 후 신경근을 통하여 척수에 이차적인 영향을 주었기 때문으로 보여진다.

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