Vol. 8, No. 3, September, 2001
I n t e r l e u k i n - 1 7이 배양된 류마티스관절염 활막세포에서 va s c u l a r endothelial gro wth factor 생성에 미치는 영향
부산대학교 의과대학 내과학교실, 정형외과학교실*, 부산대학교 병원 의학연구소* *
곽임수・남태수・나하연・서정탁*・김유선* *・김성일
─A b s t r a c t─
The Effects of Interleukin-17 on Production of Vascular Endothelial Growth Factor in Cultured Rheumatoid Arthritis Synoviocytes
Ihm Soo Kwak, M.D., Tae Soo Nam, M.D., Ha Yeon Rha, M.D., Jeung Tak Suh, M.D.*, Yoo Sun Kim**, Sung Il Kim, M.D.
Department of Internal Medicine, Orthopedics*, College of Medicine, Pusan National University, Pusan National University Hospital Institute**
O b j e c t i v e : To investigate the the effects of interleukin-17 (IL-17) on the production of vascular endothelial growth factor (VEGF) from cultured rheuma- toid arthritis synoviocytes.
M e t h o d s : Fibroblast-like synovial cells(FLS) were prepared from the synovial tissues of rheumatoid arthritis patients and cultured in the presence of IL-17, IL-17 with or without transforming growth factor-β ( T G F -β), tumor necrosis f a c t o r -α( T N F -α) and interleukin-1β( I L - 1β). VEGF levels were determined in the culture supernatants by sandwitch ELISA.
R e s u l t s : Stimulation of FLS by serial concentration of IL-17, TGF-β, TNF-α, I L - 1βincreased the production of VEGF by 2.1-2.7, 2.2-3.0, 2.0-2.9, 2.3-3.1 fold over the constitutive levels of unstimulated FLS. Stimulation of FLS by IL- 17 with TGF-βor TNF-αor IL-1βalso increased the production of VEGF accord-
＜접수일 : 2001년 5월 7일, 심사통과일 : 2001년 7월 5일＞
※통신저자 : 김 성 일
부산광역시 서구 아미동 1가 10번지 부산대학교 의과대학 내과학교실
Tel : 051) 240-7928, Fax : 051) 254-3127, E-mail : [email protected] 본연구는 2000년도 부산대학교병원 지정연구비 지원에 의하여 연구되었음
서 론
류마티스관절염은 활막의 만성염증과 증식을 특징 으로 하는 대표적인 자가면역질환이다. 활막의 단핵 구-대식세포와 활막세포의 상호작용으로 i n t e r- leukin-1 (IL-1) 및 tumor necrosis factor-α ( T N F -α) 등의 염증전구싸이토카인( p r o i n f l a m m a- tory cytokine)이 과잉 생성되고 이로 인한 만성염 증은 관절조직의 파괴와 변형을 유발한다1 - 3 ). T 림프 구는 류마티스관절염 활막에 주로 침윤되는 염증세 포로 만성염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, 활액 내 T 림프구에서 유리되는 싸 이토카인이 단핵구-대식세포에서 유리되는 싸이토카 인에 비하여 상대적으로 적다4 , 5 ).
CD4+ T helper (Th) 세포는 싸이토카인의 생성 양식에 따라 Th1 및 Th2 세포로 구분된다. Th1 세 포는 주로 i n t e r f e r o n -γ( I F N -γ)와 I L - 2를 생성하고 세포매개성 면역반응을 유발한다. Th2 세포는 I L - 4 , IL-5, IL-6, IL-10을 생성하고 B 림프구를 자극하여 항체생성을 촉진함으로서 체액매개성 면역을 유발한
다6 , 7 ). 또한 Th1 세포 및 싸이토카인의 기능과 활막
세포 및 단핵구에서의 IL-1, IL-6, TNF-α, IL-8 생 성을 억제하여 항염증작용을 나타낸다.
Th1 및 Th2 싸이토카인 생성의 불균형은 자가면역 질환의 병인에 주요한 역할을 하며8 - 1 1 ), 류마티스관절 염은 Th1 세포로의 편향이 중요할 것으로 추측된다4 ).
I L - 1 7은 Th0 또는 Th1 세포에서 생성되는 싸이 토카인으로1 2 ) 류마티스관절염 활막세포에서 I L - 6 , IL-8, granulocyte-macrophage-colony stimu- lating factor (GM-CSF) 및 p r o s t a g l a n d i n
(PG) 생성과1 3 , 1 4 ) 대식세포에서 I L - 1β및 T N F -α생 성을 촉진시키고1 5 )IL-1 및 T N F -α의 활막세포에 대 한 작용을 상승시킨다1 3 , 1 5 ). 또한 류마티스관절염에서 파골세포( o s t e o c l a s t )의 생성을 자극하고 n i t r i c o x i d e를 활성화시킨다. 이로 인한 연골의 파괴증가 및 재생감소는 관절파괴에 주요한 역할을 하는 것으 로 알려져 있다1 6 , 1 7 ).
류마티스관절염 활막은 활막세포 및 혈관의 증식 으로 종양과 유사한 형태로 성장한다1 8 ). 활막증식으 로 인한 판누스(rheumaotid pannus) 형성과 활막 으로 단핵구의 이동은 혈관의 풍부한 정도와 연관되 므로 혈관신생성( n e o v a s c u l a r i z a t i o n )은 활막염의 지속과 악화에 주요한 역할을 한다.
염증성 관절에서 혈관신생( a n g i o g e n e s i s )은 촉진인 자 및 억제인자의 균형에 의하여 결정되며, 촉진인자 로는 fibroblast growth factor (FGF), platelet- derived endothelial cell growth factors (PDGF), transforming growth factor α및 β ( T G F -α, β), angiogenin 및 vascular endothelial growth factor (VEGF) 등이 있다1 9 , 2 0 ).
V E G F는 내피세포의 증식, 혈관신생 및 모세혈관 투과성을 증가시키고2 1 , 2 2 ) 배아발육(embryonic devel- o p m e n t )2 3 ), 창상 치유2 4 ), 고형종양의 성장 및 복수생
성2 5 ) 등의 정상 및 비정상적인 과정에 주요한 역할을
한다. 최근에는 골관절염이나 다른 관절염에 비하여 류마티스관절염 환자의 활액 및 혈액에서 V E G F가 유의하게 증가되고2 6 , 2 7 ), 활동성 류마티스관절염 활막 의 활막세포 및 대식세포에서 VEGF 발현의 증가가
보고되어2 8 ) 류마티스관절염의 병인과 연관이 있는 것
으로 알려져있다. 저산소증은 류마티스관절염 활막세 포에서 VEGF 유리를 촉진하는 주요한 인자이며2 9 - 3 1 ), ing to culture periods by 1.6-1.8, 1.1-1.9, 1.5-1.7 fold over the levels stimulated with TGF-βor TNF-αor IL-1β, respectively. This results indicated that IL-17 increased the effect of TGF-β, TNF-α, IL-1βon FLS, leading synergistic enhancement of VEGF production.
C o n c l u s i o n : IL-17 may be involved in the neovascularization in rheumatoid synovitis by enhancing the production of VEGF.
Key Words : Interleukin-17, Vascular endothelial growth factor, Rheumatoid arthritis synoviocytes
그외 류마티스관절염의 병인에 관여하는 주요한 염증 매개물질인 P G3 2 ), IL-1, IL-63 3 ), TNF-α및 T G F -β
3 0 , 3 4 , 3 5 )등이 V E G F의 유리를 촉진한다.
본 연구에서는 I L - 1 7이 류마티스관절염 활막세포 에서 VEGF 생성에 미치는 영향을 알아보고 I L - 1 , T N F -α, TGF-β의 VEGF 생성에 대한 I L - 1 7의 영 향을 구명하고자 하였다.
대상 및 방법
1. 활막세포의 분리와 배양
활막세포는 미국 류마티스학회의 류마티스관절염 진단기준( 1 9 8 7년)에 부합되는 환자로 관절경을 이용 한 슬관절 활막절제술 또는 관절치환술을 시행한 환 자의 활막을 사용하였다. 채취된 활막의 지방과 섬 유조직을 제거하고 약 2 ~ 3 m m3로 잘라 4 m g / m l의 collagenase(type I; Worthington Biochemical, Freehold, NJ)로 처리 후 D u l b e c c o’s Modified Eagle Medium(DMEM, Life Technologies, Grand Island, NY) 용액에 넣어 3 7℃, 5% CO2
가 공급되는 배양기( i n c u b a t o r )에서 4시간 처리하 고 2 0 0μm의 나이론 체를 3회 통과시켰다. 이를 5 0 0×g으로 원심분리한 후 7 5 c m2 f l a s k에 1 0 % fetal bovine serum (FBS, Life Technologies, Grand Island, NY), 2mM glutamine, peni- cillin (100U/ml) 및 streptomycin (100ug/ml) 이 포함된 D M E M에 다시 부유시킨 후 배양하였다.
배지는 3일마다 교환하였으며 세포가 충분히 자라면 배양배지를 완전히 흡입하여 내고 p h o s p h a t e buffer saline(PBS)로 1회 세척한 후 0 . 2 5 % trypsin-0.02% EDTA로 처리하여 계대배양( s u b- c u l t u r e )하였다. 활막세포는 3 ~ 8회 계대배양한 세 포를 사용하였다.
2. 싸이토카인 및 단클론성 항체
2. (Cytokines and Monoclonal antibodies) R&D system(Minneapolis, MN)의 r e c o m b i- nant IL-17, IL-1β, TNF-α, TGF-β, anti- human VEGF1 6 5 monoclonal antibody, human recombinant VEGF1 6 5 및 b i o t i n y l a t e d anti-human VEGF1 6 5를 사용하였다.
3. 싸이토카인 투여 및 배양액 수집
1) IL-17, TGF-β, TNF-α및 I L - 1β의 투여농도에 따른 VEGF 생성
24-well plate에 각 well 당 1 m l의 D M E M과 6
×1 04의 활막세포를 넣고 3 7℃, 5% CO2배양기에서 2 4시간 배양 후 배양배지를 i n s u l i n - t r a n s f e r r i n - selenium A(Life Technologies)가 포함된 s e r u m free DMEM으로 교환하고 다시 2 4시간 3 7℃, 5%
C O2 배양기에서 배양 후 각 w e l l에 다양한 농도 (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400)의 I L - 17(ng/ml) 및 I L - 1β, TNF-α, TGF-β( p g / m l )를 투여하였다. 싸이토카인 투여 후 3 7℃, 5% CO2 배 양기에서 4 8시간 배양 후 세포를 제외한 배양상층액 을 모아 - 2 0℃에서 보관한 후 V E G F를 측정하였다.
2) IL-17, TGF-β, TNF-α및 I L - 1β투여 후 시간 경과에 따른 VEGF 생성
24-well plate에 각 well 당 1 m l의 D M E M과 6
×1 04의 활막세포를 넣고 3 7℃, 5% CO2 배양기에 서 2 4시간 배양 후 배양배지를 i n s u l i n - t r a n s f e r- rin-selenium A 가 포함된 serum free DMEM 으로 교환하고 다시 2 4시간 3 7℃, 5% CO2 배양기 에서 배양 후 각 well 에 I L - 1 7는 20ng/ml, TGF- β, TNF-α및 I L - 1β는 2 0 p g / m l로 투여하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 12, 24, 48, 72시간 배양 후 배양상층액을 모아 - 2 0℃에서 보관한 후 V E G F를 측정하였다.
3) I L - 1 7과 T G F -β, TNF-α및 I L - 1β의 VEGF 생 성에 대한 상호작용
24-well late에 각 well 당 1 m l의 D M E M과 6
×1 04의 활막세포를 넣고 3 7℃, 5% CO2 배양기에 서 2 4시간 배양 후 배양배지를 i n s u l i n - t r a n s f e r- rin-selenium A가 포함된 serum free DMEM으 로 교환하고 2 4시간 3 7℃, 5% CO2 배양기에서 배 양 후 각 w e l l에 T G F -β, TNF-α및 I L - 1β ( 2 0 p g / m l )을 단독 또는 IL-17 (20ng/ml)과 함께 투여하고 3 7℃, 5% CO2 배양기에서 12, 24, 48, 7 2시간 배양 후 배양상층액을 모아 - 2 0℃에서 보관 한 후 V E G F를 측정하였다.
4) 대조군
싸이토카인을 투여하지 않고 배양한 경우를 대조 군으로 하였다.
4. VEGF의 측정
배양액의 V E G F는 sandwitch ELISA 방법으로 측정하였으며 간략히 기술하면 다음과 같다. 96-well microtiter plates에 goat anti-human VEGF1 6 5 를 0 . 4μg / m l의 농도로 1 0 0μl를 coating 하여 4℃에 서 1 2시간 보관 후 1% bovine serum albumin 로 상온에서 1시간 blocking 시킨다. Human recom- binant VEGF1 6 5 및 배양액을 각 w e l l에 투여하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 biotinylated goat anti-human VEGF1 6 5 0 . 2μg / m l을 투여하여 상온 에서 2시간 반응시킨다. 1:1000으로 희석한 p e r o x i- dase-labeled extravidin (Sigma)을 상온에서 2시 간 반응시킨 후 substrate 용액( T M B / H2O2)을 첨가 하여 3 0분간 발색반응이 유발된 후 1 M의 p h o s-
phoric acid로 발색반응을 중단시키고 4 5 0 n m의 파 장으로 O D값을 측정한다. 각각의 단계에서 p l a t e를 0.1% Tween 20이 포함된 P B S로 3회 세척하였으 며, human recombinant VEGF1 6 5는 교정기준으 로 1 0 ~ 2 0 0 0 p g / m l을 사용하였다.
결 과
1. 투여농도에 따른 VEGF 생성 1) IL-17
6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400ng/ml 로 투여 하고 4 8시간 배양 후 생성된 V E G F는 대조군( 2 2 0±
3 7 p g / m l )에 비하여 2 . 1배, 2.5배, 2.2배, 2.1배, 2.7 배, 2.4배, 2.3배( 4 6 2±46, 538±32, 484±57, 464
±30, 599±41, 520±54, 494±32pg/ml) 증가하였 다(그림 1 ) .
2) TGF-β
6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400pg/ml 로 Fig. 1. Effects of interleukin-17 (A), trasnforming growth factor-β(B), tumor necrosis factor-α(C) and i n t e r l e u k i n - 1β(D) on vascular endothelial growth factor (VEGF) production of rheumatoid arthritis synovial cell. The amount of VEGF in the supernatants was determined by ELISA.
Data was expressed as mean±SD of culture duplicates
A B
C D
투여하고 4 8시간 배양 후 생성된 V E G F는 대조군 ( 2 2 0±3 7 p g / m l )에 비하여 2.2, 2.7, 2.8, 2.4, 3.0, 2.5, 2.5배( 4 8 5±48, 586±52, 620±4 2 , 5 2 4±35, 663±49, 559±61, 555±38pg/ml) 증 가하였다(그림 1 ) .
3) TNF-α
6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400pg/ml로 투여 하고 4 8시간 배양 후 생성된 V E G F는 대조군( 2 2 0±
3 7 p g / m l )에 비하여 2.0, 2.8, 2.9, 2.9, 2.2, 2.1, 2 . 2배( 4 3 4±31, 608±42, 628±35, 641±54, 474±
28, 465±38, 480±42pg/ml) 증가하였다(그림 1 ) .
4) IL-β
6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400pg/ml 로 투여 하고 4 8시간 배양 후 생성된 V E G F는 대조군( 2 2 0±
3 7 p g / m l )에 비하여 2.4, 3.0, 2.9, 2.4, 2.3, 2.9, 3 . 1배( 5 2 2±25, 652±58, 643±57, 527±46, 509±
39, 634±61, 671±36pg/ml) 증가하였다(그림 1 ) .
2. 시간경과에 따른 VEGF 생성 1) IL-17
20ng/ml 로 투여하고 12, 24, 48, 72시간 배양 후 측정한 V E G F는 대조군( 1 9 0±21, 213±2 5 , 2 2 0±31, 232±3 7 p g / m l )에 비하여 2.4, 2.3, 2.2, 2.3배( 4 5 6±52, 497±38, 492±32, 543±
46pg/ml) 증가하였다(그림 2 ) .
2) TGF-β
20pg/ml 로 투여하고 12, 24, 48, 72시간 배양 후 측정한 V E G F는 대조군( 1 9 0±21, 213±2 5 , 2 2 0±31, 232±3 7 p g / m l )에 비하여 2.2, 2.2, 2.6, 2.6배( 4 2 3±46, 467±35, 580±57, 612±
57pg/ml) 증가하였다(그림 2 ) .
3) TNF-α
20pg/ml 로 투여하고 12, 24, 48, 72시간 배양 후 측정한 V E G F는 대조군( 1 9 0±21, 213±25, 220 Fig. 2. Time course of vascular endothelial growth factor (VEGF) production by interleukin-17 (20 ng/ml, (A), transforming growth factor-β(20 pg/ml), (B), tumor necrosis factor-α(20 pg/ml), (C) and interleukin-1β(20 pg/ml), (D). The amount of VEGF in the supernatant was deter- mined by ELISA. Data was expressed as mean±SD of culture duplicates.
A B
C D
±31, 232±3 7 p g / m l )에 비하여 2.6, 2.8, 2.8, 2.5 배( 4 8 7±42, 587±47, 610±66, 578±3 5 p g / m l ) 증가하였다(그림 2 ) .
4) IL-1β
20pg/ml 로 투여하고 12, 24, 48, 72시간 배양 후 측정한 V E G F는 대조군( 1 9 0±21, 213±2 5 , 2 2 0±31, 232±3 7 p g / m l )에 비하여 2.9, 2.8, 3.0, 2.9배( 5 4 7±35, 587±58, 662±45, 663±
35pg/ml) 증가하였다(그림 2 ) .
3. I L - 1 7과 T G F -β, TNF-α및 I L - 1β의 VEGF 생 성에 대한 상호작용
I L - 1 7 ( 2 0 n g / m l )을 T G F -β( 2 0 p g / m l )와 투여한 군은 T G F -β를 단독투여한 군에 비하여 12, 24, 48, 72시간 후 V E G F의 생성이 1 . 6배( 6 7 6±54 vs 4 2 3±46), 1.8배( 8 4 0±78 vs 467±35), 1.7배 ( 9 8 6±57 vs 580±57), 1.6배( 9 7 9±74 vs 612±
57), TNF-α(20 pg/ml)와 투여한 군은 T N F -α를 단독투여한 군에 비하여12, 24, 48, 72시간 후 V E G F의 생성이 1 . 1배( 5 3 5±43 vs 487±42), 1.1 배( 6 4 5±46 vs 587±47), 1.8배( 1 0 4 4±68 vs 610
±66), 1.9배( 1 1 6 2±74 vs 578±35), IL-1β( 2 0 p g / m l )와 투여한 군은 I L - 1β를 단독투여한 군에 비 하여 12, 24, 48, 72시간 후 V E G F의 생성이 1 . 5 배( 8 2 0±54 vs 547±35), 1.5배( 8 8 0±57 vs 587
±58), 1.6배( 1 0 4 3±87 vs 652±45), 1.7배( 1 2 5 9
±89 vs 663±35) 높았다(그림 3 ) .
고 찰
류마티스관절염은 대칭적 다발성 관절염을 특징으 로 하며 관절 외 폐, 눈, 혈관 및 신경 등을 침범하 여 전신증상을 나타내는 만성 염증성 자가면역질환이 다. 활성화된 T 림프구가 관절활막에 침윤하고 이로 부터 유리되는 싸이토카인들이 단핵구 및 대식세포를 활성화시킨다. 활성화된 단핵구 및 대식세포는 T N F -α및 I L - 1β등의 강력한 염증전구싸이토카인을 유리하여 염증반응을 일으켜 관절조직을 파괴한다.
여러 연구에도 불구하고 T 림프구가 활성화되는 정확 한 기전은 알려져 있지 않으나, 유전적 요인과 감염 등의 환경적 요인이 연관될 것으로 추측하고 있다.
I L - 1 7은 최근에 밝혀진 Th1 또는 Th0 세포에서 생성되는 싸이토카인으로 류마티스관절염 활막세포 Fig. 3. Time course of vascular endothelial growth factor (VEGF) production stimulated by transforming growth factor-β(20 pg/ml), (A) , tumor necrosis factor-α(20 pg/ml), (B) , i n t e r l e u k i n - 1β(20 pg/ml), (C), with or with- out interleukin-17 (20 ng/ml). Amount of VEGF in the supernatants was determined by ELISA. Data was expressed as means±SD of culture duplicate.
A B
C
에서 leukemia inhibitory factor3 6 ), PG, IL-6, IL-8, GM-CSF 생성을 촉진하고, 대식세포에서 matrix metalloprteinase-9 (MMP-9), TNF-α, I L - 1β, IL-12 및 P G E 2의 생성을 촉진하고, 연골세 포에서 nitric oxide, IL-1β, IL-6, PGE2, M M P - 3의 생성을 촉진하며, 골수에서 P G E 2 , osteoclast differentiating factor (ODF)생성을 촉진하는 것으로 알려져 있으며3 7 ), 이러한 기능들은 류마티스관절염의 관절파괴에 주요한 역할을 함을 암시한다.
혈액에서 관절내로 염증세포의 이동과 활막증식에 필요한 영양공급은 활막에 존재하는 혈관의 양과 연 관된다. 그러므로 종양과 유사하게 성장하는 류마티 스관절염 활막의 증식에 혈관신생성은 중요하며, fibroblast growth factor (FGF), platelet- derived endothelial cell growth factors (PDGF), transforming growth factor α및 β ( T G F -α, β), angiogenin 및 vascular endothe- lial growth factor (VEGF)1 9 , 2 0 ) 등은 혈관신생을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 최근 골관절염이나 다른 관절염에 비하여 류마티스관절염 환자의 활액 및 혈액에서 V E G F가 유의하게 증가되고2 6 , 2 7 ), 활동 성 류마티스관절염의 활막세포 및 대식세포에서 VEGF 발현의 증가가 보고되어2 8 ) 류마티스관절염의 병인과 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 저산소증 은 VEGF 생성을 촉진하는 주요한 인자이며2 9 - 3 1 ), 그 외 류마티스관절염의 병인에 관여하는 주요한 염증 매개물질인 P G3 2 ), IL-1, IL-63 3 ), TNF-α및 T G F -
β3 0 , 3 4 , 3 5 )등이 V E G F의 유리를 촉진한다.
본 실험에서 I L - 1 7은 투여농도에 따라 대조군에 비하여 VEGF 생성을 2.1~2.7 배증가시켜, 이미 VEGF 생성을 증가시키는 것으로 밝혀진3 0 , 3 3 - 3 5 )
T G F -β, TNF-α및 I L - 1β와 비슷한 자극효과를 나 타내었다(2.2~3.0 배, 2.0~2.9 배, 2.4-3.1 배) . 이는 I L - 1 7이 류마티스관절염의 활막세포를 자극하 여 VEGF 생성을 촉진시켜 혈관신생을 유발하며 이 를 통하여서도 류마티스관절염의 병인에 관여함을 추측할 수 있었다.
IL-17 투여 후 시간경과에 따른 V E G F의 생성은 1 2시간 경과 후 생성된 양이 배양기간 중 측정한 최 대생성량의 84% 로 투여 1 2시간 내 V E G F가 급속 히 증가함을 관찰하였다. 또한 T G F -β, TNF-α및
I L - 1β도 1 2시간 경과 후 각각 69%, 80%, 83%의 생성을 보여 투여 초기에 V E G F의 발현이 증가함을 관찰하였다.
최근 I L - 1 7은 I L - 1의 류마티스관절염 활막에 대한 IL-6 및 leukemia inhibitory factor (LIF)의 생 성을 증가시키고3 6 ), 말초혈액의 대식세포에서 I L - 1β 및 T N F -α의 발현을 증가시키는 것으로 보고되어1 5 ) I L - 1 7이 다른 싸이토카인의 기능을 증가시키는 것으 로 알려졌다. 본 실험에서 V E G F의 생성을 유발하 는 T G F -β, TNF-α및 I L - 1β와 I L - 1 7의 상호작용을 관찰하기 위하여 I L - 1 7을 함께 투여한 후 비교하였 다. TGF-β, TNF-α및 I L - 1β단독투여에 비하여 I L - 1 7의 동시투여는 V E G F의 생성을 최대 1 . 8 , 1.9 및 1 . 7배 증가시킴으로서, IL-17과 T G F -β, T N F -α및 I L - 1β는 V E G F의 생성에 상승작용( s y n- ergistic action)이 있음을 확인하였다. 그러나, 상 승작용은 T G F -β, IL-1β는 초기인 12 시간에 관찰되 었으나 T N F -α는 4 8시간 경과 후 관찰되었다.
본 실험에서 배양상층액의 T G F -β, TNF-α및 I L - 1β를 측정하지 않았지만 류마티스관절염 활막세포의 배양 시 T G F -β, TNF-α및 I L - 1β가 증가함이 알려 져 있으므로3 6 , 3 8 ), IL-17은 활막세포에 대한 직접적인 자극과 활막세포에서 생성되는 T G F -β, TNF-α및 I L - 1β의 작용을 강화시킴으로서 V E G F의 생성을 증 가시킴을 알 수 있었다.
이상의 실험에서 I L - 1 7은 류마티스관절염 활막세 포에서 직접적인 V E G F의 생성과 T G F -β, TNF-α 및 I L - 1β의 작용을 강화시켜 V E G F의 생성을 증가 시켜 활막의 혈관신생에 기여함으로서 류마티스관절 염의 병인에 관여함을 짐작할 수 있었다.
그러나, 류마티스관절염의 만성염증과 활막증식은 많은 싸이토카인들의 복합적인 작용에 의한 결과이 므로 향 후 류마티스관절염의 병인에 주요한 다른 여러 싸이토카인과의 상호작용과 영향에 대한 연구 가 더 필요할 것으로 사료된다.
결 론
류마티스관절염 활막세포에서 i n t e r l e u k i n - 1 7 ( I L - 1 7 )이 vascular endothelial growth factor (VEGF) 생성에 미치는 영향을 구명하고자 본 실험 을 시도하였다. 류마티스관절염 환자의 활막세포에
IL-17 및 transforming growth factor-β( T G F - β), tumor necrosis factor-α( T N F -α) 및 i n t e r- l e u k i n - 1β( I L - 1β)을 다양한 농도로 투여하고 배양 한 후 경시적으로 배양상층액의 V E G F를 s a n d- witch ELISA 방법으로 측정하였으며 그 결과를 다 음과 같이 요약한다.
I L - 1 7의 투여농도에 따른 VEGF 생성은 대조군 에 비하여 2 . 1 ~ 2 . 7배 증가하였다. 또한 T G F -β, T N F -α, IL-1β의 단독 투여에 비하여 I L - 1 7을 함께 투여한 경우 V E G F의 생성은 배양시간에 따라 1.6~1.8, 1.1~1.9, 1.5~1.7배 증가시켜 T G F - β, TNF-α, IL-1β의 VEGF 생성촉진작용을 강화시 켰다.
이상의 결과로 I L - 1 7은 류마티스관절염 활막세포 에서 VEGF 생성을 증가시킴으로서 활막의 혈관신 생에 관여함을 알 수 있었다.
R E F E R E N C E S
01 ) Harris ED. Rheumatoid arthritis: pathophysi-
ology and implications for therapy. N Eng J Med 1990;322:1277-89.02 ) Arend WP, Dayer JM. Cytokines and cytokine
inhibitors or antagonists in rheumatoid arthri- tis. Arthritis Rheum 1990;33:305-15.03 ) Lipsky PE, Davis LS, Cush JJ, Oppenheimer
MN. The role of cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Springer Semin Immunopathol 1989;11:123-62.04 ) Miossec P, van den Berg W. Th1/Th2
cytokine balance in arthritis. Arthritis Rheum 1 9 9 7 ; 4 0 : 2 1 0 5 - 1 5 .05 ) Miossec P, Navilliat A, Banchereau J. Low
levels of interleukin 4 and high levels of transforming growth factor βin rheumatoid synovitis. Arthritis Rheum 1990;33:1180-87.06 ) Mosmann TR, Cherwinski H, Bond MW,
Giedlin MA, Coffman RL. Two types of murine helper T cell clones. I. Definition according to profiles of lymphokine activity and secreted proteins. J Immunol 1986;136:2348-57.07 ) Mosmann TR, Coffman RL. Th1 and Th2
cells: different patterns of lymphokine secre- tion lead to different functional properties.Annu Rev Immunol 1989;7:145-62.
08 ) Ishida H, Muchamuel T, Sakaguchi S,
Andrade S, Menon S, Howard M. Continuous administration of anti-interleukin 10 antibod- ies delays onset of autoimmunity in NZB/W mice. J Exp Med 1994;179:305-10.09 ) Rapoport MJ, Jaramillo A, Zipris D, Lan-
zarus AH, Serreze DV. Interleukin 4 reverse T cell proliferative unresponsiveness and pre- vents the onset of diabetes in nonobese dia- betic mice. J Exp Med 1994;178:87-89.1 0 ) Racke MK, Bonomo A, Scott DE, Cannella B, Levine A, Ranine CS. Cytokine-induced immune derivation as a therapy for inflamma- tory autoimmune disease. J Exp Med 1994;180:
1 9 6 1 - 6 .
1 1 ) Nicholson LB, Greer JM, Sobel RA, Lees MB, Kunchroo VK. An altered peptide ligand mediates immune deviation and prevents autoimmune encephalomyelitis. Immunity 1 9 9 5 ; 3 : 3 9 7 - 4 0 5 .
1 2 ) Martine C, Jean MD, Nocolas B, Francois F, Guillaume P, Lucien F, et. al. Human inter- leukin-17: A T cell-derived proinflammatory cytokines produced by the rheumatoid synovi- um. Arthritis Rheum 1999;42:963-70.
1 3 ) Fossies F, Djossou O, Chomarat P, Flores RL, Maat C. T cell interleukin-17 induces stromal cells to produce proinflammatory and hematopoi- etic cytokines. J Exp Med 1996;183: 2593-603.
1 4 ) Yal Z, Painter SL, Fansolw WC, Ulrich D, Macduff BM, Spriggs MK. Human IL-17: A novel cytokine derived from T cells, J Immunol 1 9 9 5 ; 1 5 5 : 5 4 8 3 - 6 .
1 5 ) Jovanovic DV, DiBattista JA, Martel PJ, Joli- coeur FC, Zhang M, He Y. IL-17 stimulates the production and expression of proinflammatory cytokines, IL-1 beta and TNF-alpha, by human macrophages. J Immunol 1998;160:3513-21.
1 6 ) Attur MG, Patel RN, Abramson SB, Amin AR. Interleukin-17 up-regulation of nitric oxide production in human osteoarthritis carti- lage. Arthritis Rheum 1997;40:1050-3.
1 7 ) Lotz M, Bober L, Narula S, Duldler J. IL-17 promotes cartilage degradation. Arthritis Rheum 1996;39;S:120.
1 8 ) Koch A. Angiogenesis: implications for rheuma- toid arthritis. Arthritis Rheum 1999;41:951-6.
1 9 ) Walsh DA. Angiogenesis and arthritis.
Rheumatology 1999;38:103-11.
2 0 ) Klagsbrun M, D’Amore PA. Regulators of angiogenesis. Annu Rev Physiolo 1991;53:217-38.
2 1 ) Dvorak HF, Brown LF, Detmar M. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpemeability and angiogenesis. Am J Pathol 1995;146:1029-35.
2 2 ) Conn G, Soderman DD, Schaeffer M, Wile M, Hatcher B, Thomas KA. Purification of glyco- protein vascular endothelial cell mitogen from a rat glioma-derived cell line. Proc Natl Acad Sci. USA. 1990;87:1323-31.
2 3 ) Ferrara NK, Carver M, Chen H, Dowd L, O’
Shea SO, Moore MW. Heterozygous embryonic lethality induced by targeted inactivation of the VEGF gene. Nature 1996;380:439-41.
2 4 ) Detmar M, Yeo KT, Hagi A, Water LV, Brown LF, Berse B, et. al. Keratinocyte- derived vascular permeability factor(vascular endothelial growth factor) is a potent mitogen for dermal microvascular endothelial cells. J Invest Dermatol 1995;105:44-51.
2 5 ) Senger DR, Galle SJ, Dvorak AM, Perazzi CA. Tumor cells secrete a vascular permeabil- ity factor that promotes accumulation of ascitic fluid. Science 1983;219:983-6.
2 6 ) Masaru H, Keiichi M, Hiroshi Y, Shotaro S, Elitaro T. Vascular endothelial growth factor in patients with rheumatoid arthritis. Scan J Rheumatol 1998;27:377-80.
2 7 ) Fava RA, Olsen G, Spencer G, Yeo KT, Brown LF. Vascular permeability factor/endothelial growth factor (VPF/VEGF): accumulation and expression in human synovial fluids and rheumatoid synovial tissue. J Immunol 1 9 9 4 ; 1 8 0 : 3 4 1 - 7 .
2 8 ) Masakazu N, Shinichi Y, Toshiyuki I, Goro A. Role of vascular endothelial growth factor in angiogenesis of rheumatoid arthrits. J Rheumatol 1995;22:1624-30.
2 9 ) Jackson JR, Minton JAL, Ho ML, Wei N, Winkler JD. Expression of vascular endothe- lial growth factor in synovial fibroblasts is induced by hypoxia and interleukin 1β. J Rheumatol 1997;24:1253-59.
3 0 ) Berse G, Hunt JA, Diegerl RJ, Morganelle P, Yoe KT, Brown LF, et. al. Hypoxia augments
cytokine (transforming growth factor-β( T G F -β) and interleukin (IL-1) induced vascular endothelial growth factor secretion by human synovial fibroblasts. Clin Exp Immunol 1 9 9 9 ; 1 1 5 : 1 7 6 - 8 3 .
3 1 ) Ikeda E, Achen MG, Breier G, Risau W.
Hypoxia-induced transcriptional activation and increased mRNA stability of vascular endothelial growth factor in C6 glioma cells. J Biol Chem 1995;270:19761-8.
3 2 ) Ben-Av P, Crofford LJ, Wilder RL, Hla T.
Induction of vascular endothelial growth fac- tor expression in synovial fibroblasts by prostaglandin E and interleukin-1: a potential mechanism for inflammatory angiogenesis.
FEBS Lett. 1995;372:83.
3 3 ) Cohen T, Nahari D, Cerem LW, Neufeld G, Levi BZ. Interleukin-6 induces the expression of vascular endothelial growth factor. J Biol Chem 1996;271:736-43.
3 4 ) Pertovaara L, Kaipainen A, Mustonen T, Organa A, Ferrara N. Vascular endothelial growth factor is induced in response to trans- forming growth factor-βin fibroblastic and epithelial cells. J Biol Chem 1994;269:6271-8.
3 5 ) Paleolog EM, Houng S, Stark AC, McClosdey RV, Feldmann M, Maini RN. Modulation of angiogenic vascular endothelial growth factor by tumor necrosis factor-αand interleukin-1 in rheumaotid arthritis. Arthritis Rheum 1 9 9 8 ; 4 1 : 1 2 5 8 - 6 4 .
3 6 ) Chabaud M, Fossiez F, Taupin JL, Miossec P. IL-17 enhances the effects of IL-1 on IL-6 and LIF production by rheumatoid arthritis synoviocytes. J Immunol 1998;161:409-15.
3 7 ) Dragan VJ, Johanne MP, John AB, Francosis M, Francosis CJ, Mohaned B, et. al. Stimu- lation of 92-kd gelatinase(Matrix meatllopro- teinase 9) production by interleukin-17 in human monocyte/macrophage. Arthritis Rheum 2000;43:1134-44.
3 8 ) Miossec P, Navilat M, Dupuy d’Angeac A, Sany J, Banchereau J. Low levels of inter- leukin-4 and high levels of trasnforming growth factor βin rheumatoid synovitis.
Arthritis Rheum 1990;33:1180-7.
