뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 감별을 위한 Duplex RT-PCR법 개발
김지예1․이현정2․장 일2․이희수2․윤성준3․박지성3․설재구3․ 김승환3․홍지무3․Zillian Wang4․Hualei Liu4․최강석2,†
1
농림축산검역본부 동물약품평가과,
2농림축산검역본부 조류질병과,
3㈜인트론바이오테크놀로지,
4중국 동물보건역학센터
Development of a Duplex RT-PCR Assay for the Simultaneous Detection and Discrimination of Avirulent and Virulent Newcastle Disease Virus (NDV)
Ji-Ye Kim1, Hyun-Jeong Lee2, Il Jang2, Hee-Soo Lee2, Seung-Jun Yoon3, Ji-Sung Park3, Jae-Goo Seol3, Seung-Han Kim3, Ji-Mu Hong3, Zillian Wang4, Hualei Liu4 and Kang-Seuk Choi2,†
1
Veterinary Drugs and Biologics Division, Gimcheon 39660, Korea
2
Avian Disease Research Division, Animal and Plant Quarantine Agency, Gimcheon 39660, Korea
3
iNtRON Biotechnology, Seongnam 13202, Korea
4
China Animal Health and Epidemiology Center, China
ABSTRACT A duplex RT-PCR (dRT-PCR) assay was developed for the simultaneous detection and discrimination of non- virulent and virulent Newcastle disease virus (NDV) in a single PCR tube. Primers targeting the large polymerase protein (L) gene and the fusion protein (F) gene of NDV were designed to detect all NDVs (by common type PCR primers) and virulent NDVs (by pathotype PCR primers), respectively and evaluated experimentally with reference NDV strains and other poultry viral pathogens. PCR products of the expected size of 386 bp were amplified from all NDV samples whereas PCR products of the expected size of 229 bp were amplified from virulent NDV samples alone. Cross reaction was not observed with other avian viral pathogens. The detection limit of NDV by the dRT-PCR was estimated to be 10
350% egg infectious dose/0.1 mL. In the dRT-PCR using field isolates of NDV, the pathotype PCR primers detected specifically all of virulent field isolates of NDV from Malaysia, Pakistan and China whereas common type PCR primers detected 94.4% (51/54) of field isolates of NDV from China. Three Chinese NDV isolates with false negative result were non-virulent viruses. Our results indicate that the dRT-PCR might provide a rapid and simple tool for rapid simultaneous detection and discrimination of non-virulent and virulent NDVs. Therefore the developed dRT-PCR assay provides a powerful novel means for the rapid diagnosis of Newcastle disease.
(Key words: Newcastle disease, diagnosis, pathotyping, duplex RT-PCR)
†
To whom correspondence should be addressed : [email protected]
서 론
뉴캣슬병(Newcastle disease; ND)은 전 세계 대부분 지역 ( 특히 아시아와 아프리카)에서 발생하는 닭의 악성 전염병 으로, 양계산업에 막대한 피해를 입히고 있다. ND가 발생한 양계농장의 경우, 감염 닭 대부분은 특별한 증상 없이 급사 하는 지만, 일부 개체에서는 호흡기 증상(콧물, 기침 등)과 소화기 증상(녹색 설사 등)을 보이며, 회복된 개체에서는 사 경(torticolis) 등 특징적인 신경 증상이 관찰된다. 또한 산란 중인 산란계 및 종계의 경우, 산란율 급감 또는 산란중지, 이
상란 발생 등 임상증상이 관찰된다.
뉴캣슬병 바이러스(Newcastle disease virus; NDV)는 Pa-
ramyxoviridae 과 Avulavirus속 avian paramyxovirus(APMV)
이다. 현재 APMV는 최소 15개 이상의 혈청형이 존재하는 것
으로 알려져 있다(Lee et al., 2017). NDV는 APMV 1형(APMV-
1)에 속한다(Mayo, 2002). NDV 게놈은 single-stranded nega-
tive sense RNA로 15,186 내지 15,198의 핵산으로 구성되어
있다(Miller et al., 2010). NDV는 nucleocapsid(N), phospho
(P), matirx(M), fusion(F), hemagglutinin neuraminidase(HN),
large polymerase(L) 등 6개의 구조단백질을 가지고 있다. 이
중 F와 HN 단백질은 바이러스 외피(envelope)를 구성하는 주 요 당단백질(glycoprotein)로, 숙주 세포 수용체와 결합, 세포 막과의 융합, 숙주 세포 내 침투 등 세포감염과 관련된 일련 의 과정에 관여한다. L 단백질은 RNA의존성 RNA polyme- rase 로 바이러스 복제에 중요한 기능을 한다(Yu et al., 2017).
NDV 유전형(genotype)은 F 유전자 염기서열에 기초한 계 통분석법(phylogenetic analysis)에 의해 class I과 calss II로 크게 구분하며, class II는 다시 현재까지 최소한 16개 이상의 유전형(유전형 I 내지 XVI)으로 존재하고 있다(Diel et al., 2012).
Class I은 주로 야생조류와 재래시장의 닭과 오리류 등에서 주로 분리되며, 닭에서 병증을 유발하지 않는다(Kim et al., 2007; Liu et al., 2007; Zhu et al., 2014). Class II의 경우, 유 전형 I과 II NDV 분리주 대부분은 닭에서 병원성이 거의 없 으며, 나머지 class II 유전형의 대부분은 중간독형 이상의 높 은 병원성을 가지고 있다(Muller et al., 2009).
NDV는 분리주에 따라 닭에서 다양한 병원성을 가지며, 닭에서의 병원성 정도에 따라 강독형(velogenic), 중간독형 (mesogenic), 약독형(lentogenic NDV), 무독형(asymptomatic) 등으로 분류한다(Catolli et al., 2011). NDV의 병원성을 측정 하는 고전적인 방법으로는 계태아 평균 치사시간(mean death time; MDT), 1일령 SPF 병아리에서의 뇌 내 병원성지수(in- tracerebral pathogencity index; ICPI), 6 주령 SPF 닭에서의 정 맥 내 병원성지수(intravenous pathogenicity index; IVPI) 등 이 있다. 분자생물학적 방법으로 NDV의 F단백질 분절부위 (112 번부터 117번 아미노산 부위) 아미노산 서열 분석법이 있다. 즉, 112번부터 116번 아미노산 부위에 연속된 염기성 아미노산과 117번 아미노산이 phenylalanine(F)으로 구성되 어 있을 경우, 중간독 이상의 병원성 NDV로 판정하며, 그렇 지 않을 경우, 비병원성(약독형 또는 무독형) NDV로 판정한 다(Hines and Miller, 2012).
현재 세계동물보건기구(World Organisation for Animal Health) 는 중간독형 이상의 병원성 NDV에 의한 가금류의 감 염을 ND 발생으로 간주한다. 최근 분자유전학적 기법의 발 달로, 병원성 NDV F단백질 분절부위의 특징적인 염기서열 을 기초로 하여 병원성 NDV 분리주를 감별하는 다양한 유 전자 진단법들이 개발되고 있다(Aldous et al., 2001; Antal et al., 2007; Fuller et al., 2009; Fuller et al., 2010; Kwon et al., 2006; Pham et al., 2005; Tiwari et al., 2004). 특히, NDV 검 출 및 병원성 감별 진단(Fuller et al., 2009; Kwon et al., 2006), 또는 NDV와 다른 가금바이러스 병원체 감별 진단을 위한 다 양한 RT-PCR 또는 실시간 RT-PCR 검사법들이 개발되고 있 다(Farkas et al., 2007; Malik et al., 2004; Tang et al., 2012).
현재 국내 병성감정 실시기관에서 적용하고 있는 RT-PCR 상용키트의 경우, NDV class II 유전형 VI형에 해당하는 병 원성 NDV인 비둘기 파라믹소바이러스(pigeon paramyxovi- rus; PPMV) 와 비병원성 class I NDV를 검출하지 못하는 한 계가 있었다. 따라서 본 연구에서는 기존의 RT-PCR 상용키 트의 한계를 극복하고, 단일 PCR 튜브에서 NDV 검출 및 병 원성 감별을 동시에 수행할 수 있는 duplex RT-PCR(dRT- PCR) 검사법을 개발하고, NDV 검출 민감도, 특이도 및 진 단검사 유효성을 평가하였다.
재료 및 방법
1. 공시바이러스
본 연구에서 사용한 공시 바이러스는 Table 1에서 보는 바 와 같다. NDV의 경우, 비병원성 6종(H1700, DK01/06, Ulster- 2C, NDRL0901, LaSota, VG/GA), 병원성 5종(Herts33, KJW/
49, Kr005/00, KN3/2011, Pak/A-1/2016)을 사용하였다. 또한 다른 APMV 혈청형 4종(APMV-4, APMV-6,APMV-9, APMV- 15), H9N2 조류인플루엔자 바이러스(avian influenza virus;
AIV), 전염성F낭병 바이러스(infectious bursal disease virus;
IBDV), 조류메타뉴모 바이러스(Avian metapneumovirus; A- MPV) 도 사용하였다. 이들 병원체는 농림축산검역본부 뉴캣 슬병 OIE reference laboratory에서 보관하고 있는 바이러스 들이다.
2. PCR Primer 제작
Table 2에서 보는 바와 같이, primer 세트를 제작하기 위 하여 GenBank에 등재되어 있는 NDV 14개 스트레인과 다 른 7개 APMV 혈청형의 각 대표 스트레인의 유전정보를 사 용하였다. NDV의 경우, 비병원성 스트레인 7종과 병원성 스 트레인 7종을 사용하였다.
3. Duplex RT-PCR
바이러스 시료로부터 RNA 핵산 추출은 LiliF
TMPGS DNA/
RNA Extraction Kit (iNtRON biotechnology, 대한민국)를 사 용하여, 제조사 권장방법에 의거하여 실시하였다. 본 연구에 서 합성한 PCR primer들을 각각 7 pM이 첨가하여 제작한 RT-PCR premix PCR tube(iNtRON biotechnology) 에 DNase/
RNase free water 18 µL 및 상기 추출 RNA 2 µL를 첨가하였 다. 이때 음성 대조용 PCR tube에는 DNase/RNase free water 20 µL를 첨가하였다. 그 후 45℃, 30분간 반응시킨 후 94℃
5분 반응시켰다. 그 후 94℃ 30초(denaturation)와 56℃ 1분
Table 1. NDV strains and other viruses used in the study Virus
1)Strain Class
(genotype)
F cleavage
site Pathotype
2)APMV-1 (NDV)
H1700 I ERQER ↓L a
DK01/06 I ERQER ↓L a
Ulster2C II(1) GKQGR ↓L a
NDRL0901 II(I) GKQGR ↓L a
LaSota II(II) GRQGR ↓L l
VG/GA II(II) GRQGR ↓L l
Herts33 II(III) RRQRR ↓F v
KJW/49 II(IV) RRQRR ↓F v
Kr005/00 II(VIId) RRQKR ↓F v
KN3/2011 II(VIIh) RRRKR ↓F v
PAK/A-1/2016 II(VIIi) RRQKR ↓F v
APMV-4 CMS23105 DIQPR ↓F a
APMV-6 WBR63FS IPEPR ↓L a
APMV-9 CSM36105 IREGR ↓I a
APMV-15 UPO216 LVQAR ↓L a
AIV(H9N2) MS96 - -
APMV SC1509 - -
IBDV SH92 - -
1)
APMV: avian paramyxovirus, IBV: infectious bronchitis virus, IBDV: infectious bursal disease virus, AIV(H9N2): avian influ- enza virus (H9N2), AMPV: avian metapneumovirus, IBDV: in- fectious bursal disease virus.
2)
a: asymptomatic, l: lentogenic, m: mesogenic, v: velogenic.
(annealing 및 extension)을 1 사이클로 하여 40회 반복 실시 하여 RT-PCR을 실시하였다. PCR 반응산물에 대하여 ethi- dium bromide 가 포함된 1.5% 아가로스 겔을 사용하여 전기 영동을 실시하여 NDV 유전자 특이 밴드의 증폭 여부를 확 인하였다.
4. NDV 검출효능 비교 평가
본 연구에서 개발한 dRT-PCR을 사용하여 NDV 공통항원 검출과 병원성 NDV 감별 효능을 평가하였다. 이를 위하여 NDV 8 종(비병원성 4종 및 병원성 4종)을 사용하였다. 본 연 구에서 개발한 dRT-PCR의 특이성 평가를 위하여 다른 APMV 혈청형 4종(APMV-4, APMV-6, APMV-9, APMV-15)과 다
른 가금병원체 3종(AIV, APMV, IBDV)을 사용하였다. 또한, 동일 시료에 대하여 현재 국내 병성감정실시기관에서 사용 하고 있는 기존 RT-PCR 상용키트(iNtRON biotechnology)를 사용하여 제조사의 권장방법대로 검사를 실시하고, 그 결과를 dRT-PCR 검사 결과와 비교하였다.
5. NDV 검출한계 측정
개발된 dRT-PCR의 NDV 검출능력 한계를 측정하기 위하 여, NDV Kr005/00 스트레인을 사용하였다. 실험에 사용된 바이러스 0.1 mL당 10
850% egg infective dose(EID
50)되게 바이러스 역가를 조정하여 사용하였다. NDV 바이러스 원액 을 0.01M phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)로 10배씩 단계 희석한 바이러스액을 상기의 방법에 따라 duplex RT- PCR을 실시하였다. 그 후 전기영동을 실시하여 NDV특이 유전자 증폭 여부를 확인하였다.
6. NDV 국외분리주 시료 적용 평가
현재 뉴캣슬병 발생국에서 분리된 NDV 양성시료를 대상 으로 본 연구에서 개발한 dRT-PCR의 야외시료에 대한 검출 효능을 조사하기 위하여 검사하였다. 효능 평가에 사용된 NDV 양성시료로 말레이시아 NDV 양성시료 14점, 파키스 탄 NDV 양성시료 3점, 중국 NDV 양성시료 54점이 사용하 였다. 말레이시아 및 파키스탄 유래 NDV 양성시료는 대한민 국 농림축산검역본부 뉴캣슬병 OIE reference laboratory에 서 강독형 및 유전형을, 중국유래 NDV 양성시료는 중국 동 물보건역학센터(China Animal Health and Epidemiology Cen- ter; CAHEC) 뉴캣슬병 OIE reference laboratory에서 병원성 형, 유전형을 최종 진단한 것이다.
결 과
1. NDV 검출 및 병원성 감별용 PCR Primer 세트 제작
NDV 공통항원 검출 및 병원성 감별을 동시에 수행하기
위한 dRT-PCR 검사법을 개발하기 위하여 Fig. 1에서 보는
바와 같이 2종의 primer 세트를 각각 제작하였다. NDV공통
항원 검출용 common type primer 세트는 모든 NDV를 검출
하기 위한 용도로 제작하였으며, NDV 스트레인 간 유전자
변동성이 적은 L유전자를 primer 합성 부위로 선정하였다. 그
결과, NDV SF2 스트레인(accession no. KF306265) 기준 게
놈의 9,428에서 9,450번째에 해당하는 L 유전자 염기서열(5’-
YCARGCAGCTGAGATGTTRTG) 을 포함하는 forward pri-
Table 2. Sequence information of NDV strains used for PCR primer design in the study
Virus Strain Class (genotype) Pathotype
1)Accession no.
APMV-1 (NDV)
Pigeon/China/Qinghai-01/2014 I a KT223818
Ch-ZJ-10-03 I a JN688863.1
Chicken/N. Ireland/Ulster/67 II(I) a AY562991
DK13 II(I) a KT186351
V4 II(I) a JX524203
LaSota II(II) l JF950510.1
Mallard/US(MN)/MN00-39/2000 II(X) a GQ288392.1
Mukestwar II(III) m JF950509.1
anhinga/U.S.(Fl)/44083/93 II(V) v AY562986.1
PPMV-1/pigeon/IE/806/04 II(V) v JN986839
SF2 II(VII) v KF306265
Chicken/CP/Pakistan/2010 II(VII) v JN682211.1
QH1 II(VIII) v FJ751918.1
GD450/2011 II(XII) v KC152048.1
APMV-2 Chicken/California/Yucaipa/56 EU338414
APMV-3 Turkey/Wisconsin/68 EU782025.1
APMV-4 Duck/Hongkong/D3/75 FJ177514.1
APMV-5 Budgerigar/Kunitachi/74 GU206351.1
APMV-6 Red-necked stint/JP/8KS0813/08 AB759118.1
APMV-7 Dove/Tennessee/4/74 FJ231524.1
APMV-8 Goose/Delaware/1053/76 FJ619036.1
1)
a: asymptomatic, l: lentogenic, m: mesogenic, v: velogenic.
mer 를, 게놈의 9,794에서 9,811번째에 해당하는 L 유전자 염 기서열(5‘-ACA TGT GCG ATT GCC TTG TC-3')을 reverse primer(5‘-ACATGTGCG ATTGCCTTGTC-3') 를 합성하여 386 bp의 유전자가 증폭되도록 primer set를 합성하였다. NDV 병 원성 감별용 patho-type primer 세트는 비병원성 스트레인과 병원성 스트레인 간 유전적 차이가 존재하는 F유전자 분절 부위 유전자 염기서열을 포함하도록 primer 합성 부위로 선 정하였다. 그 결과, NDV SF2 스트레인(accession no. KF30- 6265) 기준 게놈의 4,883에서 4,901번째에 해당하는 F 유전 자 염기서열(5‘- AGGAGACAGAAACGCT TTA-3')을 포함 하는 forward primer를, 게놈의 5,085에서 5,106번째에 해당 하는 F 유전자 염기서열(5‘-ACA AAC TGT TGC ATC TTC CCA A-3')을 포함하는 reverse primer를 합성하여 229 bp의 유전자가 증폭되도록 primer 세트를 제작하였다. Fig. 2는 dRT-
PCR 을 실시하기 위하여 합성한 NDV 공통항원 검출용 primer set 와 병원성 NDV 감별용 primer set를 도식화하여 나타낸 것이다. 즉, 모든 NDV의 경우 L 유전자 표적 primer 세트에 의해 386 bp의 PCR증폭산물이, 병원성 NDV는 386 bp의 PCR 산물과 함께 F유전자 표적 primer 세트에 의해 229 bp의 PCR 증폭산물도 검출되도록 dRT-PCR을 개발하였다.
2. Duplex RT-PCR에 의한 NDV 검출 및 병원성 감별 효능 평가
본 연구에서 개발한 dRT-PCR 검사법으로 NDV 검출 및
병원성 감별이 가능한 지를 조사하고, 현재 국내 병성감정 실
시기관에서 적용 중인 기존 RT-PCR 상용키트와 비교 평가
하였다. Fig. 2(A)에서 보는 바와 같이, 본 연구의 dRT-PCR
법을 실시하여 전기영동법으로 특이 유전자 증폭 여부를 검
(A)
(B)
Fig. 1. Schematic diagram of duplexRT-PCR (A) and sequences of PCR primer sets used (B).
Common type (for all NDVs) and pathotype-specific primer sets (for virulent NDVs only) were designed based on the sequences of L and F genes of NDV, respectively.
사했을 때 NDV의 유전형과 관계없이 NDV 스트레인 11종 모두 특이적인 PCR 증폭 band(386 bp)가 관찰되었다. 이 결 과는 본 연구의 dRT-PCR법을 적용했을 때 common type PCR primers가 NDV 공통항원을 모두 검출할 수 있음을 나타낸다.
한편, 병원성 NDV를 특이적으로 증폭하여 병원성 NDV를 감 별할 수 있는 지를 조사한 결과, NDV의 유전형과 관계없이 병원성 NDV스트레인 5종(Herts33, KJW/49, KN3/2011, Kr- 005/00, PAK/A-1/2016) 모두에서 229 bp의 유전자가 증폭되 었다. 그러나 비병원성 NDV 스트레인 6종(H1700, DK01/06, Ulster2C, NDRL0901, LaSota, VG/GA) 에서는 229 bp의 증 폭산물이 관찰되지 않았다. 이 결과는 본 연구의 dRT-PCR법 을 적용했을 때, patho-type PCR primers가 병원성 NDV스트 레인을 감별만을 감별해 낼 수 있음을 나타낸다. 또한, 기존 RT-PCR상용키트의 경우, NDV 공통항원을 검출하는 common type primers(증폭 크기 379 bp)를 사용했을 때 검사한 NDV 11종 중 class I에 해당하는 NDV 스트레인 2종(DK01/06, H- 1700)을 검출하지 못했다[Fig 2(B) left]. 병원성 NDV를 검 출하는 pathotype primers(증폭크기 204 bp)를 사용했을 때 병원성 NDV 5종 모두 검출하였다[Fig 2(B) right].
3. Duplex RT-PCR의 NDV 검출 특이성 평가 본 연구의 dRT-PCR 검사법을 적용했을 때 사용한 PCR primers가 NDV 스트레인을 특이적으로 검출하는 지 여부를 조사하였다. 본 연구의 dRT-PCR법으로 조사한 결과, 4개의 다른 APMV 혈청형(APMV-4, APMV-6, APMV-9, APMV- 15)과 다른 가금 병원체 3종(APMV, H9N2 AIV, IBDV) 모 두에서 PCR 특이 band(386 bp, 229 bp)가 관찰되지 않았다 [Fig. 3(A)]. 그러므로 우리의 결과는 dRT-PCR 검사법이 NDV 만 특이적으로 검출하고, 동시에 병원성 여부를 감별할 수 있 음을 말해 준다. 또한, 기존 RT-PCR 상용키트의 경우, co- mmon type primers(증폭 크기 379 bp)를 사용했을 때 APMV- 15에 대하여 양성 band가 관찰되었다[Fig. 3(B) left]. 그러나 나머지 바이러스에서는 379 bp의 증폭밴드가 관찰되지 않았 다. 병원성 NDV를 검출하는 pathotype primers(증폭크기 204 bp)를 사용했을 때 특이밴드가 관찰되지 않았다[Fig. 3(B) right]. 우리의 결과는 RT-PCR 상용키트가 APMV-15에 대하 여 비특이 반응을 나타냄을 알 수 있었다.
4. Duplex RT-PCR의 NDV 검출한계
(A)
(B)
Fig. 2. Detection and pathotyping of NDV strains by duplex RT-PCR (A) and a currently available RT-PCR kit (B).
M: molecular marker, lane 1: LaSota, lane 2: VG/GA, lane 3: Ulster2C, lane 4: NDRL0901, lane 5: DK01/06, lane 6: H1700, lane 7:
KJW/49, lane 8: Herts33, lane 9: Kr005/00, lane 10: KN3/2011, lane 11: PAK/A-1/2016.
(A)
(B)
Fig. 3. Specificity of duplex RT-PCR and a currently available RT-PCR kit (B).
M: molecular marker, lane 1: NDV (Kr005/00), lane 2: APMV-4, lane 3: APMV-6, lane 4: APMV-9, lane 5: APMV-15, lane 6: AMPV, lane 7: AIV(H9N2), lane 8: IBDV, lane 9: negative control.
본 연구에서 개발한 dRT-PCR 검사법의 NDV 검출 가능 농도를 측정하였다. NDV 검출 한계를 측정하기 위하여 병 원성 NDV Kr005/00 스트레인을 사용하였다. 바이러스 원액
(10
8EID
50/0.1 mL) 을 10진 희석한 다음, 각 희석액을 대상으
로 dRT-PCR검사법으로 NDV 유전자가 증폭되어 검출되는
지 여부를 조사하였다. Fig. 4에서 보는 바와 같이, NDV 공통
Fig. 5. Detection and pathotyping of field isolates of NDV from Malaysia (A) and Pakistan (B) by duplex RT-PCR.
M: molecular marker, lanes 1 ∼14: virulent NDV positive samples from Malaysia, P: NDV LaSota, lanes 15∼17: virulent NDV positive samples from Pakistan.
Fig. 4. Detection limit of duplex RT-PCR NDV using common and pathotype primer sets. Virulent NDV (Kr005/00 strain) was used as reference virus.
M: molecular marker, lane 1: 10
8EID
50, lane 2: 10
7EID
50, lane 3:
10
6EID
50, lane 4: 10
5EID
50, lane 5: 10
4EID
50, lane 6: 10
3EID
50, lane 7: 10
2EID
50, lane 8: negative control.
항원을 검출하는 common type primers는 바이러스 원액을 10
—5배 희석한 농도까지 NDV 유전자(386 bp)를 검출할 수 있었다. 병원성 NDV를 감별 검출하는 patho-type primers의 경우에도 바이러스 원액을 10
—5배 희석한 농도까지 NDV 유 전자(229 bp)를 검출할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 개발 한 dRT-PCR 검사법에 의한 NDV 검출용 common type pri- mer 및 병원성 NDV 검출용 patho-type primer 모두 NDV 검 출 민감도는 약 10
3.0EID
50/0.1 mL로 평가되었다.
5. NDV 발생국가 유행 NDV 시료에 대한 적용 본 연구에서 개발한 dRT-PCR 검사법이 실제 ND 발생국 가에서 유행하는 NDV를 검출하고, 동시에 병원성을 감별할 수 있는 지 조사하였다. 이를 위하여 말레이시아 및 파키스 탄에서 분리된 NDV 양성 시료를 사용하였다. 이들 야외 시 료는 대한민국 농림축산검역본부 뉴캣슬병 OIE reference la- boratory에서 모두 class II 유전형 VII형 NDV 양성으로 판
정한 사례였다(data not shown). 말레이시아의 14개 ND 발 생 양계농장유래 NDV양성시료의 경우, 모두 386 bp와 229 bp 의 NDV 유전자가 동시에 검출되었다(Fig. 5). 파키스탄 ND 발생양계농장 유래 2개 농장(P 및 A 농장) 유래 양성 시 료에서도 dRT-PCR 검사법은 모두 386 bp와 229 bp의 NDV 유전자를 동시에 검출하였다(Fig. 5). 이 결과로 볼 때, 개발 된 dRT-PCR 검사법이 아시아 ND 발생지역에서 유행하는 강 독형 NDV를 효과적으로 진단할 수 있음을 말해준다.
한편, dRT-PCR 검사법이 야외 시료에서 다양한 유전형의 NDV를 검출하고, 병원성을 감별할 수 있는지를 평가하였다.
이를 위하여, 중국 CAHEC 뉴캣슬병 OIE reference labora- tory에서 보유하고 있는 중국에서 분리된 총 54점의 NDV 양 성시료를 사용하였다. Table 3에서 보는 바와 같이, NDV 양 성 야외시료의 94.4%(51/55)에서 NDV 양성반응(386 bp)을 나타내었다. 이 중 NDV를 검출하지 못했던 3점의 양성시료 는 비병원성(약독형 및 무독형) NDV에 속하는 야외시료로 서, class I NDV 야외분리주 2점과 class II 유전형 II형 야외 주 1점이었다. 한편, 강독형 NDV 야외시료(class II 유전형 VI 형 및 VII형)의 경우 모두 386 bp 및 229 bp의 NDV 유전자가 검출되어 dRT-PCR 검사법에 의해서도 모두 병원성 NDV로 판정되었다.
고 찰
ND 는 전염성이 강하고 치사율이 높아, 일단 발병하면 양
계 산업에 심각한 경제적 피해를 초래할 수 있다. 그러므로
의심축 사례가 발생할 경우, 병원성 NDV를 신속 정확하게
진단하여 조기에 방역조치를 취할 수 있도록 하는 것은 ND
의 확산을 방지하는 데 필수적이다. 그러므로 양계 농장에
서 광범위하게 사용하는 NDV 생독 백신과 중간독 이상의
병원성 NDV 야외 분리주를 신속하게 감별 진단하는 것은 질
Table 3. Test result of dRT-PCR assay using field isolates of NDV from China
NDV genotype No. NDV tested
1)Result by dRT-PCR
Class Gentoype NDV Virulent NDV NDV Virulent NDV
Class I 17 0 15 0
Class II
I 17 0 16 0
II 5 0 5 0
VI
2)6 6 6 6
VII 9 9 9 9
Total 54 15 51 (94.4%) 15 (100.0%)
1)
All test results were previously confirmed by OIE reference laboratory for Newcastle disease, China Animal Health and Epidemiology Center (CAHEC), China.
2)
Pigeon paramyxovirus (PPMV) isolates.
병 확산을 차단하는 데 매우 중요하다.
수의 분야에서 분자생물학적 기법이 질병진단에 광범위 하게 적용되기 전에는 바이러스 분리 동정 후 병원성 분석 등을 통해 ND를 진단하였다. 이러한 방법은 수 주의 진단 기간이 소요되는 문제가 있었다. 최근 들어 RT-PCR, 실시간 RT-PCR 등 유전자 진단법이 질병 진단에 광범위하게 적용 되면서, 병원성 NDV를 수 시간 이내에 신속하게 검출할 수 있게 되었다(Hines and Miller, 2012). 그럼에도 불구하고, 기 존 진단법은 몇 가지 측면에서 극복해야 할 한계를 가지고 있는 것도 사실이다(Catolli et al., 2012).
본 연구에서는 기존 유전자 진단법이 가지는 일부 한계점 을 개선하고자 dRT-PCR법을 개발했다. 기존 유전자 진단법 은 NDV 공통항원 검출과 병원성 감별 검사를 각각 별도로 검사하여 판정하도록 개발되었다(Creelan et al., 2002; Kwon et al., 2006). 이 경우, 유전자 진단검사 과정에서 검체 시료 간 교차 오염이 일어날 가능성을 증가시킨다. 그래서 본 연 구에서 개발한 dRT-PCR법은 NDV 공통항원 검출과 병원성 감별을 하나의 PCR tube에서 동시에 실시하도록 하여, 검사 과정의 용이성을 증가시키고, 시료의 교차오염 가능성을 최 소화할 수 있도록 하였다.
2000 년대 들어서면서 class I NDV 등 신종 유전형 바이 러스들이 보고되기 시작하면서 기존 유전자 진단법들이 일부 NDV 유전형을 검출하지 못하는 한계를 나타내기 시작했다 (Catolli et al., 2011; Fuller et al., 2009; Kim et al., 2007;
Muller et al., 2015; Miller et al., 2010; Seal et al., 1995; Zhu et al., 2011). 현재 개발된 유전자 진단법의 상당수는 바이러 스 스트레인 간 변동성이 큰 F유전자를 포함한 부위를 표적 부위로 삼고 있다(Aldous et al., 2001; Antal et al., 2007;
Fuller et al., 2009; Kwon et al., 2006; Pham et al., 2005; Ti- wari et al., 2004). 현재 국내에서 ND 병성감정용으로 사용 중인 RT-PCR 상용키트의 경우에도 F유전자룰 공통항원 표 적부위로 사용하고, 사례로, class I NDV 분리주와 비둘기유 래 병원성 NDV(class II 유전형 VI형)를 검출하지 못하는 한 계를 가지고 있다. 특히, 병원성 NDV 분리주의 경우, 일부 라도 검출하지 못하게 되면 진단 오류 또는 진단 지연으로 인하여 ND확산을 조기에 차단하기 위한 방역 조치가 지연 되어 경제적 피해를 확대시킬 수 있는 위험성이 있다.
최근 NDV 스트레인 간 유전적 변동성이 적은 M 또는 L 유전자 부위를 표적부위로 유전자 진단법을 개발하고자 하는 시도가 있어왔다(Fuller et al., 2010; Mia Kim et al., 2008).
본 연구에서도 NDV 게놈의 F유전자 부위 대신 L유전자를 공통항원 검출 표적 부위로 선정하여 평가한 결과, class I NDV 분리주와 class II 유전형 VI형(중국 PPMV 분리주)을 효과적으로 검출할 수 있게 되어, NDV 검출 효능이 기존 유전자 진단법에 비해 개선되었다. 그럼에도 불구하고, 중국 현지평가에서 class I 바이러스 일부(2/17)와 calss II 유전형 I 바이러스 일부(1/17)에서 NDV 공통항원을 검출하지 못했 다. 이 결과는 dRT-PCR법에 적용된 common PCR primers 가 유전자 염기서열 차이 발생으로 인하여 이들 바이러스의 L 유전자 표적 부위를 인식하지 못하거나, 검사 시료 내 바 이러스 함량이 검출한계 이하로 존재하여 검출하지 못했을 가능성 등으로 인해 발생한 것으로 판단된다. 만약 전자의 경우라면, 프라이머 염기서열을 보다 정교하게 설계하여 이 러한 한계를 추가적으로 개선할 필요가 있다.
중요하게도, 본 연구의 dRT-PCR검사법은 중국, 말레이시
아, 파키스탄 지역에서 유행하고 있는 병원성 NDV 분리주
를 모두 감별 진단하였다. 특히 국내 사용 중인 유전자검사 키트가 검출하지 못했던 PPMV 분리주(class II 유전형 VI형 중국 분리주)을 효과적으로 검출할 수 있게 된 점은 PPMV 각 국내 유입될 경우 신속 진단하여 조기에 방역조치를 취 하는 데 크게 기여할 것으로 판단된다.
적 요
본 연구에서 NDV의 L유전자와 F유전자를 표적 부위로 각각 제작한 primer 세트를 사용함으로써 하나의 PCR 튜브 에서 NDV 검출(386 bp의 증폭 크기)과 함께 병원성 NDV (229 bp의 증폭 크기)를 동시에 감별 증폭할 수 있는 dRT- PCR 검사법을 개발하였다. 개발된 dRT-PCR검사법은 NDV 를 특이적으로 검출하고, 병원성을 감별하였다. 특히 국내 병 성감정 실시기관에서 적용 중인 기존의 RT-PCR 상용키트 에서는 검출하지 못하는 class I NDV과 PPMV(class II 유전 형 VI형)을 NDV를 검출함과 동시에 병원성 NDV도 감별 가능하였다. 개발된 dRT-PCR 검사법의 검출 민감도는 약 10
3.0EID
50/0.1 mL로 평가되었다. 또한 ND발생국의 야외 시 료에 적용했을 때, NDV 공통항원 검출율은 94.4%였으며, 병 원성 NDV 검출율은 100%이었다. 그러므로 본 연구에서 개 발한 dRT-PCR 검사법은 의심축 사례에서 ND를 신속 정확하 게 진단하는 데 유용할 진단 방법을 제공할 수 있을 것으로 판단된다.
사 사
본 연구는 농림축산검역본부의 농림축산검역검사기술개 발사업(과제번호: M-1543084-2016-16-01)의 일환으로 수행 되었다. 말레이시아 Universiti Putramalaysia의 Dr. Abdul Rah- man Omar와 Dr. Sheau Wei Tan은 말레이시아 NDV 양성시 료를 친절하게 제공하였다.
REFERENCES
