Immunohistochemical Study of Metallothionein Expression in Colonic Adenocarcinoma Correlation with p53, Topoisomerase II-α Expression and Apoptosis
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(2) 박용검 외：대장 선암종의 Metallothionein 발현에 대한 면역 조직화학적 연구. 389. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. 에서의 MT에 대한 연구가 흥미를 끌고 있는데, 종양에서의 MT의 역할은 첫째는, MT의 결핍상태와 cadmium의 암발생 및 항암효과에 대한 관련성과 자연적인 변이과정에 있어서 의 역할,(5-7) 둘째는 항암치료에 있어서의 약제에 대한 저 항성과 MT 과발현과의 역할,(8,9) 셋째는 면역조직화학적 방법을 이용한 MT의 과발현과 암의 발생 및 진행에 있어서 미치는 역할에 대한 연구이다.(10) 최근에는 다양한 종류의 종양에서 암진행단계에 따라 MT가 이질적으로 과발현된다는 보고들이 발표되고 있는 데,(11-13) 이러한 성적들은 MT의 과발현이 종양의 진행과 정에 관여한다는 동일한 결론을 내렸으나, 보고자에 따라 이미 알려져 있는 임상 및 병리학적 예후인자들과의 상관 관계에 대해서는 일치되지 않아 연구결과에 대한 많은 논 란이 되고 있다. MT는 zinc chelator로 작용하여 금속교환을 촉진하는 기 능을 하는데, 이 단백질의 과발현은 핵 내의 zinc를 감소시 켜 p53의 안정화에 필요한 zinc의 감소를 초래하여 결국에 는 p53의 기능을 억제할 수 있다고 한다.(14) MT의 발현정도는 세포주기 중 G1 후기와 G1-S기로 진행 되는 시기에 가장 많이 발현된다고 한다.(15) 이러한 점은 이 단백의 발현이 세포증식을 조절하는 기능을 할 수 있다 는 것을 시사하는 소견으로, 기존의 알려진 표지자인 Ki-67 이나 PCNA보다 세포증식에 민감한 DNA toposiomerase II-α (Topo II-α)를 이용하여 이에 대한 연구를 하고자 한 다.(16,17) 세포가 발암물질에 노출된 후 나타날 수 있는 세포 자멸 사 현상은 종양발생과정에서 초래되는 중요한 세포의 반응 중 하나로 알려져 있는데 여기에 관여하는 대표적인 유전 자산물이 p53단백이다. 이러한 의미에서 세포 증식능과 세 포 자멸사에 대한 연구는 종양의 성장과정을 이해하고, 그 종양의 예후를 판정하는데 중요한 지표가 되고 있으며, 최 근에는 암에서의 MT 발현과 세포 자멸사에 대한 연구도 되고 있다.(18) 이상과 같은 연구자들의 성적을 참고로 하여, 우리나라 에서 증가일로에 있는 대장 선암종에서의 MT의 과발현 및 이와 관련이 있을 것으로 사료되는 임상 및 병리학적 예후 인자들, p53 단백의 발현, 세포 증식능 및 세포자멸사와의 연관성을 관찰하고자 본 연구를 시행하였다.. 방. 법. 1) 연구재료 수집 및 검색 중앙대학교 부속 필동 성심병원에서 대장암으로 수술받 고 병리학적으로 침윤성 선암종으로 진단받은 예 중 조직 보관상태가 양호한 78예, 선종 20예, 그리고 선암종 조직 주 위의 정상점막 78예의 파라핀 포매조직을 이용하였다. 선 택된 환자들의 임상기록과 병리보고서 등을 재검색하여 환. 자의 나이, 연령 및 임파절 전이여부 등의 임상병리학적 예 후인자에 대한 조사를 하였으며, 선암종 환자의 유리슬라 이드를 재 검색하여 조직학적 분화도를 정하고 AJCC (American Joint Committee on Cancer, 6th ed.)의 병기를 이용 하여 병기를 정하였다. 2) 면역조직화학적 염색 파라핀 포매된 조직을 5μm 두께의 절편을 얻은 후 크실 렌으로 5분간 3회 탈 파라핀 시킨 후 무수알코올, 90%, 75% 및 50% 에탄올에 각각 2분씩 처리하여 함수시켰다. 조직 절편 내에 있는 내인성 과산화수소의 활성을 억제시키기 위해 3% 과산화수소와 메탄올의 혼합액에 10분간 처리 후 TBS 완충용액으로 5분간 세척하고 비 특이적 항원을 제거 하기 위해 30분간 염소혈청과 반응시키고 여분의 용액을 제거하였다. 그 다음 일차항체로 antimetallothionein (Santa cruz Co. 1： 100), anti-p53 (Dako Co. DO-7, 1：00), anti-topoisomerase II-α (Zymed Co. 1：50)를 사용하여, 실온에서 2시간동안 반응시 켰다. 일차항체 반응 후 절편을 TBS로 5분간 3회 수세한 다음 이차항체로 LSAB (Labelled strepavidin biotin) kit를 사 용하여 20분간 반응시켰다. 발색제는 AEC (3-amino-9-ethyl carbazole)를 사용하였고 Mayer's hematoxylin으로 대조염색 하여 glycerol gelatin으로 봉입한 후 광학현미경으로 관찰하 였다. 3) TdT-mediated dUTP-biotin nick labeling (TUNEL) 파라핀에 포매된 조직능 5μm로 박절하여 poly-lysine으 로 전 처리한 유리슬라이드에 부착 후 크실렌과 알코올 과 정을 거쳐 파라핀을 제거하고 알코올로 함수시켰다. In situ detection kit는 Mebstain Apoptosis kit II를 사용하여 유리슬 o 라이드를 증류수에 수세한 후 37 C PBS에 30분간 방치하였 다. PBS를 제거한 후 20μl/ml의 proteinase K 용액을 가하고 o 37 C에서 30분간 작용시켰다. 증류수로 2분간 4회 수세하 고 DNA nick & labeling 과정으로 50μl TdT buffer II를 가한 후 5∼10분간 실온에서 방치하였다가 여분의 용액을 제거 하고, 50μl의 TdT 용액을 가하고 37oC에서 60분간 작용시 켰다. TB 완충액을 용기에 넣고 유리슬라이드를 실온에 방 치한 후 PBS 완충액으로 5분씩 3회 수세하고 peroxidase가 결합된 strepavidin에 20분간 방치하였다. 반응이 끝난 후 유 리슬라이드 표본을 PBS 완충액으로 세척하고, DAB로 1분 동안 발색하였다. 그후 슬라이드를 중류수에 2분씩 3회 세 척한 후 Mayer's hematoxylin으로 10분간 배조염색하고 흐 르는 물에 수세하여 알코올 탈수과정을 거치고 Canada balsam으로 봉입 후 광학현미경으로 관찰하였다. 4) 연구성적 평가 MT는 세포질과 핵에 강하게 갈색으로 염색된 세포가 5%.
(3) 390. 대한외과학회지：제 68 권 제 5 호 2005. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. 이상이면 양성으로 판정하였으며, p53은 핵에 강하게 양성 으로 염색된 세포가 5% 이상이면 양성으로 판정하였다. Topoisomerase II-α와 TUNEL 염색에 대해서는 1,000개의 세포 중에서 핵에 강하게 갈색으로 염색된 세포의 수를 세 어 백분율로 표기하였다. 통계학적 분석은 Window용 SPSS (version 8.0, Systat, Chicago, USA)통계 프로그램을 이용하 여 analysis of variance (ANOVA)와 Pearson chi-square test 및 Fisher's exact test를 실시하였고, P값이 0,05 미만인 것을 유 의성이 있는 것으로 판정하였다.. 결. 과. 1) 임상소견 대장 선암종 78명의 성별은 남자가 36예(46.2%) 여자가 42예(53.8%)였고 연령분포는 36세에서 93세로 평균 60.7세 였다. WHO 기준에 의한 조직학적 분화도는 고분화도가 16 예로 20.5%, 중등도분화도가 49예로 62.8%, 저분화도가 13 예로 16.7%였다. AJCC의 TNM 분류법을 이용하여 암의 침 습성, 림프절 전이여부, 병기별로 분류하였을 때, T1은 9예 로 11.5%, T2는 65예로 83.3%, T3는 4예로 5.1%였고, 림프 절전이가 없는 군이 41예로 52.6%, 림프절전이가 있는 군이 37예로 47.5%를 차지하였다. 병기1이 6예로 7.7%, 병기2가 35예로 44.9%, 병기 3이 33예로 42.3%, 병기 4가 4예로 5.1% 였다.. 을 보였으며, 염색상은 상당히 이질적으로 관찰되었다. 3) 대장 선암종의 임상 예후인자에 따른 MT단백과 p53단백 발현 양상 여러 가지 임상예후인자에 따른 MT단백과 p53 단백의 발현을 관찰한 결과 다음과 같은 성적을 얻을 수 있었다 (Table 2). MT 단백의 발현은 성별에 따른 유의한 차이점은 없었으 며, T-stage증가, 림프절전이, 원격전이 및 clinical stage의 증 가에 따라 감소하는 경향이 있었으나, 통계학적인 유의성 은 없었다. 그러나 MT 단백의 발현은 암의 분화도가 좋을수 록 유의하게 증가하는 것을 알 수 있었다(P=0.047)(Fig. 3). p53 단백의 발현은 성별이나 암의 분화도에 따른 발현의 유의성을 볼 수 없었으나, T-stage (P=0.019), 림프절전이 (P=0.001) 및 stage (0.001)에 따라 통계학적인 유의성을 나 타내며, 증가되는 것을 알 수 있었다(Fig. 4).. 2) 병변에 따른 metallothionein 단백의 발현양상(Table 1) 암조직주위에서 관찰되는 비종양성 정상점막 선상피에서 는 78예 중 73예(93.6%)에서 선내강의 세포표면에 연하여 미만성으로 양성반응이 관찰되었다(Fig. 1). 선종은 저등급 형과 고등급으로 분류하여 관찰한 결과 저등급 선종에서는 10예 중 7예(70%)에서, 그리고 고등급의 선종에서는 10예 중 6예(60%)에서 양성반응이 관찰되었으며, 정상 장상피세 포와 다르게 선종의증식성 부위 중 산발적으로 군을 이룬 종양세포의 기저부에서 강하게 염색되는 양상을 보였다 (Fig. 2). 선암종에서는 78예 중 44예(56.4%)에서 양성 반응. Table 1. Immunohistochemical expression of metallothionein in colorectal neoplasia ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ MT protein MT protein (n) (-) (%) (+) (%) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Normal 78 5 (6.4) 73 (93.6%) TA, low grade 10 3 (30.0) 7 (70.0) TA, high grade 10 4 (40.0) 6 (60.0) Carcinoma 78 34 (43.6) 44 (56.4) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ *MT = metallothionein; †TA = tubular adenoma.. Fig. 1. The diffuse MT positive reaction in normal colonic glandular epithelia is seen (ABC, ×40).. Fig. 2. The focal MT positive reaction in proliferative glandular epithelia of tubular adenoma is seen (ABC, ×200)..
(4) 박용검 외：대장 선암종의 Metallothionein 발현에 대한 면역 조직화학적 연구. 391. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. 4) 대장 선암종의 임상예후인자에 따른 Topo II-α index 와 apoptotic index Ｔopo II-의 발현과 apoptotic cell은 핵 내에서 갈색반응을 나타내었다(Fig 5, 6). 성별, 암의 분화도, T-stage에 따른 선 암종에서의 topo II-α 지수는 증가하는 경향이 있었으나 유 의성을 나타내지 않았다. 그러나 암의 림프절전이(P=0.008), 원격전이(P=0.0001) 및 clinical stage (0.0001)에 따라 통계학 적 유의성을 보이며, 증가되는 것을 관찰할 수 있었다(Table 3). 대장 선암종에서의 apoptotic index의 변화는 림프절전이 (P=0.005) 및 clinical stage의 진행(P=0.028)에 따라 통계학적 유의성을 나타내며, 증가되는 것을 알 수 있었다(Table 3). Fig. 3. The strong MT positive reaction in colonic adenocarcinoma with moderate differentiation is seen (ABC, ×200).. Table 2. MT and p53 protein expression according to clinicopathologic datas ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ MT protein p53 protein ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ (n) (-) (%) (+) (%) (-) (%) (+) (%) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Sex Male 36 19 (52.8) 17 (42.2) 16 (44.4) 20 (55.6) Female 42 15 (35.7) 27 (64.3) 20 (47.6) 22 (52.4) *(P-value) NS NS Differentiation Well 16 4 (25.0) 12 (75.0) 11 (68.8) 5 (31.2) Moderate 49 22 (44.9) 27 (55.1) 20 (40.8) 29 (59.2) Poor 13 8 (61.5) 5 (38.5) 5 (61.5) 8 (38.5) (P-value) 0.047 NS T-stage 1 9 3 (33.3) 6 (66.7) 8 (88.9) 1 (11.1) 2 65 29 (44.6) 36 (55.4) 27 (41.5) 38 (58.5) 3 4 2 (50.0) 2 (50.0) 1 (25.0) 3 (75.0) (P-value) NS 0.019 Nodal mets Negative 41 16 (39.0) 25 (61.0) 26 (63.4) 15 (36.6) Positive 37 18 (48.6) 19 (51.4) 10 (27.0) 27 (73.0) (P-value) NS 0.001 Distant mets Negative 74 31 (41.9) 43 (58.1) 36 (48.6) 38 (51.4) Positive 4 3 (75.0) 1 (25.0) 0 (0) 4 (100) (P-value) NS NS Stage I 6 1 (16.7) 5 (83.3) 5 (83.3) 1 (16.7) II 35 15 (42.9) 20 (57.1) 20 (57.1) 15 (42.9) III 33 15 (45.5) 18 (54.5) 10 (30.3) 23 (69.7) IV 4 3 (75.0) 1 (25.0) 1 (25.0) 3 (75.0) (P-value) NS 0.001 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ NS = not significant; mets = metastasis; *The pearson chi-square of Fisher's exact test were used to compare all variables..
(5) 392. 대한외과학회지：제 68 권 제 5 호 2005. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. Fig. 4. The strong p53 positive reaction in colonic adenocarcinoma with well differentiation is seen (ABC, ×100).. Fig. 5. The diffuse Topo II-α positive reaction in colonic adenocarcinoma with poor differentiation is seen (ABC, ×100).. Table 3. Topo II-α index and Apoptotic index according to clinicopathologic datas in colonic adenocarcinoma ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ Topo II-α index Apoptotic index (n) (mean±S.D) (mean±S.D) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Sex Male 36 43.14±14.46 3.29±2.18 Female 42 40.80±13.75 2.71±1.84 *(P-value) NS NS Differentiation Well 16 36.41±8.19 2.33±2.21 Moderate 49 42.63±13.63 3.12±2.03 Poor 13 45.78±19.47 3.25±1.66 (P-value) NS NS T-stage 1 9 35.20±8.74 2.66±1.60 2 65 43.26±14.40 3.08±2.09 3 4 34.40±13.54 1.98±1.58 (P-value) NS NS Nodal mets Negative 41 37.93±11.85 2.39±1.88 Positive 37 46.26±15.10 3.64±1.97 (P-value) 0.008 0.005 Distant mets Negative 74 40.07±11.89 2.89±2.03 Positive 4 75.30±7.08 4.52±0.95 (P-value) 0.0001 NS Stage I 6 31.72±6.82 1.85±1.24 II 35 38.99±12.26 2.48±1.97 III 33 42.74±11.57 3.53±2.05 IV 4 75.30±7.08 4.53±0.95 (P-value) 0.0001 0.028 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ NS = not significant; Mets = metastasis; *The ANOVA test were used to compare all variables.. 5) 대장 선암종에서의 MT단백과 p53 단백발현의 상관성 대장 선암종 78예 중에서 MT 단백은 56.4% (44/78), p53 단백은 53.5% (42/78)에서 발현되었으며, MT 단백의 발현 정도에 따른 p53 단백의 발현양상을 관찰한 결과 통계학적 으로 유의한 역상관성(P=0.027)을 나타낸다는 것을 알 수 있었다(Table 4). 6) MT 단백의 발현과 Topo II-α index 및 Apoptotic index. Fig. 6. The tunnel positive apoptotic cells in colonic adenocarcinoma is seen (Tunnel method, ×200).. MT 단백이 발현되지 않는 선암종의 topo II-α 염색지수 는 45.12±16.33, MT 단백이 발현되는 선암종의 topo II-α 염색지수는 39.38±11.56로, MT 단백의 발현과 topo II-α 염.
(6) 박용검 외：대장 선암종의 Metallothionein 발현에 대한 면역 조직화학적 연구. 393. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Table 4. Correlation between MT and p53 protein expression ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ MT protein (n) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ (-)(%) (+)(%) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ p53 (-) 36 11 (30.6) 25 (69.4) p53 (+) 42 23 (54.8) 19 (45.2) (P-value) 0.027 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Pearson chi-square test.. Table 5. Topo II-α index and apopptotic index in colonic adenocarcinoma ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ MT protein ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ P-value (-) (+) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Topo II-α index 45.12±16.33 39.38±11.56 0.043 Apoptotic index 3.92±2.05 2.25±1.67 0.001 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ ANOVA test.. 색지수는 통계학적으로 유의하게 역상관성을 나타내었다 (P=0.043). Apoptotic index는 MT 단백이 발현이 되지 않는 선암종에서는 3.92±2.05, MT 단백이 발현되는 선암종에서 는 2.25±1.67로 서로 통계학적으로 유의성을 가지며(P= 0.001), 역상관성을 보였다(Table 5).. 본 연구자는 우리나라에서 증가일로에 있는 대장 선암종 과 전암성 병변에 있어서 MT의 과발현과 이와 관련이 있을 것으로 사료되는 임상 및 병리학적 예후인자의 관련성을 연구하였다. 대조군인 정상 선상피에서는 균일하게 장선의 내강연을 따라 양성반응이 93.6% (73/78)에서 관찰되었다. 선종 20예 중 저등급의 이형성변화를 보인 선종에서는 70% (7/10), 고등급의 이형성변화를 보인 선종에서는 60% (6/10) 의 양성반응이 관찰되었으나 두 분류 간에 특이할만한 차 이점을 발견할 수 없었으며, 정상 장상피의 발현양상과 다 르게 선종의 증식선 중에는 산발적으로 군(group)을 이룬 종양세포의 기저부에서 강하게 염색되는 부위가 관찰되었 다. 이러한 소견은 MT 발현세포의 clonal expansion의 가능 성을 시사할 수 있다. 선암종에서는 78예 중 44예(56.4%)에 서 양성반응이 관찰되었다. 여러 가지 임상병리학적 예후 인자에 따른 MT 단백의 발현의 연관성을 연구한 결과, 성 별에 따른 유의한 차이점은 발견할 수 없었으며, T-stage, 림 프절전이, 원격전이 및 clinical stage의 변화에 따라 발현도 가 감소하는 경향을 나타내었으나, 통계학적 유의성은 없 었다. 그러나 MT 단백의 발현은 암종의 분화도가 좋을수록 유의하게 증가하는 것을 알 수 있었다. 이러한 성적을 종합 해 볼 때 대장 선암종에 있어서 MT 단백발현의 예후인자로 서의 유용성에 대해서는 더 많은 연구 자료를 이용하여 다 방면적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. p53 단백의 과발현은 인체암의 50% 이상에서 출현한다 는 것이 이미 잘 알려져 있으며, 대장암에 있어서 p53 단백 의 발현은 예후측정을 평가하는 중요한 인자 중의 하나이 다. 본 연구에 있어서도 T-stage, 림프절전이 및 clinical stage 에 따라 통계학적 유의성을 가지며 증가하는 것으로 이러 한 사실을 확인할 수 있었다. MT는 zinc chelater로 작용하여 금속교환을 촉진하는 기 능을 하는데, 이러한 기능에 의해 이 단백의 이상발현은 핵 내의 p53의 안정화에 필요한 zinc의 감소를 초래하여 결국 에는 p53의 기능을 억제할 수 있다고 생각된다. 본 연구에 서 대장 선암종에서 MT 단백과 p53단백의 발현의 상관성 을 연구한 결과, MT 단백은 56.4% (44/78), p53 단백은 53.5% (42/78)에서 발현되었으며, MT 단백의 발현정도에. 고. 찰. Metallothionein (MT)은 cysteine 잔류기가 많은 6∼7 Kd의 작은 분자량을 가지는 단백질로, Zn, Cu, Cd, Hg, Silver 및 platinum과 같은 2가 중금속과 강한 친화력을 가지며,(19) 조직이나 세포에서 중금속의 비독성화과정에서 유리기의 scavenger 역할을 하는 것으로 알려져 있다.(2) MT는 말의 신장에 있는 Cd, Zn 단백질로 알려졌으며 (20), 그후 eukaryotic species의 다양한 조직이나 세포에서도 존재한다는 것이 밝혀졌다. 이 단백질의 합성은 중금속에 노출된 세포에서 DNA sequence와 cellular factor의 상호작용 에 의해 MT 유전자의 transcription rate가 증가되어 조절된 다. 이외에도 MT gene transcription은 glucocorticoids, interferon, stress condition 등에 의해 유도될 수 있으며, 또한 amplification, methylation과 같은 gene structure의 변화 및 세 포의 분화와 발육에 의해 변화될 수도 있다.(20,21) 위와 같이, 인체에서 여러 가지 변화에 의해 발현되는 MT 단백은 면역조직화학적 방법을 이용하면 흉선, 간, 소 장 갑상선 등에서 세포의 핵이나 세포질 내에서 형태학적 으로 증명할 수 있으며, 다양한 악성종양들, 정소의 배아암 종, 갑상선암종, 방광암종, 유방암, 흑색종등에서도 MT 발 현이 증명되었다.(10,11,22-24) 악성종양에 있어서 MT의 발 현증가는 종양세포 대사의 변화, 세포활성도의 증가, 다른 종양유전자의 활성화, DNA 손상에 대한 방어기전 등에 의 한 이차적인 변화일 것으로 알려지고 있다.(25-29) 그 후에 도 대장암(12), 췌장암(13), 식도암(30)에서도 암의 진행단계 에 따라 MT가 이질적으로 과발현된다는 보고들이 발표되 고 있으나, 이 단백의 발현이 현재 널리 이용되고 있는 임상 및 병리학적 예후인자들과의 상관관계에 대해서는 일치되 지 않아 연구결과에 대해 많은 논란이 되고 있다..
(7) 394. 대한외과학회지：제 68 권 제 5 호 2005. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. 따른 p53 단백의 발현양상은 통계학적으로 유의하게 역상 관성을 나타내었다. 그러나 MT 단백과 p53 단백 발현양상 의 역상관성에 대한 의미는 암의 침윤도나 전이 등의 기존 의 예후인자와의 연관성이 명확하지 않으므로 예후인자로 서의 임상적 이용에 대해서는 앞으로 다양한 연구가 이루 어져야 할 것으로 사료된다. 또한 MT 단백의 발현에 따른 세포증식능을 평가하기 위 해 Ki-67이나 PCNA보다 더 민감한 것으로 알려진 세포증 식표지자인 topoisomerase II-α를 이용하여 다양한 임상병 리학적 예후인자들과의 상관성을 연구한 결과 toposiomerase II-alpha의 발현은 암종의 림프절전이, 원격전이 및 clinical stage에 따라 통계학적으로 유의성을 보이며, 증가 되는 것을 알 수 있었다. 또한 MT 단백의 발현과 topo II-α 발현의 연관성을 알아 본 결과, MT 단백이 발현되지 않는 선암종의 topo II-α 염색지수는 45.12±16.33, MT 단백이 발 현되는 선암종의 topo II-α 염색지수는 39.38±11.56으로 유 의하게 역상관성을 나타내었다. 세포가 발암물질에 노출된 후 나타날 수 있는 세포 자멸 사 현상은 종양의 발생과정에서 초래되는 중요한 세포의 반응 중의 하나로 알려져 있는데, 이 세포 자멸사를 조절하 는 종양유전자들의 변화에 의해 자멸사가 억제됨으로써 클 론의 팽창이 야기되어 종괴를 형성하는데 관여하는 것으로 알려져 있다. 이러한 의미에서 세포 자멸사에 대한 연구는 종양의 성장과정을 이해하고 그 종양의 예후를 판정하는데 중요한 지표가 되고 있다.(18) 본 연구에서 대장 선암종의 세포자멸사 염색지수의 변화는 림프절전이 및 임상병기의 진행에 따라 통계학적 유의성을 나타내며, 증가되는 것을 알 수 있었으며, MT 단백의 발현과 세포 자멸사 지수의 연 관성을 관찰한 결과 세포자멸사 염색지수는 MT 단백이 발 현되지 않는 선암종에서는 3.92±2.05, MT 단백이 발현되 는 선암종에서는 2.25±1.67로 통계학적으로 유의하게 역상 관성을 나타내었다. 이상과 같은 성적을 종합해 볼 때, MT 단백의 발현은 대장선암종의 진행속도를 조절하는데 일부 관여할 것으로 사료된다.. 결. 론. 한국인에서 발생하는 5대 암 중의 하나인 대장 선암종에 서 metallothinein 의 과발현 및 이와 관련이 있을 것으로 사 료되는 임상 및 병리학적 예후인자들, p53 단백의 발현, 세 포 증식능 및 세포자멸사와의 연관성을 연구한 결과, MT 단백의 발현은 암의 분화도가 좋을수록 증가하며, 세포증 식능과 세포자멸사와의 역상관성을 나타내는 점을 미루어 보아, 대장선암종의 진행속도를 조절하는데 일부 관여할 것으로 사료된다. 그러나 여러 가지 임상예후인자와의 연 관성이 다양하므로 p53과 같은 예후인자로서의 유용성에 대해서는 좀 더 많은 연구가 필요하다고 생각된다.. REFERENCES 1) Cherian MG. Metallothionein and its interaction with metals. In: Goyer RA, cherian MG editors. Toxicology of Metals Biochemical Aspects. Berlin. Heidelberg. Springer-Verlag Inc 1995;121-32. 2) Sato M, Bremner L. Oxygen free radicals and metallothionein. Free radical Biol & Med 1993;14:325-37. 3) Jasani B, Elmes ME. Immunocytochemical detection of metallothionein. Methods Enzymol 1991;205:95-107. 4) Anstey A, Marks R, Long C. In vivo photoinduction of metallothinein in human skin by ultraviolet irradiation. J Pathol 1996;178:84-8. 5) Waalkes MO, Divan BA, Weghorst CM, Bare RM, Ward JM, Rice JM. Anticarcinogenic effects of cadmium in B6C3F1 mouse liver and lung. Toxicol Appl Pharmacol 1991;110: 327-35. 6) Coogan TP, Shiraishi N, Waalkes MP. Apparent quiscence of metallothionein gene in rat ventral porstate-association with cadmium-induced prostate tumours in rats. Environ Health Persper 1994;102:137-9. 7) Goncharova EI, Rossman TG. A role of metallothionein in spontaneous mutagenesis. Cancer Res 1994;54:5318-23. 8) Kelly SL, Basu A, Teicher BAQ, Kacker MP, Hamer DH, Lazo JS. Overexpression of metallothionein confers resistance to anticancer drugs. Science 1988;241:1813-5. 9) Cherian MG, Huang PC, Klaassen CD, Liu YP, Longfellow DG, Waalkes MP. National cancer institute workshop on possible roles of metallothionein in carcinogenesis. Cancer Res 1993;53:922-5. 10) Bahnson RR, Beich M, Ernstoff MS, Sandlow J, Cohen MB, Williams RD. Absence of immunohistochemical metallothionein staining in bladder tumour specfimens predicts response to nonadjuvant cistoplatin, methotrexate and vinblastine chemotherapy. J Urol 1994;152:2272-5. 11) Fresno M, Wu W, Rodriguez JM, Nadji M. Localization of metallothionein in breast carcinomas. An immunohistochemical study. Virchows Arch (A) 1993;423:215-9. 12) Ofner D, Maier H, Riedmann B, Bammer T, Rumer A, Winde G, et al. Immunohistochemical metallothionein expression in colorectal adenocarcinoma; correlation with tumor stage and patient survival. Virchows Arch 1994;425:491-87. 13) Oshio G, Imamura T, Okada N, Wang ZH, Yamaki K, Kyogoku T, et al. Immunra M Immunohistochemical study of metallothionein in pancreatic carcinomas. J Cancer Res Clin Oncol 1996;122:351-5. 14) Heinart P, Milner JA. Structural role for metal ions in the “wild type” conformation of the tumor suppressor protein p53. Cancer Res 1993;53:1739-42. 15) Nagel WW, Valle BL. Cell cycle regulation of metallothionein in human colonic cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 1995;.
(8) 박용검 외：대장 선암종의 Metallothionein 발현에 대한 면역 조직화학적 연구. 395. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ 92:579-83. 16) Lynch BJ, Guinee DG, Holden JA. Human DNA topoisomerase II-α: a newmarker of cell proliferation in invasive breast cancer. Human Pathol 1997;28:1180-8. 17) Nakopoulou L, Lazaris AC, Kavantzas N, Alexandrou P, Athanssiadou P, Keramopoulos A, et al. DNA topoisomerase II-α immunoreactivity as a marker of tumor aggressiveness in invasive breast cancer. Pathobiology 2000;68:137-43. 18) Deng DX, Chakrabarti S, Waalkes M, Cherian MG. Metallothioneinand apoptosis in primary hepatocellular carcinoma and metastatic adenocarcinoma. Histopathol 1998;32:340-7. 19) Nishimura N, Nishimura H, Tohyama C. Localization of metallotjionein in female reproductive organs of rat and guinea pig. J Histochem Cytochem 1989;37:1601-7. 20) Kagi JHR. Overview of the metallothionein. Methods Enzymol 1991;205:613-26. 21) Jahroudi N, Foster R, Price-Haughey, Gedamu L. Cell-type specific & differential regulation of the human metallothionein gene. J Biol Che 1990;265:6506-11. 22) Kontozoglou TE, Banerjee D, Cherian G. Immunohistochemical localization of metallothionein in human testicular embryonal carcinoma cells. Virchow Arch (A) 1987;415:545-9.. 23) Nartey N, Cherian MG, Banerjee D. Immunohistochemical localization in human thyroid tumors. Am J Pathol 1987;129: 177-82. 24) Zelger B, Hittmair A, Schir M, Ofner C, Schmi KM. Immunohistochemically demonstrated metallothionein expression in malignant melanoma. Histopathology 1993;23:257-64. 25) Vallee BL, Galdes A. The metallobiochemistry of zinc enzymes. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 1984;56:283-430. 26) Meskel HH, Cherian MG, Martinez VJ, Veinot LA, Frei JV. Metallothionein as an epithelial proliferative compartment marker for DNA flow cytometry. Mod Pathol 1993;6:755-60. 27) Schmidt CJ, Hamer DH. Cell specificity and an effect of ras on human metallothionein gene expression. Proc Natl Acad Sci USA 1986;83:3346-50. 29) Fornace AJ, Schalch H, Alamo I. Coordinate induction of metallothioneins I and II in rodent cells by UV irradiation. Mol Cell Biol 1988;8:4716-20. 30) Hishikawa Y, Koji T, Dhar D, Kinugasa S, Yamaguchi M, Nagasue N. Metallothionein expression correlates with metastatic and proliferative potential in squamous cell carcinoima of the oesophagus. Br J Cancer 1999;81:712-20..
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