77 책임저자：김정상, 702-701, 대구시 북구 산격동 1370번지
경북대학교 농업생명과학대학 생명식품공학부 Tel: 053-950-5752, Fax: 053-950-6750
E-mail: [email protected]
접수일：2009년 2월 2일, 게재승인일：2009년 2월 12일
Correspondence to：Jong-Sang Kim
Department of Life and Food Sciences, Kyungpook National University, 1370, Sankyuk-dong, Buk-gu, Daegu 702-701, Korea
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포도껍질 발효추출물의 항산화 효과
경북대학교 농업생명과학대학 생명식품공학부, 1경성대학교 생활경영학과
이인애ㆍ서지연ㆍ김효정ㆍ강희정1ㆍ임진규ㆍ김정상
Improvement of Antioxidant Activity of Grape Skin by Alcohol Fermentation
In-Ae Lee, Ji Yeon Seo, Hyo Jung Kim, Hee Jung Kang1, Jinkyu Lim and Jong-Sang Kim
Department of Food Sciences, College of Agriculture and Life Science, Kyungpook National University, Daegu 702-701,
1Department of Human Ecology, Kyungsung University, Busan 608-736, Korea
The objective of this study was to establish the optimum alcohol fermenting conditions for maximizing the extraction of antioxidative agents such as anthocyanins from grape juice byproducts. The skin portions from two varieties grape were collected and subjected to alcohol fermentation using yeast (Saccharomyces cerevisiae) following evaluation of their antioxidant activities and alcohol contents. The alcohol fermentation of grape skin for 5 days at 25°C resulted in a significant increase in the antioxidant capacity as evaluated by radical scavenging assay (DPPH) and total phenolic contents. Significant differences in antioxidant capacity and alcohol contents were observed between the fermented products of MBA and Campbell varieties. That is, alcohol fermentation with MBA variety's grape skin produced 15.4% (v/v) ethanol concentration, which is the highest alcohol content among experimental groups. The alcohol content was the highest when grape skin from both varieties was fermented with the addition of 10%
sucrose while the strongest antioxidant activity was achieved when fermented with the addition of 25%
of water and 0.5% of sucrose. In conclusion, ethanol fermentation of grape skin can enhance the antioxidative activity and thereby improve cancer preventive potential. (Cancer Prev Res 14, 77-83, 2009) Key Words: Anthocyanins, Grape skin fermentation, DPPH assay, Flavonoids, Cancer prevention
서 론
각종 공해와 오염된 환경에서 살아가는 현대인들은 감염성 질환보다는 암, 심장병, 뇌졸중, 당뇨 등과 같은 만성질환에 의한 사망률이 높으며,1∼3) 이와 같은 만성질 환의 이환율을 식이조절이나 식품을 통하여 저감시키고 자하는 노력이 활발히 연구되고 있다.4,5) 특히 산화적 스 트레스는 암, 간염, 위염의 주요 원인의 하나로 체내에서 발생하는 활성산소종(ROS)의 소거능을 증진시킨다면 예 방할 수 있는데 천연에 존재하는 항산화성분들과 세포
내 해독효소계는 ROS를 소거하는 역할을 수행하므로 항 산화활성을 발휘하는 성분이나 항산화 효소계 효소들을 유도하는 천연물은 효과적인 기능성 식품 소재로 활용 될 수 있다.6,7) 그 중에서 포도외피에는 안토시아닌과 resveratrol 등과 같은 항산화 성분이 풍부하게 함유되어 있다. 예를 들어, 포도껍질에는 delphinidin 5,300, cyanidin 1,120, peonidins 2,830, petunidin 5,910, malvidins 13,680 ug/g이 존재한다. 이는 총 안토시아닌 함량 기준으로 흑 미의 10배, 검은콩껍질의 1.4배, bilberry의 4.7배에 해당 하는 것으로 천연 항산화 성분의 보고라 할 수 있다. 그 러나 포도 가공 시에 생기는 포도껍질은 제대로 이용되
지 못하고 폐기되고 있는 실정이므로 이를 활용한 건강 기능성 식품소재의 개발은 고 부가가치를 창출할 수 있 는 경제성이 매우 높은 소재의 개발로서 연구 필요성이 매우 클 것으로 전망된다.8)
즉, 외국산 포도주의 이화학적 특성을 분석한 결과에 의한 알코올 함량은 12∼13%가 주를 이루고 있으므로 포도 가공 시에 버려지는 부산물을 이용한 포도껍질의 발효조건의 개선을 통하여 충분히 양질의 포도주 생산 이 가능하다고 전망할 수 있으며, 포도 껍질의 발효를 통한 항산화 효과의 향상 및 건강기능성 식품소재 개발 은 고 부가가치를 창출할 수 있는 경제성이 매우 높은 기술이라고 할 수 있다.9)
재료 및 방법 1. 실험재료
본 실험에 사용한 포도껍질은 경상북도 영천시에 위 치한 경북대 포도마을(주)에서 구입한 캠벨포도와 머루 포도(MBA)의 껍질을 사용하였으며 발효에 사용한 효모 는 Saccharomyces cerevisiae Fermivin (Gist-Brocades, Santiago, Chile)이었다.
2. 효모에 의한 알코올 발효
포도껍질에 물 25% (v/v)를 첨가하여 믹서기로 파쇄하 여 포도즙을 만든 후 포도즙의 0.02% (v/v)의 효모, 0.01%
(v/v)의 potassum pyrosulfite를 첨가하여 진탕 배양기에서 25°C, 200 rpm으로 진탕하면서 5일간 배양하였다.
3. 알코올 함량 측정
알코올 함량 측정은 포도껍질 발효액을 증류한 후 증 류액을 국세청 주류 분석법10)에 따라 주정계를 이용한 비중측정법을 이용하여 측정하였고 Gay-Lussacc의 주정 환산표로 보정하였다.
4. 총 폴리페놀 함량 측정
총 폴리페놀 함량은 Dewanto 등11)의 방법에 따라 Folin- Ciocalteu reagent가 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 측정하였다. 즉, 각각의 포도껍질 발효추출물을 1 mg/ml 의 농도로 조정한 후, 시료 0.1 ml에 증류수 3 ml, Folin- Ciocalteu reagent를 5배 희석하여 15 μl를 넣고 10%
sodium carbonate 50 μl를 첨가하여 혼합한 후, 실온에서 5분간 정치한 뒤 microplate reader (Tecan, Sunrise-basic)를 이용하여 655 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, gallic
acid를 이용하여 표준검량곡선을 작성하였다. 즉, gallic acid 0.02 mg/ml을 증류수에 녹이고 최종농도가 0, 0.06, 1.25, 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 μg/ml 용액이 되도록 제조하고 이를 일정량 취하여 위와 같은 방법으로 655 nm에서 흡 광도를 측정하여 계산하였다. 포도껍질 추출물의 총 폴 리페놀함량은 ml 당 μg gallic acid로 나타내었다.
5. DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)에 의한 자유라디칼 소거 활성
DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl, Sigma-Aldrich)에 의 한 자유라디칼 소거 활성은 Kilani 등,12) Choi 등13)의 방법 을 변형하여 측정하였다. 즉, 200 μM 농도가 되도록 메 탄올에 용해한 DPPH를 200 μl, 시료 50 μl를 첨가하여 30분 동안 37°C에서 반응시킨 후, Microplate reader로 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성 (%)은 다음과 같이 계산하였다.
Activity scavenging (%) = (1-A1/A0)×100 A1 : 시료 처리군의 흡광도 A0 : 시료 대조군의 흡광도
양성대조군으로 항산화제로 잘 알려진 ascorbic acid, α-tocopherol, butylated hydroxytoluene (BHT), delphinidin 을 사용하였다. Kang 등14)은 전자공여능이 phenolic acids 와 flavonoids 및 기타 phenol성 물질에 대한 항산화작용 의 지표라 하였으며, 이러한 물질은 환원력이 큰 것일 수록 전자공여능이 높다고 하였다. 또한 식물체의 총 폴리페놀 함량과 전자공여 작용사이에는 밀접한 상관 관계가 있어 폴리페놀 함량이 높을수록 전자공여능이 높고 추출시간이 증가할수록 그 효능이 크게 나타나는 경향이 있다고 알려져 있다.15,16)
6. 총 플라보노이드 함량
총 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno 등의 방법17)을 변형하여 각 농도별 추출액 0.1 ml에 10% aluminum nitrate 0.1 ml와 1 M potassium acetate 0.1 ml 그리고 80% ethanol 4.7 ml를 가하여 25°C에서 40분간 반응시킨 후 415 nm에 서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 표준곡선은 quercetin (Sigma-Aldrich)을 이용하여 최종농도가 1, 10, 25, 50, 100, 250, 500 μg/ml가 되도록 취하여 위와 동일한 방법으로 측정한 검량선으로 포도발효 추출물의 총 플 라보노이드 함량을 구하였다.
Fig. 1. Changes in free radical DPPH scavenging activities of MBA and Campbell varieties of grape skin extracts prepared under various conditions. Grape skin was macerated in a mixer with various solvents, filtered, and subjected to DPPH assay after normalized for solid content. (A) extracted with 20, 40, 60, 80, 100% ethanol, (B) fermented with yeast for 5 days and filtered.
Fig. 2. Changes in free radical DPPH scavenging activities of MBA and Campbell varieties of grape skin extracts fermented with different sucrose concentration. Chopped grape skin was fermented with yeast in the presence of various concentrations of sucrose, followed by DPPH assay.
결과 및 고찰
캠벨과 머루포도(MBA)의 껍질로부터 추출한 여러 방법 에 의한 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성은 다음과 같았 다. 여러 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 0.125 mg/ml의 처리구부터 활성이 관찰되었으며, 캠벨포도의 경우 1.0 mg/ml의 농도로 처리 했을 경우 에탄올 60% 추출물에서 가장 높은 활성(50%)을 보였고, 머루포도의 경우 물 추출 물(19%)과 에탄올 60%추출물(18%)에서 비슷한 정도의 가
장 높은 활성을 보였다. 발효 추출물의 경우의 DPPH 라디 칼소거활성은 캠벨포도(75%), 머루포도(60%)로 발효방법 을 이용한 경우가 물이나 에탄올 추출법의 경우보다 더 높 았다. 2.0 mg/ml의 농도를 사용한 경우에도 캠벨포도의 표 피추출물의 경우, 에탄올 60%추출물에서 가장 높은 활성 (81%)을 보였고, 머루포도의 경우에는 물 추출물(43%)과 에탄올 60%추출물(40%)에서 비슷한 정도의 높은 활성을 보였다. 발효추출물의 경우에는 DPPH 라디칼소거활성이 캠벨포도(90%), 머루포도(95%)로 발효방법을 이용한 경우 가 물이나 에탄올 추출법의 경우보다 더 높은 DPPH 라디
Fig. 4. Changes of free radical DPPH scavenging activities and alcohol content during fermentation of MBA and Campbell varieties of grape skin with different inoculum concentration. Chopped grape skin was fermented with various levels of yeast without addition of any sugar, followed by DPPH assay.
Fig. 3. Changes in free radical DPPH scavenging activities of MBA and Campbell varieties of grape skin extracts fermented with different sugar. Chopped grape skin was fermented with yeast in the presence of various kinds of sugar, followed by DPPH assay.
칼소거활성을 보이는 결과를 얻었다(Fig. 1).
DPPH 라디칼소거활성이 발효방법을 이용한 경우가 물이나 에탄올 추출법의 경우보다 훨씬 더 높은 것으로 나타났으므로, 발효조건에 따른 DPPH 라디칼소거활성 차이를 보기 위하여 동일한 발효 조건으로 당(sucrose) 함 량(0, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0%)을 각각 다르게 발효하여 당 함량에 따른 DPPH 라디칼소거활성 차이를 조사한 결과, 머루포도의 경우 0.5% 당을 첨가하였을 때 0.06∼
1.0 mg/ml 농도에서 약 1.5∼2배가량 더 높은 활성을 보 였으나, 2.0 mg/ml의 농도에서는 첨가하지 않은 경우 (73%) 보다 71%로 더 낮은 활성을 보였고, 당 농도를 2.5%이상 첨가한 경우에는 첨가하지 않은 경우보다 모 든 농도에서 더 낮은 활성을 보였다. 캠벨포도의 경우에 0.5% 이외의 다른 농도에서는 모두 첨가하지 않은 경우
보다 더 낮은 활성을 나타냈으며, 0.5% 첨가한 경우에도 2.0 mg/ml의 농도에서만 76%로 첨가하지 않은 경우 (46%)보다 매우 높은 활성을 보여 머루(71%)보다도 더 높은 활성을 보였다(Fig. 2).
탄소원을 달리한 발효조건에18) 따른 DPPH 라디칼소거 활성 차이를 알아보기 위하여 여러 종류의 단순당을 0.5%
를 첨가하여 동일한 방법으로 발효한 후, 그 차이를 분석 한 결과, 머루포도의 경우에는 2 mg/ml의 농도에서 sucrose (69%)와 당을 첨가하지 않은 경우(69%), fructose (68%), glucose (65%)의 경우에 가장 높은 활성을 보였고, 캠벨의 경우에는 sucrose (81%)와 lactose (76%), glucose (73%), fructose (67%)에서 각각 높은 활성을 나타내었다(Fig. 3).
발효조건에 따른 변화를 살펴보기 위하여 효모 함량 을 달리하여 접종량에 따른 DPPH 라디칼소거활성 차이
Fig. 6. Changes of total flavonoid contents in MBA and Campbell varieties of grape skin fermented with different sugar and inoculum contents. Chopped grape skin was fermented with yeast in the presence of various concentrations of sucrose, followed by measurement of total flavonoids.
Fig. 5. Changes of total polyphenol and alcohol contents during fermentation of MBA and Campbell varieties of grape skin with different sucrose concentration. Chopped grape skin was fermented with yeast in the presence of various concentrations of sucrose, followed by measurement of total phenolics.
와 알코올 함량차이를 알아보기 위하여 효모 발효액을 200, 1,000, 5,000, 10,000, 50,000 ppm까지 다양한 농도로 첨가하여 동일한 조건, 동일한 방법으로 발효한 후, 그 차이를 본 결과, 1 mg/ml의 농도에서 머루포도의 경우에 는 DPPH 라디칼소거활성은 접종량 1,000 ppm (v/v)에서 가장 높은 활성(53%)을 보였고 캠벨의 경우에는 10,000 ppm 접종량의 경우에서 가장 높은 활성(60%)을 보였으 나, 알코올 생성량(5.3∼7.2도)은 DPPH 라디칼소거활성 이 강하거나 접종량이 증가할수록 오히려 감소하는 경 향을 보였다(Fig. 4).
총 페놀 함량의 경우도 DPPH 라디칼소거활성과 마찬 가지로 당을 첨가하지 않은 경우 머루(3.6 mg/ml)가 캠벨
(3.4 mg/ml)보다 약간 높은 활성을 보였으나, sucrose 0.5%
를 첨가한 경우에는 머루(3.2 mg/ml)보다 캠벨포도(3.5 mg/ml)에서 더 높은 활성을 보였고 0.5%이상 첨가한 경 우에는 더 많이 첨가할수록 오히려 활성이 더 떨어지는 현상을 보였다. 그러나, 발효후 알콜 농도는 DPPH 라디 칼소거활성과는 반대현상을 보여 당을 첨가하지 않고 발효한 경우 25°C에서 7.5∼7.9도, 2.5% 첨가한 경우 머 루(10.4∼10.5도), 캠벨(8.6도), 5.0% 첨가한 경우, 알콜농 도가 머루(14.6∼15.0도), 캠벨(8.7∼9.4도)순으로 증가하 였고, 10% 첨가한 경우에 알콜 농도는 머루(15.4도), 캠벨 (9.5도) 순으로 높았다(Fig. 5). 총 플라보노이드 함량은 Fig. 6과 Fig. 7에서 나타낸 바와 같이 sucrose함량이나 종균
Fig. 8. Changes of total flavonoid contents in MBA (open bar) and Campbell (black bar) varieties of grape skin prepared with different sugars and sucrose contents (v/v). Chopped grape skin was fermented with yeast after adding various sugars (A) or concentrations of sucrose (B), followed by measurement of total flavonoids.
Fig. 7. Changes of total flavonoid contents in MBA grape skin extract prepared with different sugars and amount of water added.
Chopped grape skin was fermented with yeast after adding various concentrations of sugars or water, followed by measurement of total flavonoids.
처리 함량에 따른 변화는 크지 않았으나(50∼53 μg/ml), 에탄올 추출물의 경우와 비교하면 당의 함량과 관계없이 발효추출물의 경우에 플라보노이드 함량이 1.5∼1.8배 이상 증가된 결과를 보였으며, 머루포도의 경우 sucrose를 첨가하지 않은 경우보다 2.5%첨가한 경우에 64.65 μg/ml 로 약 1.3배가량 증가하는 결과를 보였다. 또한 여러 가 지 당을 첨가하여 발효시킨 결과 glucose를 첨가하여 배 양한 경우에 55.91 μg/ml로 가장 높게 나타났고 그 다음 으로는 maltose를 처리하였을 때 53.23 μg/m이었으며 당 을 처리하지 않았거나 다른 당을 처리한 경우보다 플라 보노이드가 약 10%가량 증가되었지만, 머루와 캠벨 포
도간의 차이는 보이지 않았다. 또한 첨가한 물의 양(v/v) 에 따라 첨가량이 많을수록 총 플라보노이드 함량은 적 게 나타나는 결과를 얻었으며, 물을 첨가하지 않았거나 25%정도 첨가한 경우에 51.13 μg/ml로 가장 높은 플라 보노이드 함량을 보였다(Fig. 7, 8).
결 론
추출방법에 따른 항산화활성의 차이에 있어서 발효에 의한 항산화활성이 물이나 에탄올 추출에 의한 항산화 활성보다 더 높은 항산화활성을 보였기 때문에 머루와
캠벨포도 껍질을 이용하여 물, sucrose량, 당 종류, 종균량 등을 달리하여 배양한 후 항산화활성(DPPH 라디칼소거 활성, 총페놀 함량, 총 flavonoid)과 알코올 함량 등의 변 화를 측정하여 높은 항산화활성을 나타내는 발효조건을 살펴보았다. 머루의 경우에는 당 함량 0.5%첨가한 경우 (59%), 종균량 1,000 ppm (v/v)에서 가장 높은 활성(53%) 을 보였고, 캠벨의 경우도 당 함량 0.5% (76%), 종균량 10,000 ppm 경우에 가장 높은 활성(60%)을 보여 주었으 나, 알코올 생성량은 종균량이 증가할수록 오히려 감소 하는 경향(5.3도)을 보였다. 총페놀 함량에 있어서는 당 을 첨가하지 않은 경우보다 당을 많이 첨가할수록 오히 려 더 떨어지는 현상을 보였으나 알코올 발효도수는 항 산화활성과는 반대현상을 보여 당을 첨가할수록 증가하 는 현상을 보였다. 당을 첨가하지 않은 경우 25°C에서 7.5∼7.9도를 나타내었으며, 10% 첨가한 경우 머루(15.4 도), 캠벨(9.5도)까지 높게 나타내었다. 총 플라보노이드 함량은 에탄올 추출물의 경우와 비교하면 당의 함량과 관계없이 발효추출물의 경우에 모두 약 1.5∼1.8배 이상 증가되었으며 glucose를 첨가한 경우에 가장 높게 나타났 고 물의 첨가량이 많을수록 플라보노이드 함량은 적게 나타났다.
감사의 글
본 연구는 학술진흥재단 유망여성과학자(과제변호 KRF- 2008-532-F00018, 이인애) 및 문재해결형 인력양성지원사 업 과제번호(F00034, 서지연)에 의해 이루어졌으며, 이에 감사드립니다.
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