Properties of 3-Deoxy-D-Arabino-Heptulosonate 7-Phosphate Synthase in Intrasporangium sp.

K"r. f. Appl. Microbiol. BηJeng.

V" l. 16 , No. 1, 51-58 β98잉

Intrasporangiur.n속 방선 균의 3-Deoxy-D-Arahino-Heptulosona te 7-Phosphate Synthase 성 질

조원대 1. 최용진 2. 양한칠 1 *

l

고려대학교 식품공학과 2고려대학교 유전공학과

Properties of 3-Deoxy-D-Arabino-Heptulosonate 7-Phosphate Synthase in Intrasporangium sp.

Cho , 찌'on-DaÏ'， Yong-Jin Cho Ì,I and Han-Chul Yang

Department 0/ Food Technology, 2Department 0/ Genetic Engineering, College 0/ Agriculture , Korea University , Seoul136-701 , Korea

The first enzy ^l" e of the aromatic amino acid biosynthetic pathway 3-deoxy-D-arabino-hepuloso- nate 7-phosphate(DAHP) synthase (E.C .4 .1.2.1S) of a species of Intrasporangium isolated from soil , has been purified 8.6 f이d and characterized. Partially purified preparations of the enzyme have a pH optimum of 7.S and a temperature óptimum of 4S o C. The activation energy of the enzymatic reaction was estimated to be 12.6 Kca l / mole. Heat inactivation occurred rapidly above 4S o c, Phos- phoenolpyruvate protected the enzyme against the heat inactivation whereas the presence of eryth- rose 4-phosphate increased the rate of inactivation. On the basis of kinetic experiments the mechani- sm of the enzyme action was found to be ping-pong bi-bi , and the first substrate was deduced to be phosphoenolpyruvate. The absolute Michaelis constants of the DAHP synthase have been determin- ed to be O.2mM for phosphoenolpyruvate and O.14 mM for erythrose 4-phosphate. Co + + stimulated the enzyme activity whereas EDTA inhibited the enzyme activity strongly. The inhibition by EDTA was , however , reversed by the addition of Co + +. p-Chloromercuribenzoate and other sulfhydryl reagent reversibly inactivated the enzyme. Di thiothreitol protected the enzyme inactivation against the sulfhydryl compound but phosphoenolpyruvate did not.

방선균을 이용한 방향족 아미노산의 산엽적 생산 성되어 있으며 이 효소가 촉매하는 공통경로의 첫벤 가능성을 타진하고저 저자 등은 L-phenylalanine 생 째 반응이 방향족 아미노산 생합성과정중에서 극히 산능이 있는 방선군을 토양무로 부터 분리하여 중요한 한 대사조절 단계가 되고 있다는 것을 확인 Intrasporangiμm 속으로 동정 ， 그 결과를 이미 보고 보고 하였다 (2).

한 바 있으며 (1) 이어서 방향족 아미노산 생합성 대 본 보에서는 부분정제한 DAHP synthase를 사용 사과정 중 공통경 로의 첫 벤째 반응， 즉 erythrose 하여 DAHP synthase의 효소학적 특성 을 조사， 그 4-phosphate 와 phosphoenolpyruvate 를 축합하여 결과플 보고한다.

3-d eoxy-D-arabino-h eptul osonate 7 - phospha te

(DA HP) 흘 생성하는 반응을 촉애하는 효소인 재료 및 방법

DAHP synthase (E .C .4.1. 2.15) 의 대사조절 특성을 조

사， 본 시험균의 DAHP synthase는 최종 대사산물 사용균주 및 시약

중 tryptophan에 의해서만 fεedback inhibition과 동 DAHP synthase 생산을 위해 본 연구에서 사용한 시에 feedback repression을 받는 단일 단백질로 구 균주는 Iηtrasporaη:gzum 속의 토양분리 방선균이었

Key words: Enzyme properties, 3-deoxy-D-arabinose-heptulosonate-7-phosphate synthase Inlrasporangium sp.

'Corresponding author

51

52

요 며 D-erythrose 4-phosphate(sod. salt) , phosphoenolpyruvate(mónocyclohexy 1 ammonium salt) , bovine serum albumin , dithiothreitol , p-chloromercuribenzoate(pCMB) , 5 , 5' -di thio-bis-

(2-nitrobenzoic acid)(DTNB) 및 glutathione (GSH)

등의 시약은 Sigma 사 제품， 기타 일반 시약은 시판 일급이상의 분석용 시약을 사용하였다.

배지 및 배양조건

효소생산을 위한 균체 증식 배지는 b t: Cfer 56 (3)

에 glucose (10 g/ l)을 첨가한 최소 배지를 사용하였

~o~ 동일배지에서 48시간 진탕배양한 균체를 종균

￡로 사용， 약 2% 정도 접종하고 30.C 에서 48시간 본 배양하여 얻은 균체를 효소원으로 이용하였다.

효소정제

전보 (2) 에 상솔한 바와 같이 48시간 진탕배양한 배양액￡로 부터 분리한 균체플 sonicator로 파쇄한 다음 원심분리하여 얻은 상등액을 조효소액으로 사 용하였다. 이 조효소액을 ammonium sulfate 분획과

acetone 분획하여 조효소액에 비해 약 8， 6배 정제된 부분 정제 효소를 얻었다.

DAHP synthase 활성측정

DAHP synthase 의 활성측정은 전보에 상솔한

Gollub(4) 등의 방법에 따라 37'C 에서 정확히 10분 간 반응시켜 이때 생성되는 DAHP을 정량하여 효소 활성을 산출하였다.

Specific activity 측정

DAHP synthase 1 unit는 3 7' C , 1분간 반응으로

O. 1 μ mole DAHP를 생산할 수 있는 효소량A로 정 의하였으며 specific activity는 효소단백질 mg 당 unit (u) 로 표시하였다 .

단백질 정량

Lowry 등의 방법 (5) 에 따라 bovine serum albu-

mm을 표준단백질로 사용하여 시료중 단백질량을 측 정하였다.

결과 및 고찰

효소활성에 미치는 온도의 영향

Koχ ]. App l. Microbi

'()l. Biocng

을 조사하여 Fig， l과 같은 결과를 얻었다. 본 효소

는 45.C 부근에서 가장 높은 활성을 나타냈으며 최

적온도를 벗어나면 현저한 활성저하를 보였다 Fig，

2는 Arrhenius polt로서 25-45.C 사이의 온도에서 는 직선을 나타내고 있으나 그 이상의 온도에서는 아마도 열불활성화에 의한 효소활성저하로 직선에서 크게 벗어나는 경향을 나타냈다. 한편 Fig， 2로 부터 계 산된 DAHP synthase의 활성 화에 너 지 는 12 , 6 kca i/ mole로서 다른 방선균인 Streþtomyces aμ y­

eofaciens DAHP synthase의 최 적 온도와 활성 화 에 너 지 (50.C , 16 ^, 5kcal/ mole) (6) 에 비 해 약간 낮은 값을 나타냈다.

효소활성에 미치는 pH으| 영향

본 시험균의 DAHP synthase는 반응액의 pH에 비 교적 민감한 효소로 생각된다. 따라서 최적 pH인 7 ,

5를 벗어나면 효소활성이 급격히 저하되었다 (Fig，

3) , E , coli를 비롯한 다수의 다른 미생물 DAHP

synthase의 최적 pH가 6 , 0-7 , 0 사이라고 보고 (6 -ll) 되고 있는데 이들과 비교해 볼 때 본 효소는 약간 높은 최적 pH를 나타낸다고 하겠다. 또 Tabìe

l은 효소반응에 사용한 완충용액의 효과를 조사한

「

l l

l

l

’ ---

때

( S )

>‘

i

.~ 50

}

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에

<11

.-

}

0:\

'"

~

i _ _ _ L. _ _ l

l _ _

25 30 35 40 45 50

Temperature (OC)

Fig. 1. Effect of temperature on activity of DAHP syn- thase.

DAHP synthase 활성에 미치는 반응온도의 영향 units of DAHP synthase.

Activities were determined in the standan :t assy mixture

as described under

Materials and Methods" with 12.2

v"l. 16 , No. 1 53

Table L DAHP synthase activity in various buffers

L5

Relative Activity(%) Buffer Solution (pH 7.5)

100 126 89 158 161 KH2P04-K2HP04

KH2P04-Na2HP04 Citric acid-Na2HP04 Tris-HCl

Tris-Maleic ac id

~

1. 0 ‘

-->

@=- Concentration of the buffers ; 0.04M.

0.5r (a)

0.03

0.01 c..

v/

0.02 - 1f Vo

320 330

1fT ( x 10

K)

Fig. 2. Arrhenius plot of the initial rate of DAHP for- mation against reciprocal of absolute temperature.

12.2 units of DAHP synthase were used in the standard react

n mlxture.

340 310

10 5

11 (p EP J( mM) 결과로서 일 반적 으로 phosphate buffer에 비 해 tns

buffer를 사용했을 때 훨씬 높은 효소활성을 나타냈

으며 특히 tris-maleate b uffer를 사용했을 때 효소활

₎

n u

(

100

O

。

。

。

(

-

‘

-

~

확 50

-

-

t다

。

Fig. 4. Lineweaver-Burl ‘ plots of DAHP synthase.

(a) The reaclion mixture conta ined 40μ l1l o!e potassium phosphale buffer (pH 7.0) , 0.5μ ll1 o!e erythrose 4-phos phate , 12.2 units of l he enzy

e and phosphneno!pyru- vate as indicated in a total vo!ume of 1. 0m/. (b) The reacl ion mixlure cnntained 40μmo!e potassium phos- phate buffer (7.0 ), 1.0μ l1l o1e phnsphoeno!pyru\'ale , 12.2 units of the enzy

e and er ythrose 4-phosphate as in- dicated in a tnta! vnlu

e of 1. 0111/. The initia! ve!ocity , Vo , is expressed as μmoles of DAHP formed per

in . per 1111 of reaction mixture .

5 10 l f [E 4Pl (mM)

。

7.0 8.0 9.0

pH

Fig. 3. Effect of pH on activity of DAHP synthase.

The standard reaction mixture was used in 0.04M phos- phate buffer of \'arious pH values

6.0

5.0

54

성 이 가장 높았다. 한편 E. coli DAHP synthase는 사용 완충용액의 종류에 큰 영향을 받지 않￡나 (12) Neμγospora crassa DAHP synthase 는 phosphate

buffer보다 tris buffer에서 약간 높은 활성을 나타냈 다고 보고 (ll) 하고 있어 본 효소와는 약간의 차이 가 있￡냐 DAHP synthase 효소반응의 첫 단계 , 첫 반 응 생성물이 무기인산이란 점을 고려한다면 phos- phate buffer를 사용했을 때 tris buffer에 비 해 낮은 효소활성을 나타내는 현상은 쉽게 이해할 수 있겠

기질농도의 영향

반응액의 erythrose 4~phosphate 농도를 0.5μ mole/ ml로 고정하고 phosphoenolpyruvate의 농도 를 달리 하여 (0.1-0.8 mM) DAHP synthase 활성 에 미 치 는 phosphoenolpyruvate 농도의 영 향과， 반대 로 phosphoenolpyruvate의 농도를 고정 (l μ mole/

ml) 시키고 erythrose 4-phosphate의 농도를 달리하 여 효소활성에 미치는 기질농도의 영향을 조사해 본 결 과 두 기 질 이 모두 정 규적 인 Michaelis-Menten

a 11 !p EPl (mM)

10 ⁹

1 1 (E 4Pj (mM) Fig. 5. Double recipr ‘’ cal plot of the initial rate of DAHP synthase.

(a) vs. phosphoenolpyruvate cnncentration in the pres- ence of a series of fixed concentration of erythrose 4 -phosp lJ ate; ., O.06mM; 。 ’ O.09mM; ‘ ^{, O.12mM;6 ,}

O.18mM and (b) vs. eryt lJ rose 4-phosp lJ ate concentra- tion in the presence of series of fixed concentrations of p lJ osphoenolpyruvate; ., O.08mM; 0 , O.12mM; ‘ ^,

O.18mM; 6 , O.24mM. The reaction mixture contained 12.2 units of the enzyme, p lJ osphoenolpyruvate and erythrose 4-phosphate as indicated in 1ml

K" ’: ]. App l. Microbiol. Bio찌찌.

Kinetics를 나타냄으로써 직선의 Lineweaver Burk polt을 얻을 수 있었다 (Fig， 4) , 따라서 싱가 polt로 부터 계산한 phosphoenolpyruvate의 absolute Km 값 은 0 ^, 2 mM, erythrose 4-phosphate의 absolute Km

값은 0 , 14 mM이었다. 이와같은 Km 값은 다릎 방선 균인 Strepto~yces auγeofaciens의 DAHP synthase

가 나타내는 두 기질에 대한 Km값 (phosphoenolpyr

uvate, 0.3 mM; erythrose 4-phosphate, 0.16 mM) (6) 과 매우 근사한 수치라고 하겠다. 한펀 Fig , 5에 표

시되어 있는 바와 같이 서로 다른 erythrose

4-phosphate의 4개의 고정농도에서 phosphoenolpyr - uvate 농도의 역 수에 대 한 DAHP 합성 속도를 plotting하거 나 또는 phosphoenolpyruvate의 4개 고 정 농도에서 erythrose-4-phosphate 놓도의 역 수에 대 한 DAHP 합성속도의 역 수를 plotting함으로서 각 각 기울기가 같은 4개의 평행직션을 얻을 수 있었 다， Cleland (13) 에 의 하면 이 와같은 반응초속도 pattern은 ping-pong bi-bi mechanism을 나타내 는 것으로 아래 도표와 같이 DAHP synthase가 첫번깨 기질과 반응해서 첫번째 반응 생성물이 생성된 이후 에 비로서 두번째 기질의 결합이 일어냐는 반응기구 플말한다.

1

’ p

i----

-꽤 페

-Pι /시

빵 -μ E

E4P DAHP

F I (F E4P) I E I(E DAHP)I

10

Scheme; Graphical representation of the reaction sequence leading to the formation of DAHP.

PEP; phosphoenolpyruvate E4P; erythrose 4-phosphate F; pyruvyl-enzyme intermediate

이와 관련하여 본 시험균 DAHP sythase의 열안 정 성 시 힘 결과 (Fig, 7) , 즉 phosphoenolpyruvate의 열불활성화의 현저한 방지효과를 보이는 반면 erythrose 4-phosphate는 오히 려 불활성 화를 촉진하 는 효과를 나타내는 점으호 보아 phosphoenolpyr uvate가 첫번째 기질인 것￡로 추측되며 이와 같은 반응기구는 이미 다른 많은 연구자에 의해서도 보고

(6 , 12 , 14 , 15) 된 바 있다.

금속이온의 효과

Table 2에 표시되 어 있는 각 금속이온을 효소반응

액에 4X10-

M 첨가하여 DAHP synthase 활성을

측정， 금속이온의 효소활성에 미치는 효과를 조사해

μ11. 16，

N(/.1

S ( )

mω

‘{

}

; i · υ

〈

:

여

_____

_ _ _ .J... T . L

5 10 15 20

Time '(min.)

Fig. 6. Heat inactivation of DAHP synt hase a t various iemperatures.

The enzyme (100 μg of protein per m l) was incubated in 0.05M pOlassiu

phosphate buffer (pH 7.0) at ~he indi- cated temperatures. A i:: ti\'ity was determined in the standard reaction mixture

。 . 30

C;6 ,45

C; C , 50

C

본 결과 다흔 대다수의 미생울 DAHP synthase(6, 11, 14, 16, 17, 18) 마찬가지로 본 효소 역시 CO++

이 온에 의하여 활성화되며 (Table 2) 1 m M 농도에서 최고 22% 정도 활성증가를 보였다 (Table 3). 0] 에

비해 Mn++ 이온은 특별한 효과를 보이지 않는 반면

에 MoO: 이온에 의해서는 약간 활성화되었다. 이와 같은 금속이 온 효과는 다른 미 생울 DAHP synthase 와 다른 본 DAHP synthase의 특이 한 점 이 라 하겠

Table 2. Effect of metal ions act ivity of DAHP syn- thase.

Meta! ions Re!ative Activity(%)

No addition 100

CO+ + 109

Cu++ 27

Fe++ 98

Mg+ + 101

M

+ 99

Zn tt 21

Mo0 4 = 106

The standard reaction mixture was used and each metal ion was added at the concentratÎo

s of 4 x 1O- 3 M

55

Table 3. Effect ‘’ f the concentrations of Co + + ion on ac- tivity of DAHP synthase.

Concentration(M) 1 X 10- 4

5 X 10- ⁴ 1 x 10- ³ 2.5 X 10- ³ 5 ^X 10- ³

Relative Activity(%) 115 118 122 113 105 Activities were determined in the standard reactio

as described under “ Materials and Methods"

다. 또 본 효소는 EDTA 첨가에 의해 다른 DAHP synthase와 마찬가지로 현저한 활성저하 현상을 나 타냈으나 이와같은 활성 저 하는 Co++ 아온의 첨 가로 완전회복되었다 (Table 4).

DAHP synthase의 안정 성

부분정제한 DAHP synthase 용액을 4

C 에서 7 일 간 보존하면서 보존기간에 따른 실활정도를 측정，

Table 양+ 장은 결과를 얻었 다. 본 DAHP synthase 는 보존 3일째 약 75% 그라고 영주일되었을 때는 약 80%의 활성을 잃음으로서 생체내 (2) 에서 뿐만 아니라 생체외에서도 비교적 불안정한 효소로 밝혀 졌다. 그러나 dithiothreitol은 뚜렷한 안정화 효과를 나타냈으며 특히 Co++ 이온과 같이 첨가했을 때는 상승적인 안정화 효과를 보여 일주엘 보촌 후에도 50% 이상의 효소활성이 유지되었다.

Ta ble 4. Stability of DAHP synth ase.

Storage Time (Days) Relati ve Activity(%)

Reagent 0 1 3 7

None 100 36 26 20

Phosphoenolpyruvate(lmM) 103 36 23 20

ço+ +(1 mM) 124 42 26 19

EDT A- 2Na(0.lmM) 31 13 8 8

Albumin(500 μg/m l) 102 34 26 20 Dithiothreitol(lmM) 118 39 35 30

EDTA- 2N~ + Co+ + 125 40 23 20 PhosphoenolpYl

va te + Co + + 128 47 29 23 Dithiothreitol + Co+ + 143 70 58 52 Albumin + Co+ + 128 45 30 24 Phosphoenolpyruvate 117 50 42 39 + Dithiothreitol

200 μ g protein and each additions at the concentrations

indicated were incubated at 4

C.

56

DAHP synthase의 열 안정성

부분정제 효소액을 30

C , 45

C 빛 50

C 의 각 온도 에서 일정시간 가열한 후 효소활성을 측정하여 열안 정성을 검토한 결과 Fig.6에 표시되어 있는 바와같 이 30

C , 20분간 가열에 의해서도 전혀 실활되지 않 았A나 45

C 이상의 온도에서는 매우 불안정하여 50

C 에서 5분간 가열했을 때 약 80% 설활되었다.

한편 열안정성에 미치는 기질의 영향을 조사해 본 결 과， phosphoenolpyruvate 는 DAHP synthase 의 열불활성화를 억제해 주는 현저한 효과를 보인 반면 에 erythrose 4-phosphate는 오히 려 열불활성 화를 촉진해 주는 결과를 초래했다 (Fig. 7). S. tyþhimμ­

n‘μ m (1 5) 과 Streþtomyces a μ reof<α ciens DAHP

synthase (6) 에서도 이와같은 효과를 관찰했다고 보

고하고 있으며 이것은 aldose의 aldehyde기에 그 원 인이 있을 것무로 추정하고 있다.

S비fhydryl 시 약의 효과

E. coli와 N. crassa플 81 옷한 다수 미생물의

… …

ι

-김

-; ”}

5 10 15

Time (min.)

Fig. 7. Heat inactivation ‘’ f DAHP synthase in the presence ()f the substrates.

The enzyme (1 00μg of prntein per m l) was incubated at 45

C in 0.05M potassiu

phosphate buffer (pH 7.0) Samp!es were taken at time zero and the other times in.

dicated and were assayed in the standard reaction mix.

1 ure. 6., enzy

e in lhe none of subsl rales; 0 , enzyme in the presence of 4.0mM phosphoeno!pyruvate; 仁， en- zy

e in the presence of O.lmM erythrose 4-phosphate.

K"y. J Appl. Mi，α"biol. Bioenμ.

DAHP synthase(ll , 19) 는 pCMB 등의 sulfhydryl 시약에 의해 강력한 효소활성 저해현상을 나타낸다 고 보고되고 있다. 본 시험균의 DAHP synthase 역 시 Fig.8에 표시되어 있는 바와같이 pCMB 빛 DTNB의 극히 낮은 농도에서도 현저한 활성저해 현 상을 보이고 있유나 이와같은 효소활성 저해는 가역 적 인 현상￡로서 dithiothreitol의 첨 가로 효소활성 이 완전히 회복되었다.

한편 glutathione에 의 해서도 효소활성 이 저 해되 었 으며 이 는 glutathione 이 금속이 온 chelating agent 로 작용하기 때문인 것으로 생 각된다.

Staub 와 Denes (19) 등은 E. coli

의 pheny- lalanine sensitive DAHP synthase 는 기 질 인 phosphoenolpyruvate (60 μ mole) 에 의 해 DTNB에 의한 활성저해가 효과적으로 방지되었다고 보고하고 있다. 그러나 본 DAHP synthase는 별도로 자료제 공 은 하 지 않 았 ￡ 나 phosphoenolpyruvate (40 μ mole) 을 첨가하여도 천혀 DTNB 효과를 억제하지 못했다. 따라서 본 DAHP synthase 는 E. coli DAHP synthase와는 달리 DTNB와 반응하는 sulf-

S\

'" 50

-

.&>

.c::

l

z

20 2 3 4 5 6

-loglll (M)

Fig. 8. lnhibition of the activity of DAHP synthase with pCMB , DTNB and GSH.

The reaction mixtures contained in a vo!ume of 1. 0ml ,

40 μ

ole potassiu

phosphate buffer (pH 7.0) , 35 μg of

prolein and GSH( 0) , DTNB( 6.) or pCMB(디) as indi-

cated. The mixtures were incubated at OOC for 10 11l in. in

the presence of GSH , DTNB , and pCMB. The enzyme

activity was deter

ined as described under “ Materia!s

and Methods".

V

16 , N.ι 1 57

Table 5. Inactivation of DAHP synthase withpCMB , mM과 0.14mM로 계 산되 었 다.

DTNB and its protection by cysteine and dithiothreitolDAHP synthase는 1 mM Co++ 이 온에 의 해 약

Addítíon (M) Relatíve actívíty

ncentrat

n(M) (0/ 0)

None 100

pCMB 8 X 10 -6 2

pCMB + Cysteíne 8 X 10- 4 75 1 X 10 -4 87 8 X 10- 3 20 1 X 10- 3 3.5

pCMB 8 X 10- 6 123

+ díthíothreíto! 8 X 10- 5 120 8 X 10 -4 125 8 X 10- 3 120

DTNB 1 X 10- 4 17

DTNB 1 X 10 -4 38

+ Díthíothreítoi 1 X 10- 3 128

DTNB 8 X 10- ⁵ 21

+ Cysteíne

40μg of proteín , 0.5 μmole erythrose 4-phosphate and addítions at the concentratíons índícated ín a total volume lml were íncubated at 45

C for 10 mín. The en zymatíc reactíon was started by the addítíon of 1. 0

ll1

0le phosphoenolpyruvate.

hydryl group 이 phosphoenolpyruvate 결 합부위 가 아닌 다른 부위에 존재하는 sulfhydryl기 라는 것을 알수 있었다.

요

.,

L-phenylalanine을 생 산하는 토양분리 방선균인 InlrasþorangÎ.μm sp. 의 DAHP synthase 는 방향족 아미노산 생항성 대사과정의 중요대사조절 단계 를 촉매하는 효소로서 그 효소적 성질을 조사， 다음과 같은 결과를 얻었다.

본 효소의 효소활성을 위한 최적 반응온도는 45.C 이었으며 효소반응을 위한 활성화에너지는 12.6 kcal/ mole로 산출되 었 다. 효소활성 의 최 적 pH는 7.

5이 며 phosphate buffer보 다는 tris-maleate buffer가 더욱 효과적이었다.

또한 본 DAHP synthase에 의한 DAHP 생성반응 은 ping-pong bi-bi mechanism에 따라 진 행 되 는 것 으로 판단되 었으며 phosphoenolpyruvate와 eryth- rose 4-phosphate 두 기질에 대한 Km 값은 각각 0.2

22% 활성증가를 보인 반연에 EDTA를 첨 가했을 때 는 현저한 활성저해를 나타냈으나 Co++ 이온의 첨가 로 완전극복되었다.

DAHP synthase 효소액은 4.C 에 서 7일간 보존했 을 때 약 80% 실 활되 었으나 dithiothreitol을 특히 Co++ 이온과 함께 첨가했을 때 상승적인 효소안정화 효과를 나타냈다.

본 효소는 50.C 에서 10분간 가열로 약 90% 설활 되었으냐 phosphoenolpyruvate 첨가로 가열에 의한 불활성화는 현저히 억제되는데 반해 erythrose 4-phosphate 는 효 과 가 없 었 다. 한 편 pCMB 와 DTNB 등의 sulfhydryl 시 약은 극히 적 은 농도에서 도 거의 완전한 효소활성 저해를 나타냈으나 dithiothreitol 벚 L-cysteine 첨 가에 의 해 효소활성 이

회복되었다.

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