제 7 회 바이러스 확립방법의 이해 및 인간 뼈 형성촉진제의 작용기작 실습
주요 수업 내용 수업자료 및 방법
○ 곤충 특이적 유전자 재조합 바이러스 순수 분리(실험·실습)
○ 고역가의 재조합 바이러스 감염 및 증식(실험·실습)
○ 타겟 단백질 발현양상 확인(실험·실습)
○ 인간 뼈 형성촉진 단백질의 작용기작에 대한 이해
○ 효과 검증을 위한 단백질 효율 검증법 연구 및 정립(실험·실습)
○ 기존의 기술개발 동향 파악을 통한 경제성 분석
강의, 토론,
유인물, ppt 자료, 실험·실습
▪ 단원의 개관
이 단원에서는 현재 개발되고 있는 바이오 의약품들의 산업동향을 파악하기 위하여 미국과 기타 여러 국가들을 포함하는 해외의 시장 및 국내시장에 대한 동향을 살펴봄으로써 향후 바 이오소재로서 의약품 개발을 위한 방향을 설정하고 이해하는데 도움이 되도록 한다. 또한 현 재 개발되어 있거나 개발이 진행 중인 인간 뼈 형성촉진 단백질의 작용 기작을 이해함으로써 본 과목에서 연구하고자 하는 의약 단백질의 적용방법을 설정하고 정립하는데 도움을 줄 수 있다. 연구된 바이오 의약품의 경우 해당하는 목적에 맞게 정확하게 작용하여 함으로써 기존 에 알려진 방법과 절차에 대한 연구와 자료 수집으로 정확한 효율 검증법을 정립함으로써 향 후 보고서 작성과 향후 연구에 대한 방향설정에 도움을 줄 수 있도록 하고자 함이 목적이다.
▪ 단원의 목표
1. 의료용 단백질의 수거 효율을 높이기 위해 곤충 특이적 유전자 재조합 바이러스 순수 분 리
2. 타겟 단백질 발현양상 확인을 통한 최적 배양조건 확립 3. 인간 뼈 형성촉진 단백질의 작용기작에 대해 이해
4. 상품화 현황 파악을 통하여 본 수업의 목표 및 과정 이해
▪ 교재 연구
▣ 곤충 특이적 유전자 재조합 바이러스 순수 분리
○ DICAM 구조; Cell adhesion 관련된 유전자로 442개 아미노산으로 구성, SP (Signal Peptide), V-type의 Ig domain I과 II를 가지며, 하나의 transmembrane domain으로 구성.
○ DICAM 유전자 조작 및 발현;
- Cell adhesion에 관하여 Domain II가 주로 기능함, - 유전자 조작; Full-length DICAM,
- 전체 DICAM 유전자 발현을 위한 유전자 클로닝;
○ 발현 확인 및 정제;
- 우선적으로 BEVS가 곤충세포에서 정상적으로 형성되어 바이러스를 형성 유무를 우선적으로 확인하기 위하여 발현 벡터 구축시 삽입한 EGFP 유전자를 형광현미경
하에서 관찰함으로써 재조합 바이러스 형성을 확인
- 바이러스 형성 3일 후 감염 및 증식된 세포를 수거하여 RT-PCR을 통한 목적 유전자 발현 유무 확인
- 바이러스 순수분리; 형성된 재조합 바이러스는 목적 유전자가 삽입된 바이러 스(AcDF)와 그렇지 못한 바이러스가 혼재된 상태이다. 따라서 목적 단백질의 발현 및 정제
의 효율을 높이기 위하여 목적 유전자가 삽입 및 발현되는 바이러스만을 순수 분리하는 과정 이 필요
- 목적 단백질 정제 조건 확립
- Western blotting을 통해 확인 후 단백질 분리 정제
▣ 재조합 단백질 기능성 검증
○ 실크를 이용한 새로운 3차원 세포지지체 개발
- 재조합 베큘로 바이러스를 이용해 발현 및 정제된 DICAM 단백질은 세포부 착력을 증가시킨다는 연구 보고가 있음
- 위 기능을 실크 단백질을 이용한 3차원 지지체에 접목하여 새로운 형태의 지지체 개발
- DICAM 단백질의 농도가 증가 할수록 실크 지지체의 세포부착 효과 증대
그림. DICAM 기능성 검증을 통한 바이오소재 적용 가능성 분석
▣ 유전자 재조합 단백질의 특성 [자료의 출처 : 식물유래 당단백질 의약품(분석 시험법 및 안전성 평가법), 식품의약품안전평가원]
○ 동물유래 당단백질은 주로 fucose(Fuc)(α1,6), galactose(Gal), mannose(Man), N-acetylglucosamine (GlcNAc), N-acetylgalactosamine(GalNAc), 시알산으로 구성 된 반면, 식물 유래 당단백질은 주로 Gal, Man, GlcNAc 이외에 arabinose(Ara), Fuc(α1,3), xylose(Xyl)가 추가적으로 구성
○ 일반적인 단백질 의약품의 한계점은 합성 의약품에 비해 비교적 낮은 활성과 생체 내 에서 빠르게 소실
○ 이를 극복하기 위하여 당단백질에 결합된 올리고당의 구조적 역할 및 그 올리고당의 변형에 따른 단백질의 활성 증가가 주목받기 시작
○ 식물 유래 당단백질의 특징적인 구성당인 Xyl, Fuc (α1, 3)와 같은 당화의 미묘한 차 이가 실험동물에 따라서는 면역원 혹은 알러지 유발 원인으로 작용될 가능성이 제기 되면서 올리고당 연구의 중요성이 더욱 부각
○ 국내외 제약회사에서 비용절감과 안전성을 높이기 위하여 식물유래 단백질 개발이 최 근 5 ~ 10년간 이루어지고 있으며 개발이 완료되어 가고 있는 품목이 다수
○ 비록 세계적으로 아직 인체투여 의약품 목적의 형질전환식물유래 재조합의약품이 현 재 임상시험 단계에 있는 상황이나, 이러한 패러다임의 변화를 고려해 볼 때 재조합 단백질에 결합된 당쇄분석과 당쇄차이에 따른 안전성 변화의 평가법을 확립하는 것은 향후 바이오의약품 개발 및 평가에 필수적인 요소
○ 따라서 식물유래 의약품에 대한 평가법을 마련함으로서 선진국 수준의 식물유래 재조 합단백질의 허가기준을 마련하고 식물유래 단백질의약품 개발자, 평가자에게 허가 신 청자료 작성을 위한 당쇄 관련 안전성 시험법 제공
○ 외국의 허가기관에서는 이미 식물유래 단백질의약품에 관한 가이드라인이 마련
○ 식물유래 재조합단백질의 경우, 미생물, 동물세포, 포유류 유래의 단백질과 비교하여 당조성 및 당쇄구조에 차이가 있음
○ 당쇄변화에 따른 단백질의 활성에 관한 연구는 활발히 진행
○ 안전성 관련 연구는 미진한 편
○ 당쇄차이에 따른 안전성변화의 평가법을 확립하는 것은 바이오의약품 개발 및 평가에 필수적인 요소가 될 것으로 판단
▣ 인공 뼈란 [자료의 출처 : 실크로드, 국립농업과학원, 권해용]
사람의 뼈는 매우 딱딱하여 처음 생겨난 것이 계속 그냥 있는 것 같지만 사실은 뼈의 일부 는 계속 없어지고 일부는 계속 생성되는 다이나믹한 과정을 되풀이하며 매년 약 10%의 뼈가 교체되고 있다. 그런데, 선천적 기형이나 사고 또는 질병으로 인하여 결손된 부위가 클 경우에 는 손상된 부위를 대체하거나 뼈 세포들이 자랄 수 있도록 유도하는 인공뼈가 필요하다. 다시 말하면 뼈가 결손된 부위에 이식된 인공뼈 소재는 몸 속에서 서서히 분해되어 없어지고 그 자 리에 뼈세포가 자라 들어와 결손된 뼈를 완전하게 만들어준다.
▣ 인공 뼈의 사용 현황 [자료의 출처 : 실크로드, 국립농업과학원, 권해용]
사람이나 동물의 뼈, 세라믹, 또는 다른 합성 화합물로 제조하는 인공뼈 소재는 인위적으로 만든 뼈를 의미하며, 최근에는 조직공학 기법을 이용하여 인공뼈 재생을 위하여 사용되는 스 케폴드를 의미한다.
신토불이(身土不二)라는 말처럼, 사람의 몸에 결함이 생겼을 경우에 자신의 몸에 있는 것으 로 대체하는 것이 가장 바람직하나 정상적인 경우 손상된 뼈를 대체하기 위하여 충분한 물량 의 여분의 뼈를 찾기가 어렵다. 그래서, 현재 병원에서는 주로 죽은 사람의 뼈 또는 동물뼈를 원료로 사용하여 제조한 인공뼈를 사용한다.
심하게 손상된 뼈를 회복시키기 위하여 병원에서는 주로 죽은 사람의 뼈를 가공한 인공뼈를 사용하나 그 제조 과정이 복잡하고 에이즈 등 각종 질병에 대한 감염 우려, 면역거부반응 등 여러 가지 부작용과 윤리적 문제가 꾸준히 제기되고 있다. 이를 극복하기 위하여 개발된 동물 뼈 역시 공급되는 물량이 제한적일 뿐 아니라 광우병 등 질병 감염 및 인체 이식에 따른 면역 거부 반응이 문제점으로 지적되고 있어 최근에서 합성소재를 위주로 한 새로운 인공뼈 소재 발굴을 위한 노력이 경주되고 있는 실정이다.
최근 티타늄 등 금속이나 수산화인회석을 이용한 인공뼈 소재가 개발되어 뼈 결손분 대체재 로 상품화되고 있으나, 여전히 뼈 구조의 모사 및 강도 등 아직까지 극복해야 될 문제점이 많 은 것으로 지적되고 있다. PLGA(polylactic-glycolic acid) 등과 같은 합성고분자 생체재료를 사용하여 조직공학기법을 통한 인공뼈 연구도 활발하게 진행되고 있다.
▣ 실크단백질은 인체 친화성이 검증된 거의 유일한 생체재료 [자료의 출처 : 실크로드, 국 립농업과학원, 권해용]
실크단백질은 인체친화성이 검증된 거의 유일한 생체재료
누에고치의 전통적인 쓰임새는 옷감용 소재이다. 동물껍질이나 마섬유로 옷을 만들어 입 던 시절에 누에고치에서 뽑은 실크는 그야말로 '섬유의 여왕' 그 자체라 할 수 있다. 지금도 그렇지만, 자연계서 얻을 수 있는 가장 길고 아름다운 섬유인 실크는 사람의 피부에도 친근한 물질이다. 피부건강을 좋게 할 뿐 아니라 상처를 입은 사람들의 외과용 수술실로서도 매우 유 용하게 사용되어 왔다. 그러다보니 실크는 가장 오래된 그리고 사람의 몸을 통하여 인체친화 성이 검증된 거의 유일한 생체재료라 할 만하다. 물론 의료용 소재로 사용된 실크단백질은 당 연히 철저하게 위생적으로 관리, 생산하여야만 하며, 그 기준이 조속한 시간내에 확립되어야
할 것이다. 최근 국내외 연구 결과에서도 실크단백질을 동물의 몸속에 임플란트한 결과 면역 거부반응 등 특이한 이물반응이 나타나지 않음을 확인하여 주고 있다. 그 외에도 생체내 콜라 겐 등 세포외물질의 분비를 촉진하는 효과가 있을 뿐 아니라, 섬유아세포, 연골세포, 골아세포 등에 대한 우수한 세포 부착 및 배양 특성을 확인되었다. 우리나라는 세계적인 양잠산업의 종 주국으로서 수많은 300여 누에품종과 실크용액, 분말, 필름 등 다양한 구조를 가진 형태로 성 형 가공하는 기술이 개발되고 있어 인공뼈용 소재 개발 가능성이 매우 높다.
▣ 실크 인공 뼈 연구 [자료의 출처 : 실크로드, 국립농업과학원, 권해용]
실크단백질의 인체친화성에 착안하여 일본, 미국 등을 중심으로 오래전부터 실크단백질을 이용한 인체보형물 및 인공뼈 소재 개발에 대한 연구를 추진하고 있다. 뼈의 주 성분으로 알 려진 수산화인회석은 칼슘, 인산, 수산기로 이루어진 결정물이므로, 사람의 체액 조성과 유사 한 용액에 실크를 담구면 실크단백질 표면에 뼈의 성분인 아파타이트가 형성된다. 뿐 아니라 실크단백질 표면에 섬유아세포, 골아세포 등 세포가 잘 성장하고 성장을 촉진한다는 것이 국 내외 연구진들에 의하여 확인되어 미국, 이탈리아 등을 중심으로 인공뼈, 인공연골 등 조직공 학용 생체재료로서 실크단백질의 응용 가능성이 연구되고 있다.
실크단백질을 이용한 인공뼈 소재 개발 연구 중에서 대표적인 두 가지 연구 결과를 소개하 고자 한다. 그림에서 보는 바와 같이 영양 성분의 이동이 용이하고 또한 뼈를 생성하는 골아 세포들이 잘 자라들어 올 수 있도록 구멍이 숭숭 뚫린 구조체인 스케폴드를 만들어서 뼈가 제 대로 형성되는지를 세포실험 또는 동물실험을 통하여 확인하는 방법이다. 골아세포는 사람 피 부를 구성하는 주요 세포인 섬유아세포보다 크기 때문에 구멍의 크기 조절 등 스케폴드의 미 세 구조 조절이 매우 중요하다. 실크단백질이 뼈 재생에 미치는 효과를 실험동물을 이용하여 관찰한 결과는 아래 그림과 같다. 그림의 경우 쥐의 다리뼈를 절단하여 그 자리를 실크 스케 폴드로 채운 것과 아무것도 채우지 않은 것을 비교하였다. 아무 것도 채우지 않은 실험군은 뼈가 재생되지 않은 반면 실크 스케폴드로 상처부위를 연결한 경우에는 뼈가 형성되어 절단된
다리뼈가 연결된 것을 확인할 수 있다.
실크단백질을 이용한 인공뼈 소재 개발 연구 중에서 치과용 인공뼈 소재 개발과 관련된 연 구 결과는 다음과 같다. 실크단백질의 뼈형성 능력을 향상시키기 위하여 환자 혈액에서 추출 한 혈소판 농축물질인 PRF를 혼합하여 치과용 임플란트 주위의 뼈 형성 정도를 토끼를 모델 동물로 살펴본 것이다. PRF는 PDGF, TGF-β, IGF, VEGF 등 뼈 조직 치료를 유도하는 다량의 고농도의 성장인자가 포함되어 있다. 임플란트 후에 주위의 뼈가 잘 형성되었는지 간접적으로 측정하는 방법으로 임플란트 시술후 일정 기간뒤에 임플란트를 제거할 때 드는 힘을 비교하기 도 한다. 실험군에서는 약 30 N·cm의 힘이 필요한 데 비하여 대조군은 22 N·cm 미만의 힘 만으로도 임플란트를 제거할 수 있었다. 육안으로 뼈가 형성된 정도를 관찰하기 위하여 임플 란트 주변의 동물 조직을 살펴보면 그림에서 보는 바와 같이 실크단백질과 PRF를 함께 처리 한 실험군(B)에서는 임플란트 주위에 뼈가 잘 형성되어 있다는 것을 알 수 있다. 이를 정량적 으로 평가한 결과 대조군에서는 11.7%의 새 뼈가 만들어진 대 비하여 실험군에서는 51.9%의 새 뼈가 만들어진 것으로 확인되었다.
▣ 항혈전 치료제의 필요성 [자료의 출처 : 항혈전/항응고제 치료 (Clinical Vascular Medicine), 서울의대, 이해영, 오병희]
○ 고혈압 및 동맥 경화증에서 혈전 생성 및 혈액 응고 경향이 증가되는 현상은 여러 임 상 연구에서 관찰
○ 염증 반응 및 내피 세포 기능 부전이 원인 기전으로 제시
○ 특히 고혈압에 노출된 혈관에서는 역설적으로 출혈성 경향 보다는 혈전 성향이 지배 적
○ 이를‘고혈압에서의 역설적 혈전 생성 증가 현상 (thrombotic paradox of hypertension 또는 Birmingham paradox)’이라고 함
○ 이러한 혈전 생성 증가 현상은 고혈압에서의 표적 장기 손상 및 예후와 관련이 있음
표 1. 고혈압과 혈액 응고 증가 현상의 연관을 확인한 연구결과
[출처 : 항혈전/항응고제 치료 (Clinical Vascular Medicine), 서울의대, 이해영, 오병희]
○ 심혈관 질환의 이차 예방으로서의 항혈전 치료의 효용성은 여러 임상연구를 통해 입 증
○ 심혈관 질환에서 항혈전 치료의 일차 예방 효과에 대해서는 아직 많은 연구가 이루어 져 있지 않음
▣ 일차적 항혈전 치료제 [자료의 출처 : 항혈전/항응고제 치료 (Clinical Vascular Medicine), 서울의대, 이해영, 오병희]
1. Thienopyridines (Ticlopidine, Clopidogrel)
○ ADP가 혈소판의 G-protein coupled receptor인 P2Y에 결합하면 혈소판의 응집이 시작되어 강력한 혈소판 응집 작용을 나타냄
○ Thienopyridine은 혈소판의 ADP 수용체를 차단하는 작용
○ 초기에 개발된 약제는 Ticlopidine이나 비록 극소수의 환자에서였지만 중한 혈소판 감 소증 유발 작용이 관찰되어 현재는 대부분 Clopidogrel로 대체되어 사용
○ Thienopyridine의 심혈관 질환의 이차 예방 효과는 여러 연구에서 입증
2. Phosphodiesterase inhibitor (Dipyridamole, Cilostazol)
○ Cyclic GMP phosphodiesterase 억제제는 NO/cGMP 경로를 통해 항혈소판 작용
○ 아데노신의 혈중농도 증가
○ 내피 세포에서의 혈관 확장 prostanoid 분비를 촉진
3. Triflusal
○ Triflusal은 아스피린과 유사한 형태 및 항응고 기전을 가짐
○ 단지 혈소판의 Prostaglandin G/H synthase에 대한 억제 작용이 아스피린보다 적어 혈관 확장성 Prostaglandin인 Prostacyclin에 대한 생성 억제 작용이 덜하다는 주장 이 있는 실정
○ 아직 미국 FDA에 승인을 받지 못함
4. Heparin
○ Heparin은 각종 혈전색전성 질환의 치료 및 예방에 사용되는 약물
○ 제조방법 및 분자량에 따라 unfractionated heparin (UFH)과 low-molecularweight heparin (LMWH)으로 나뉨
○ LMWH은 UFH의 화학적 또는 효소적 depolymerization을 통해 얻어짐
○ UFH의 분자량이 3,000~30,000 daltons인데 비해, LMWH의 분자량은 약 4,000~6,500 dalton
5. 경구용 항응고제들
○ Warfarin
- Warfarin은 40여 년 전 개발된 이래 현재까지 가장 안정적으로 사용
- 특히 심방세동증 환자에서의 뇌졸중 발생의 1차 예방 및 뇌졸중 발생 후 재발 방지
의 2차 예방 효과가 모두 탁월
○ Direct thrombin inhibitors
- Direct thrombin inhibitor는 thrombin에 직접 부착되어 작용을 차단
- Heparin에 비하여 이미 fibrin과 결합하였거나 액체 상태의 thrombin의 작용도 차 단할 수 있다는 장점
- antidote가 없다는 것이 중요한 단점
- 현재 FDA에서 사용이 허가된 Direct thrombin inhibitor에는 hirudin, rgatroban, bivalirudin 등
- hirudin은 heparin-induced thrombocytopenia (HIT) 환자에서 heparin의 대체 용 도로, argatroban은 HIT에서의 heparin 대체와 HIT의 위험성이 높은 환자의 관동맥 중재술시, bivalirudin은 관동맥 중재술을 시행하는 환자에서 heparin의 대용으로 사 용이 허가
▣ 히루딘(단백질 의약품의 예시)
○ ‘히루딘 (hirudin)’은 모기 또는 거머리의 구강선 (口腔腺)에서 분리된 단백질로 흡 혈 시 숙주의 혈액응고를 방지하는 단백질로 알려져 있음
○ 65개의 비교적 짧은 polypeptide 형태의 아미노산으로 구성되어 있으며 강력하고 특이적인 Thrombin 억제작용을 함
○ 과거 10여 년 전부터 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산이 가능했음
○ 일부 독자적인 유전자 재조합 기술을 이용하여 변형 히루딘을 개발하여 제품화 (예;
데시루딘)하여 개발에 주력 함
