Microbial Community Analysis Isolated from Red Starfish (Certonardoa semiregularis) Gut

Microbial Community Analysis Isolated from Red Starfish (Certonardoa semiregularis) Gut

Hae-Ri Lee, So-Hyun Park, Dong-Hwi Kim, Kyung-Mi Moon and Moon-Soo Heo*

Department of Marine Life Sciences, Jeju National University, Jeju 63243, Korea Received April 13, 2018 /Revised April 27, 2018 /Accepted April 27, 2018

Although much research has focused on various bioactive substances in starfish, research on micro- organisms isolated from starfish is lacking as compared with other natural products. In this study, we investigated bacterial communities in the gut of red starfish (Certonardoa semiregularis) in Jeju Island. In total, 103 bacterial strains were isolated using marine agar and R2A medium. The isolated strains were analyzed and identified using the 16S rRNA gene sequence. Based on an analysis of this gene sequence, the 103 isolated bacteria were classified into four major groups: Proteobacteria (93%:

Alpha-proteobacteria, 24.8%; Beta-proteobacteria, 4%; Gammaproteobacteria, 65%) Bacteroidetes (4%), Actinobacteria (2%), and Firmicutes (1%). In addition, the isolates were divided into seven classes (Actinobacteria, Flavobacteria, Bacilli, Sphingobacteria, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, and Gammaproteobacteria), 15 orders, 19 families, and 24 genera. A phylogenetic analysis revealed two strains, Lysobacter sp. and Pedobacter sp., with similarity of 97.55% and 97.58%, respectively. As the similarity in the 16S rRNA gene sequence was 98% or less compared to previously identified bacteria, the two strains may possibly be classified as a new genus or species. We suggest that additional stud- ies, including biochemical and morphological tests, should be performed to identify the new candidate strains.

Key words : 16S rRNA, Certonardoa semiregularis, gene sequence, marine bacteria, microbial community

*Corresponding author

*Tel : +82-64-754-3473, Fax : +82-64-756-3493

*E-mail : [email protected]

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Journal of Life Science 2018 Vol. 28. No. 8. 955~961 DOI : https://doi.org/10.5352/JLS.2018.28.8.955

서 론

해양환경에 서식하는 수많은 해양미생물과 해양생물은 육 상에 서식하는 미생물 및 생물과는 다른 독특한 생리활성 물 질을 생산한다[5, 25, 26]. 이러한 이유로 해양 미생물과 해양생 물을 활용한 천연화합물에 관한 많은 연구가 이루어졌다. 해 양으로부터 분리된 Pseudomonas sp., Bacillus sp., Acinetobacter sp. 등으로부터 유래된 생리활성물질이 유해미생물인 Escherichia coli, Candida albicans 등에 대하여 항균활성 및 항진균 활성을 나타낸다는 연구 결과가 있다[2, 15]. 또한 해수로부터 분리한 Pseudoaltermonas sp.가 항생제 내성균인 MRSA (Methicillin resistant Staphylococcus aureus)에 대하여 항균 활성을 나타내 는 페놀계 물질을 생성한다고 보고되었다[18]. 또한 해양 및 강 하구에서 분리된 Pseudomonas sp.는 어류의 바이러스성 질 병의 원인인 IHNV (Infectious Hematopoietic Necrosis Virus) 와 Herpesvirus (HSV-1)에 효과가 있다고 알려져 있다[19, 27].

이 외에도 해조류인 Turbinaria ornata로부터 추출한 Polysac-

charide는 항산화 및 항염증에 관한 효능이 입증되었다[3]. 이 처럼 해양 미생물 및 이차대사산물을 이용한 화합물이 최근 항생제 오남용으로 인한 내성균의 출현이 문제가 됨에 따라 천연 항생제 개발의 주요 공급원으로 주목 받고 있다[6, 16].

무척추동물 중 불가사리는 극피동물로 해양의 다양한 위치

에 서식하고 있으며 대부분의 불가사리는 강한 번식력과 재생

력을 갖고 있다. 그 중 본 연구에 사용된 빨강불가사리(Certo-

nardoa semiregularis)는 연변목(Valvatida)에 속하고 한국, 일

본, 말레이시아, 필리핀 등의 아열대성 지역에 주로 분포하며

일반적으로 수심 5~15 m 정도의 조하대 암반지역에서 서식한

다. 불가사리와 해면과 같은 해양 무척추동물의 세포 외 또는

세포 내에는 다양한 미생물이 서식하는 것으로 알려져 있다[9,

22]. 불가사리에 관한 천연물 연구에 따르면 불가사리로부터

추출한 Cerebroside 및 polyhydroxylated steroidal glyco-

sides가 세포 사멸을 유도하여 암세포의 증식을 억제한다[4,

13]. 또한 불가사리의 체액 추출물이 B세포의 증식, IgM과 IgG

의 생산을 유도하고 대식세포의 활성화 등 면역세포에 생성에

영향을 미치는 것으로 보고되었다[8]. 이외에도 불가사리로부

터 추출한 Asterosaponins의 항염증작용과 Polysaccharide가

항산화제로서의 라디칼 소거능력과 알츠하이머와 같은 신경

퇴행성 질환에 대하여 신경 보호 활성을 나타내어 새로운 약

물로서의 잠재적 가능성을 보여주었다[36, 40]. 이렇듯 최근

불가사리를 이용하여 다양한 생리활성을 나타내는 물질에 관

한 천연물 연구가 비교적 많이 진행 되어 있을 뿐만 아니라

Vibrio harveyi Streptococcus mutans Vibrio vulnificus Listeria monocytogens

KCTC 12724 KCCM 40105 KCCM 41665 KCCM 40307

24℃

37℃

30℃

37℃

및 질병세균에 대한 항균활성에 대하여 조사하고자 한다.

재료 및 방법

시료채집 및 균주 분리

본 연구에 사용 된 빨강불가사리(Certonardoa semiregularis) 는 제주도 서귀포시 우도에서 채집하였다. 채집한 불가사리는 멸균된 인공해수로 세척한 후, 멸균된 핀셋과 가위를 사용하 여 내장을 잘라내어 멸균한 0.85% 생리식염수에 넣어 균질화 시켰다. 균질화 된 시료는 원액부터 10

까지 연속희석법으로 희석하여 Marine Agar (MA, Difco., USA)배지와 R2A Agar (Difco., USA) 배지에 도말하여 25℃에서 일주일간 배양하였 다. 크기, 모양, 색깔 등의 형태적 특징에 따라 각 배지에서 자라난 colony를 재계대 하여 순수분리 하였다. 분리한 균주는 20%(v/v) glycerol을 사용하여 -80℃에 동결 보관하였다[21].

분리 균주의 DNA추출 및 PCR

2.5% Chelex (Chelex ® 100 Molecular Biology Grade Resin, BIO-RAD, USA)를 이용하여 분리된 균주에서 DNA를 추출하였다. 분리된 균주를 2.5% Chelex에 넣고 95℃에서 5분 간 반응시켜 4℃에 냉장 보관한 후 본 실험에 사용하였다.

분리된 균주들의 유전자 증폭을 위한 PCR은 27 forward (5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`) primer와 1,522 reverse (5`-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3`) primer를 사용하였 다. AccuPower

PCR Pre-Mix (Bioneer, USA)에 DNA 1 μl를 첨가한 후 최종 부피를 25 μl로 맞추어 PCR을 진행하였다.

PCR은 initial denaturation 5분, 94℃에서 denaturation 1분, 55℃에서 annealing 1분, 72℃에서 extension 1분을 30 cycle을 반복 수행한 후 72℃에서 final extension을 10분간 PCR (Base for Gene Pro Thermal cycler, BIOER., USA) 수행하였다. 증폭 된 PCR product는 1% agarose gel (SeaKem® LE., USA)을 사용하여 전기영동(MUpid®-ex, ADVANCE., USA)을 통하 여 확인하였다.

분리균주의 항균활성 탐색

본 연구에 사용된 인체유해세균과 어류질병세균은 미생물 자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)와 한 국 미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorgan- isms, KCCM)에서 분양 받고 25%(v/v) glycerol을 이용하여 stock화 시켜 -80℃에서 보관하여 사용하였다. 유해세균들은

각각의 배지에 배양하였고(Table 1), 분리된 균주는 각각 Marine Broth (MB, Difco., USA)와 R2A Broth (Difco., USA) 배지에 접종시켜 25℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양한 균 주의 상등액 100 μl를 멸균된 8 mm paper disc (ADVANTEC., Japan)에 분주하여 25℃에서 24시간 동안 건조시켰다. 또한 유해세균들은 MacFarland turbidity를 0.4로 조절하고 Muller Hinton Agar (MHA, Difco., USA)에 도말하여 8 mm paper disc를 일정간격으로 올려 배양 온도에 따라 48시간 배양시킨 후 8 mm paper disc주위에 억제환의 형성 유무를 확인하였다 [28].

염기서열 분석 및 계통학적 분석

증폭시킨 염기서열은 (주)솔젠트(Daejeon., Korea)에 분석 의뢰 하였고, 분석한 염기서열을 EzBioCloud (https://www.

ezbiocloud.net/) 및 NCBI (National Center Biotechnology Information)를 이용해 염기서열을 비교하여 가장 가까운 속 또는 종을 확인하였다. Mega 6.0 software [32]에 포함된 Clustal X 프로그램[37]을 사용하여 본 연구에서 확인된 염기 서열과 EzBioCloud에서 나타난 염기서열의 multiple align- ment정렬을 수행 한 후 neighbor-joining phylogenetic tree를 작성하였고, 신뢰성을 평가하기 위해 1,000회 bootstrap하여 계통수를 작성하였다[29, 31].

결과 및 고찰

염기서열 분석 및 계통학적 분석

빨강불가사리의 내장으로부터 총 103균주를 분리하였다.

분리된 균주는 EzBiocloud와 NCBI를 이용하여 16S rRNA 유 전자의 유사한 염기서열을 비교 분석한 후 계통수를 작성하였 다(Fig. 1).

빨강불가사리에서 분리된 103 균주는 4문 24속 41종으로

동정되었다. 표준균주와의 염기서열과 비교하였을 때, Proteo-

bacteria 그룹에 속하는 균주 중 Lysobacer 속은 98%의 이하의

낮은 상동성을 나타내었다. 이 외에 Amphritea sp., Arenimonas

sp., Erythromicrobium sp., Limnobacter sp., Loktanella sp.,

Sphingomonas sp. 6개의 속은 98%의 상동성을 나타내었으며,

Fig. 1. Phylogenetic tree based on comparison of the 16S rRNA gene sequences of bacteria isolated from Certonardoa semiregularis

and some other related taxa. GenBank accession numbers are given in parentheses. Bootstrap values (>50%) based on 1,000

replications are shown. Bar 0.05 nucleotide substitutions per nucleotide position.

Fig. 2. Pie-diagram showing structure and the diversity of bacte- rial community of Certonardoa semiregularis.

Fig. 3. Pie-diagram showing various genera of bacterial isolates from Certonardoa semiregularis.

균주는 Aquimarina sp., Mesonia sp., Pedobacter sp.가 각각 기존 의 염기서열과 98%, 99%, 97~98%의 상동성을, Actinobacteria 그룹에 속한 Kocuria sp.는 99%의 상동성을 나타내었고, Firmicutes 그룹의 Paenibacillus sp. 또한 99%의 상동성이 확인 되었다. 이와 같이 16S rRNA 유전자의 염기서열을 비교 분석 한 결과 103개의 균주 중 Proteobacteria (Gamma-proteobacteria) 에 속하는 균주인 RSM43은 Lysobacter spongiicola DSM21749

와 97.55%의 유사도를 나타내었고, Bacteroidetes 문에 속하는 균주인 RSR20은 Pedobacter panaciterrae Gsoil 042

와 97.58%의 상동성을 보여주었다. 분리된 RSM43, RSR20 균주가 대조균 주와의 유전자 염기서열이 98% 이하의 상동성을 보였으므로 새로운 속 또는 종의 후보 균주로서의 가능성을 나타낸다. 이 에 향후 표준 균주와 함께 형태학적, 생리학적, 생화학적 등의 신종 실험을 진행해야 할 것으로 사료된다.

16S rRNA 유전자 염기서열을 통하여 세균 군집의 다양성 을 분석한 결과, 빨강불가사리의 세균 군집 구조는 Proteobac- teria (Alpha-proteobacteria, Beta-proteobacteria, Gamma- proteo- bacteria), Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes로 총 4개의 문 (Phylum), 8개의 강(Class), 15개 목(Order), 19개의 과(Family) 와 24개의 속(Genus)으로 구성되었다. 본 연구에서 Proteobac- teria 96%, Bacteroidetes 3.9%, Actinobacteria 1.9%, Firmicutes 1% 로 4개의 그룹이 확인되었으며 Proteobacteria 문이 우점도 가 가장 높은 것으로 나타났다. 이는 대부분의 해양 생태계에 서 다른 분류군에 비해 Proteobacteria와 Bacteroidetes 분류군이 우점한다는 결과와 일치한다[1, 14](Fig. 2). 그 중 Proteobacteria 문의 Alpha-proteobacteria 강에서는 4목 5과 8속, Beta-proteobac- teria강은 1목 2과 2속으로 비교적 제한적이었고 Gamma-pro- teobacteria 강의 경우 6개의 목, 8개의 과, 9개의 속 등의 분류군 으로 나타났다(Table 2).

빨강불가사리의 분류군은 Pseudomonas sp.가 23.8%로 가장 우점하고, Psychrobacter sp.와 Rheinheimera sp.가 각각 10.5%, Kiloniella sp.가 6.7%, Cobetia sp. 5.7%, Erythrobacter sp., Pseudoalteromonas sp., Vibrio sp가 각각 4.8%를 차지하였고, Brevundimonas sp.는 3.8%, Sulfitobacter sp., Limnobacter sp.가 각각 3%, Amphritea sp., Kocuria sp., Paracoccus sp., Pedobacter sp., Erythromicrobium sp.이 각각 2%, Sphingomonas sp., Aquimarina sp., Arenimonas sp., Hydrogenophaga sp., Loktanella sp., Lysobacter sp., Mesonia sp., Penibacillus sp.가 각각 1%의 비율로 총 24개의 속으로 구성된다(Fig. 3).

이전에 연구되었던 아무르 불가사리 관련 연구에서 분리된

장내 미생물[10] 29 균주 중에서 동일한 균주인 Psychrobacter

sp., Paracoccus sp., Erythrobacter sp., Kocuria sp.를 제외하면

본 연구에서 더 다양한 균주가 분리 되었다. 불가사리의 장내

세균군집과 내장 세균군집에 있어 서식하는 미생물의 차이는

환경적 요인, 종, 채집지역, 실험환경, 배양조건 등에 따라 세

균군집이 달라질 수 있다고 사료된다[12, 23, 24].

Table 2. Bacterial diversity associated with Certonardoa semiregularis

Phylum Class Order Family Genus No

Proteobacteria

Alphaproteobacteria

Caulobacterales Sphingomonadales

Kiloniellales Rhodobacterales

Caulobacteraceae Erythrobacteraceae

Sphingomonadaceae Kiloniellaceae Rhodobacteraceae

Brevundimonas Erythrobacter Erythromicrobium

Sphingomonas Kiloniella Loktanella Paracoccus Sulfitobacter

4 5 2 1 7 1 2 3 Betaproteobacteria Burkholderiales Comamonadaceae

Burkholderiaceae

Hydrogenophaga Limnobacter

1 3

Gammaproteobacteria

Alteromonadales Chromatiales Oceanospirillales

Pseudoalteromonadaceae Chromatiaceae Oceanospirillaceae

Halomonadaceae

Pseudoalteromonas Rheinheimera

Amphritea Cobetia

5 11

2 6 Pseudomonadales

Vibrionales Xanthomonadales

Pseudomonadaceae Moraxellaceae

Vibrionaceae Xanthomonadaceae

Pseudomonas Psychrobacter

Vibrio Arenimonas

Lysobacter

26 11 4 1 1

Bacteroidetes Flavobacteria Flavobacteriales Flavobacteriaceae Aquimarina

Mesonia

1 1

Sphingobacteriia Sphingobacteriales Sphingobacteriaceae Pedobacter 2

Actinobacteria Actinobacteria Micrococcales Micrococcaceae Kocuria 2

Firmicutes Bacilli Bacillales Paenibacillaceae Paenibacillus 1

Total 103

분리균주의 항균활성 탐색

빨강불가사리로부터 분리한 균주들의 항균활성 탐색 결과, 본 연구에서는 항균활성이 나타나지 않았다(자료미제시). 그 러나 분리된 균주들 중 Lysobacter sp.의 균주들은 일반적으로 미생물을 용해시키는 능력을 갖고 식물과 관련된 질환을 억제 하는 것으로 알려져 있다[17]. 이외에도 곰팡이 포자 용해[30]

및 MRSA, Streptococci, Clostridia 등과 같은 그람 양성균에 대 하여 Vancomycin보다 활성이 더 높다는 연구 결과가 있다[7, 20]. 또한 Paenibacillus sp.의 경우 이전의 연구에 따르면 그람 양성균 및 그람 음성균, 진균류 등에 대하여 억제 가능한 다양 한 이차 대사산물을 생산하고 넓은 항균 범위를 갖는 것으로 알려져 있으며, Paenibacillus polymyxa로부터 분리한 항생물질 들은 대부분 펩타이드계로 polymixin A, B, E, jolipeptins, ga- tavalin, gacaserin 등은 그람 음성균 및 그람 양성균에 대하여 활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다[11, 39]. 이렇듯 같은 속이라 할지라도 종, 배양 조건, 환경, 실험 방법 등에 따라 특성이 다르게 나타날 수 있을 것이라 사료된다.

불가사리를 이용하여 항암[33, 34], 항산화[38], 항염증[35]

등 생리활성을 나타내는 물질들에 대한 연구는 많이 진행 되 어 있으나 불가사리로부터 분리한 미생물의 군집구조나 항균 효과와 같은 기초 연구는 아직 미비한 실정이다. 따라서 이에

따라 본 연구가 기초 자료로 활용할 수 있을 것이라 생각된다.

감사의 글

본 논문은 정부의 재원으로 한국 연구재단의 지원을 받아 수행된 지역 신 산업 선도인력양성사업과 중견연구사업의 성 과임(2016H1D5A1911152 & 2017R1A2B4005688).

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초록：빨강불가사리(

)에서 분리된 세균의 군집구조 분석

이해리․박소현․김동휘․문경미․허문수*

(제주대학교 해양생명과학과)

불가사리를 이용하여 다양한 생리활성에 대한 연구가 많이 진행되었지만, 다른 천연물 연구에 비해 불가사리로 부터 분리한 미생물에 대한 연구는 부족하다. 이에 본 연구에서는 제주도에서 채집한 극피동물인 빨강불가사리 (Certonardoa semiregularis)의 내장으로부터 Marine Agar와 R2A를 이용하여 총 103개의 균주를 분리하여 세균군 집에 대해 조사하였다. 분리된 균주들은 16S rRNA유전자를 이용하여 염기서열을 분석 및 동정하였다. 그 결과 주요 계통군은 Proteobacteria (Alpha-proteobacteria 24%, Beta-proteobacteria 4%, Gamma-proteobacteria 65%) 93%, Bacteroidetes 4%, Actinobacteria 2%, Firmicutes 1%로 4개의 문이 확인되었고, 7개의 강(Actinobacteria, Flavobacteria, Bacilli, Sphingobacteria, Alpha-proteobacteria, Beta-proteobacteria, Gamma-proteobacteria), 15개의 목, 19개의 과, 24속이 관찰되었다. 또한 계통 분석 결과 2개의 균주(Lysobacter sp., Pedobacter sp.)가 각각 97.55%, 97.58%로 상동성이 98% 이하로 나타나 새로운 속 또는 종으로 분류될 가능성이 있다고 여겨지며, 표준 균주와 함께 신종 후보 균주에 대한 생화학적, 형태학적 등의 추가적인 신종실험을 향후 진행해야 할 것으로 사료 된다.

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