Anti-Inflammatory Effect of Alginate Oligosaccharides Produced by an Alginate-Degrading Enzyme from Shewanella oneidensis PKA1008 on LPS-Induced RAW 264.7 Cells

(1)

888

서 론

해조류는육상생물과는다른독특한서식환경조건으로인하 여다양한생리활성물질을함유하고있으며

,

^현재^해조류^유 래 기능성소재로부터 항종양

(Lee et al., 1992),

^{항바이러스}

(Kim et al., 2010),

^{항혈액응고}

(Scot et al., 1987)

^및^면역증강

(Cho et al., 1990)

등의연구가활발히이루어지고있다

(Kim et al., 2011).

^이러한^해조류^중의^대표적인^기능성^물질로^세포 벽을구성하는점질다당류인알긴산

,

^푸코이단

,

^한천^및^카라 기난등이있다

.

^그^중^갈조류의^세포벽^구성^점질^다당류인^알 긴산은

β-D-mannuronic acid (M)

^와

α-L-guluronic acid (G)

^가

1,4-glycoside

결합으로노르말사슬분자를이루고존재하고있 으며

,

^해조류의^종류

,

^계절^및^조체의^부위에^따라

M

^과

G

^의^구

성비율이달라지고

,

^결합^순서^및^구조에^따라

,

^겔^형성능

,

^흡착 능

,

^점도^등의^물리적^특징이^변하는^것으로^알려져^있다

(Horn et al., 1999; Moen et al., 1999; Zvyagintseva et al., 2005).

이와같은다양한기능성이알려진알긴산의이용을확대하 기위해식품

,

^화장품^및^의료용^소재^측면에서^많은^연구가^진 행되고있지만

,

^상온에서 ^{용해시간이}^길고

,

^알코올류^함유^용 매에는난용이며

,

^농도가^높아짐에^따라^고점도^특성을^보이는 단점으로인하여산업적으로이용하기에제한이따르고있다

(Cho et al., 2003).

^이러한^단점을^보완하고^활용성을^높이기^위 해알긴산을저분자화시켜올리고당으로제조함으로써고점도

의문제를해결하기위한연구가활발히진행되고있다

(Lee et

al., 1996; Lee et al., 1993).

^이러한^방법에는^{물리화학적}^및^효 소적가수분해방법이있으며

,

물리화학적분해방법인고온고

Shewanella oneidensis PKA1008 유래 알긴산 분해 효소에 의해 제조된 알긴산 올리고당의 항염증 효과

김민지·배난영·박시우·김꽃봉우리

¹

·박지혜 ·박선희·안동현*

부경대학교 식품공학과/식품연구소, ¹부경대학교 수산과학연구소

Anti-Inflammatory Effect of Alginate Oligosaccharides Produced by an Alginate-Degrading Enzyme from Shewanella oneidensis PKA1008 on

LPS-Induced RAW 264.7 Cells

Min-Ji Kim, Nan-Yong Bae, Si-Woo Bark, Koth-Bong-Woo-Ri Kim¹, Ji-Hye Park, Sun-Hee Park and Dong-Hyun Ahn*

Department of Food Science & Technology/Institute of Food Science, Pukyong National University, Busan 48513, Korea

1Institute of Fisheries Sciences, Pukyong National University, Busan 46041, Korea

The anti-inflammatory effect of alginate oligosaccharides on LPS-induced RAW 264.7 cells was investigated at dif- ferent time points (0–60 h). The alginate oligosaccharides were produced by an alginate-degrading enzyme from Shewanella oneidensis PKA1008. The alginate oligosaccharides decreased the production of nitric oxide and pro- inflammatory cytokines [tumor necrosis factor-α, interleukin (IL)-1β, and IL-6] in a dose-dependent manner. The alginate oligosaccharides showed peak anti-inflammatory activity after 36 h of incubation; at that time point, reduced protein expression of NF-κB p65, iNOS, and COX-2 was detected. Furthermore, the alginate oligosaccharide treat- ment reduced the formation of ear edema at 36 h compared to samples examined at 0 h when the oligosaccharides were administered at 50 and 250 mg/kg body weight, as well as dermal thickness and mast cell numbers in a histo- logical analysis. These results suggest that alginate oligosaccharides are a promising anti-inflammatory agent.

Key words: Alginate oligosaccharides, Anti-inflammation, Ear edema, NF- kappaB

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http://dx.doi.org/10.5657/KFAS.2015.0888 Korean J Fish Aquat Sci 48(6) 888-897, December 2015

Received 11 November 2015; Revised 18 December 2015; Accepted 22 December 2015

*Corresponding author: Tel: +82. 51. 629. 5831 Fax: +82. 51. 629. 5824 E-mail address: [email protected]

(2)

알긴산 올리고당의 항염증 효과

889

압

(Kim et al., 2010),

^방사선^처리

(Song et al., 2008),

^산^및^알 칼리처리

(Lee et al., 1975)

방법이있다

.

물리화학적처리방법 은처리시간이짧고간단하지만

,

^산^또는^{알칼리처리를}^통해^생 성되는독성부산물의작용및중화시발생하는염등에의해 영향을받을수있으며

,

^정제가^어렵다는^단점이^있다

.

^반면

,

^효 소적가수분해방법은물리화학적방법에비하여비용이비싸 지만목적으로하는올리고당생성에유리하며다른부산물의 생성을줄일수있는장점이있다

.

^따라서^알긴산의^효소적^가 수분해를통한올리고당이최근산업적으로자주이용

(Uo et al., 2006)

^되고^있으며

,

^고점도^문제의^해결뿐만^아니라^항산화

(Bark et al., 2015),

^항염증

(Iwamoto et al., 2003)

^등의^기능성 증진에관한연구가보고되고있다

.

염증반응은물리적

,

^화학적^자극에^의해^손상된^부위를^회복 시키는생체방어기작중의하나를말하며매개인자의활성화 에따라열

,

^부종

,

^홍반^등의^{질병반응을}^유발한다

(Zamora et al., 2000).

^대식세포

(macrophage)

^는

lipopolysaccharide (LPS)

의자극에의하여활성화되어

nitric oxide (NO), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α)

^및

IL-1β

^등의^염증^매 개

cytokine

을생성하여염증반응에관여하게된다

(Higuchi et al., 1990).

^이러한^염증^매개^물질들의^형성은

arachidonic acid

가

cyclooxygenase (COX)

^의^작용을^거쳐

leukotriene, throm- boxane, prostaglandin

등으로바뀌는과정및

NO

의대량생성 에관여하여염증매개에역할을하며

,

^숙주에^치명적인^결과를 초래한다고알려져있다

(Jeong et al., 2014).

이와같은

NO

및 염증매개

cytokine

^은^{염증반응과}^밀접하게^연결되어^있으며

,

이들의생성을억제하고조절할수있는물질은염증질환의치 료제및예방제로서활용될수있다

(Cho et al., 2012).

지금까지 염증질환치료제로서주로사용된스테로이드및비스테로이 드성항염증제는부작용발생우려로인하여장기간사용이어 려워이를대체하기위한천연물유래항염증제의개발이많이 이루어지고있는실정이다

(Kang et al., 2014).

이에 본 연구에서는 갈조류의 세포벽 점질 다당류이며 많 은기능성이 알려진알긴산을 이전연구에서

(Sunwoo et al., 2013)

보고된 알긴산분해능이 높은

Shewanella oneidensis

PKA1008

^유래^조효소와^반응시켜^생성된^알긴산^{올리고당의}

항염증활성을확인하고산업적이용가능성에대하여알아보 고자한다

.

재료 및 방법

시험균주

본 실험에서 사용한균주는부산연안송정 앞바다에서사 멸기에접어들어 분해가진행중인 녹조류구멍갈파래

(Ulva

pertusa)

를 채집하여 이로부터획득한 알긴산분해능이 뛰어

난

S. oneidensis PKA1008

균주를이용하였다

(Sunwoo et al., 2013).

조효소액 제조

조효소액은

S. oneidensis PKA1008

^를

marine broth (Difco, Sparks, MD, USA)

^배지를^이용하여

30°C

^에서

24

^시간^배양^후

,

원심분리기

(Supra 30K, Hanil Sciecne Co., Korea)

^를^이용하여

4℃

에서

10,000 g

로

30

분간원심분리하여상층액으로하였다

. 알긴산 올리고당 제조

알긴산

(7%)

^과^{조효소액을}

1:1 (w/v)

^로

12 h

^간격으로

0-60 h

^동안^{반응시켰다}

.

^각^시간별로^반응이^끝난^후

, 95-100℃

^끊 는물에서

10

^분간^반응시켜^효소를^불활성화^시켰다

.

^그런^다 음

, 10,000 g, 10 min, 4℃

에서원심분리하여단백질을침전시 켜제거한후상층액을알긴산올리고당으로이용하였으며

,

^동

결건조후

-20℃

^에서^보관하며^{사용하였다}

.

^반응^시간별^알긴

산 올리고당으로의 분해 정도는

thin-layer chromatography (TLC)

^를^이용하여^{확인하였으며}

, silica gel F

₂₅₄

plate

^를^이용하 여

sample 3 μL

씩을

spotting

하고

1-butanol:acetic acid:water (2:1:1 v/v/v)

^전개액을^이용하여^전개한^다음

silica gel plate

에

10%

^황산첨가^에탄올^용액을^분무한^후

110℃

^에서

20

^분간 가열하였다

. Standard mixture

^는

cellooligosaccharide

^를^사용 하였으며

, cellobiose, cellotriose, cellotetraose, cellopentaose, cellohexaose

는

Megazyme (Megazyme Co., Wicklow, Ire- land)

^및

glucose

^는

Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis,

MO, USA)

^에서^구입하여^{사용하였다}

.

세포배양

Murine

^의^{대식세포주인}

RAW 264.7

^세포는^{한국세포주은행}

(KCLB 40071)

에서분양받아사용하였으며

, DMEM

에

10%

inactivated fetal bovine serum

^과

1% penicillin-streptomycin

을첨가한배지를배양액으로

37℃, 5% CO

₂^조건에서^배양하 였다

.

^{실험과정의}^모든^세포는

80-90%

^정도의^밀도로^자랐을 때계대배양하였고

, 20 passages

^를^넘기지^않은^세포만^사용 하였다

.

실험동물

마우스귀조직관찰실험에서생후

8

^주령의^수컷

, ICR

^마우 스를오리엔트바이오

(Seongnam, Korea)

^에서^구입하여^사용하 였으며마우스는온도

20±2°C,

^습도

50±10%, 12 h

^명암주기 가유지되는동물사육실에서

1

주일간예비사육한후실험에 사용하였다

.

^본^실험은^{부경대학교}동물실험윤리위원회로부터 동물실험승인을받아수행하였다

(

^승인번호

2014-01).

세포 독성 측정

시료의세포독성을평가하기위해

Park et al. (2006)

^의^방법을 약간변형하여

MTT assay

를실시하였다

. RAW 264.7 cell

을

1×10

⁶

cells/mL

^농도로

well plate

^에^분주하고

20 h

^전^배양^후

,

1 μg/mL

^의

LPS

^와^알긴산^올리고당

(10, 50, 100 μg/mL)

^을^첨

(3)

가하여

37℃, 5% CO

₂

incubator (MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan)

에서

22 h

본배양하였다

.

배양후

5 mg/mL MTT (thia- zol blue tetrazolium bromide, Sigma-Aldrich Chemical Co.)

용액을첨가하고

2 h

재배양하였다

.

이를

4℃, 879 g

에서

10

분 간원심분리

(UNION 32R, Hanil Co., Incheon, Korea)

^하여^상 층액을제거하였다

.

^그^후

,

^각

well

^에

DMSO

^를^첨가하고^이를

microplate reader(Model 550, Bio-rad, Richmond, CA, USA)

를이용하여

540 nm

^에서^흡광도

[optical density (O.D.)]

^를^측 정하였다

.

세포증식능은다음식에의해계산하였다

.

Proliferation index (%) = (sample O.D./ control O.D.)×100 Nitric oxide 생성량 측정

NO

^의^농도는^배양액^내의

nitrite

^농도를

griess

^반응을^이용 하여측정하였다

(Lee et al., 2000). RAW 264.7 cell

은

DMEM

배지를이용하여

2.5×10

⁵

cells/mL

^로^조절한^후

24 well plate

에접종하고

5% CO

₂

incubator (MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan)

에서

20 h

전배양하였다

.

세포에

1 μg/mL

의

LPS

와

10, 50, 100 μg/mL

^의^농도로^알긴산^{올리고당을}^각각^처리하여

24 h

재배양하였다

.

배양액의상층액을얻은후

,

동량의

griess

시 약

(1% sulfanilamide + 0.1% naphthylendiamine dihydrochlo- ride, 1:1)

^을^첨가하여^실온에서

10

^분간^{반응시키고}

, microplate reader (Model 550, Bio-rad)

를이용하여

540 nm

에서흡광도 를측정하였다

.

^세포^배양액^내

NO

^의^농도는

sodium nitrite (NaNO

₂

)

의농도별표준곡선과비교하여산출하였다

.

염증 관련 cytokines 분비량 측정

염증관련

cytokine

^의^분비량을^측정하기^위해

RAW 264.7 cell

을

DMEM

배지를이용하여

2.5×10

⁵

cells/mL

로조절한 후

24 well plate

^에^접종하고

5% CO

₂

incubator (MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan)

에서

18 h

전배양한후

, 1 μg/mL

의

LPS

와

10, 50, 100 μg/mL

^의^알긴산^{올리고당을}^처리하여

12 h

^재배 양하였다

.

^{세포배양액}^내의

TNF-α, IL-6

^및

IL-1β cytokine

^의 분비량을

ELISA kit (Mouse ELISA set, BD Bioscience, San Diego, CA, USA)

^를^이용하여^{측정하였다}

.

^이를^위해

ELISA microplate

에

capture antibody

로

anti-mouse TNF-α, IL-6

및

IL-1β

^를^분주하여

4℃

^에서^하룻밤^동안

coating

^시켰다

.

^이를

0.05% Tween 20

^이^포함된

PBST

^로^세척하고

10% FBS

^용액 으로

blocking

하였다

. PBST

로세척한뒤

,

각

microplate

에배 양상층액을분주하고실온에서

2 h

^{반응시켰다}

.

^다시

PBST

^로 세척한뒤희석한

biotinylated anti-mouse TNF-α, IL-6 detec- tion antibody

^와

streptavidin-horseradish peroxidase conjugate

를첨가하여실온에서

1 h

^{반응시켰다}

. IL-1β

^의^경우

, biotinyl- ated anti-mouse IL-1β detection antibody

를첨가하고

1 h

반 응후

, streptavidin-horseradish peroxidase conjugate

^를^첨가하 여

30

분반응시켰다

.

그후

,

이를다시

PBST

로세척한다음

, OPD

^용액을^첨가하여^실온에서

30

^분^동안^{암반응시켰다}

. 2 N

H

₂

SO

₄^로^반응을^종료시킨^후

, microplate reader (Model 550, Bio-rad)

를이용하여

490 nm

에서흡광도를측정하였다

. iNOS, COX-2 및 NF-κB 발현량 측정

알긴산 올리고당이 세포질내 생성되는

iNOS, COX-2

및

NF-κB

^의 ^발현량에 ^미치는 ^영향을 ^알아보기 ^위하여

RAW

264.7

^세포를^{배양하였다}

.

^배양이^끝난^세포를^수집하여

3

^회

phosphate buffered saline (PBS)

으로세척한후

, Sheeba and Asha (2009)

^의^방법에^따라

iNOS

^및

COX-2

^의^경우

cytosol lysis buffer [50 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoxycholate, 5 mM phenylmethylsulfonyl fluo- ride, 1 μg/mL aprotinin, 1% Triton X-100, 0.1% NP-40

^을^이용 하였으며

, NF-κB

의경우

nucleus lysis buffer (10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1.5 mM MgCl

₂

, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM di- tiotreitol)

를첨가하여

30

분간

4°C

에서

lysis

시킨후

15,520 g

에 서

20

^분간^원심분리^하여^세포막^성분^등을^{제거하였다}

. BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA)

^을^사용하여^단 백질을정량하였으며

, 30 μL

의

lysate

를

Laemmli (1970)

의방 법을 사용하여

10% SDS-PAGE

^로^{분리하였다}

.

^분리된^단백 질은

Towbin et al. (1979)

의방법을참고하여

polyvinylidene difluoride membrane (Bio-Rad)

^에

1

^시간 ^동안^전사시켜

5%

skim milk

^가^포함된

tris buffered saline (TBSS, pH 7.5)

^용액 으로상온에서

2

시간동안

blocking

하였다

. iNOS, COX-2

및

NF-κB

^의^발현량을^검토하기^위한^항체로는

anti-mouse iNOS, COX-2

및

NF-κB

를사용하여

1:500

으로희석하고상온에서

2

시간반응시킨후

TBSS

^로

3

^회^{세정하였다}

. 2

^차^항체로

horse- radish peroxidase

^가^결합된

anti-mouse IgG

^및

anti-rabbit IgG

를

1:2,000

으로희석하여상온에서

1

시간반응시킨다음

TBSS

로

3

^회^세정하여

ECL

^기질과

1-3

^분간^반응^후^각각의^단백질^밴 드는

Gene tool (GeneGnome5, Syngene, Cambridge, UK)

을 이용하여가시화하였다

.

귀부종 측정 및 조직 관찰

알긴산올리고당의항염증효과를

in vivo

상에서알아보기위 하여

Kim et al. (2002)

^과

Saraiva et al. (2011)

^의^방법에^의거 하여귀부종억제율을측정하고조직관찰을실시하였다

.

생후

8

^주령의^수컷

, ICR

^마우스에^알긴산

0 h,

^알긴산^올리고당

(36

h)

^시료를

10, 50

^및

250 mg/kg·body weight

^농도로

200 μL

씩경구투여하고한시간후오른쪽귀에

2.5% croton oil

을

20 μL/ear

^농도로^{도포하였다}

.

^도포

5

^시간^후^귀^두께를^측정하였 고

croton oil

의처리로귀두께가증가한것을부종의형성으로 간주하였다

.

^귀^조직^관찰은

ICR

^마우스의^오른쪽^귀에^샘플을

100 mg/mL

^농도로

20 μL

^씩^도포하고

15

^분^뒤

, 5% croton oil

을

20 μL

씩도포하였다

. 6

시간뒤

, diethylether

로마취사시키 고

,

^귀^조직을^절제하여

10% formaldehyde

^에

72 h

^{고정하였다}

.

고정후파라핀블록을만들어박편을제조하고

hematoxylin-

eosin (H&E)

^및

toluidine-blue (T&B)

^염색을^하여^조직을^관

(4)

알긴산 올리고당의 항염증 효과

891

찰하였다

.

Edema formation (%) = Sample

^의^귀^두께

/ Control

^의^귀^두 께

×100

통계처리

실험결과의통계처리는

SAS program (Statistical analytical system V8.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)

을이용하여 평균값을분산분석한후

, Duncan

^의^{다중검정법으로}

P<0.05

수 준에서항목들간의유의적차이를검정하였다

.

결과 및 고찰

반응시간에 따른 조효소에 의한 알긴산 분해 정도 S. oneidensis PKA1008

균주가생산하는조효소액을알긴산 에처리하였을시알긴산이분해되어올리고당이생성되는지를 확인하기위하여

TLC

^분석을^{실시하였다}

. 0-60 h

^까지^분해^정 도를살펴본결과

(Fig. 1),

알긴산과조효소액반응

12

시간까지 는알긴산이분해되지않았으나

,

^반응

24 h

^부터^분해가^진행되 어

36 h

까지는

trisaccharide

와

pentasaccharide

로분해되었으 며

,

^반응

48 h

^{이후부터는}

monosaccharide

^까지^분해됨을^확인 하였다

.

^따라서

S. oneidensis PKA 1008

^이^생산하는^조효소액 은알긴산을단당및올리고당으로분해시키는것을확인하였 으며

,

^각^시간별^시료들을^이용하여^항염증^효과를^{측정하였다}

. 세포독성 측정

0-60 h

^동안^분해시킨^알긴산^{올리고당을}^{대식세포에}^대한^세

포독성을알아보고항염증효과실험을위한농도조건설정을 위하여

RAW 264.7

세포에대해

MTT assay

를실시하였다

.

시

료를

10, 50

^및

100 μg/mL

^농도로^첨가하여^실험한^결과

(Fig.

2), RAW 264.7

세포의증식능이모든처리농도에서

PBS

처 리구와유의적인차이를보이지않아세포독성을가지지않음 을확인하였다

.

따라서이후의

RAW 264.7

세포를이용한항염 증효과실험은

10, 50

^및

100 μg/mL

^의^농도로^처리하여^실험 을진행하였다

.

Nitric Oxide 생성량 측정

NO

^는^인체^내^{생리적이나}^병적인^반응에서^중요한^물질로서 체내염증반응시대식세포와같은면역세포에서

iNOS

에의해

L

-arginine

^이_L

-citrulline

^으로^전환되는^과정에서^주로^생성된다

(Lee et al., 2006).

^적절한^{수준에서는}^{혈소판억제}

,

^면역조절

,

신경전달

,

혈관확장등의역할을하지만과도한

NO

의증가는

peroxynitrite, nitrogen dioxide

^와^같은^{유해물질을}^생성하여^면 역질환을포함한관절염

,

기관지염

,

다발성경화증과같은병적 반응을일으킨다

(Jeong et al., 2012; Kim et al., 2012).

^또한^미 토콘드리아로부터

cytochrome C, apoptosis inducing factor

^를 방출시켜세포자연사를일으키기도한다

(Hippeli and Elastner, 1999). 0-60 h

^동안^분해시킨^알긴산^올리고당^처리에^의한

NO

생성억제효과를살펴보기위하여

RAW 264.7

세포를

LPS

로 활성화시켰다

.

^그^후^알긴산^올리고당^시료를

10, 50

^및

100 μg/

mL

^농도로^처리하여^생성된

NO

^를

griess

^시약을^이용하여^측 정하였다

(Fig. 3). PBS

처리구에서는

5.88±0.13 μM

로낮은 분비를보였으나

, LPS

^자극에^의해

55.31±1.22 μM

^로^분비량 이약

10

배증가하였다

.

반응시간별

NO

분비량은

24 h

처리이

Fig. 1. TLC analysis of alginate oligosaccharides obtained from crude alginate degrading enzyme in S. oneidensis PKA 1008 with various incubation time. Reaction time : lane 1, standard; lane 2.

0 h; lane 3, 12 h; lane 4, 24 h; lane 5, 36 h; lane 6, 48 h, lane 7, 60 h. Standard mixture of monomer glucose, dimer cellubiose, trimer cellotriose, tetramer cellotetraose, pentamer cellopentaose, and hexamer cellohexaose.

Time of enzyme reaction

PBS 0 h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h

0 20 40 60 80 100

120 10 μg/mL

50 μg/mL 100 μg/mL

10 μg/mL 50 μg/mL 100 μg/mL ND

PBS LPS 0 h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h

Nitric Oxide (μM)Proliferation index (%)

0 10 20 30 40 50 60 70

a A

d F

b bC b b c c

D E D E

c

f d e de

Bb a

g

1 2 3 4 5 6 7 1 Monomer

Dimer Trimer Tetramer Pentamer Hexamer

% Edema formation

0 20 40 60 80 100 120

a

d f

b c

d b

d e

10 50 10 50 250 10 50 250 mg/kg Control

Prednisolone 0 h sample 36 h sample

Fig. 2. Effect of alginate (0 h) and alginate oligosaccharides (12, 24, 36, 48, and 60 h) on the proliferation of RAW 264.7 cells. Cells were incubated in the presence of samples (10, 50, and 100 μg/

mL) for 24 h. Cell proliferation was determined by MTT assay.

Proliferation index (%) = (sample O.D./ control O.D.)×100. ND:

not significantly different. Data represent the mean ± S.D. from three experiments.

PBS 0 h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h

0 20 40 60 80 100

120 10 μg/mL

PBS LPS 0 h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h

0 10 20 30 40 50 60 70

a A

d F

b bC b b c c

D E D E

c

f d e de

Bb a

g

1 2 3 4 5 6 7 1 Monomer

Dimer Trimer Tetramer Pentamer Hexamer

% Edema formation

0 20 40 60 80 100 120

a

d f

b c

d b

d e

10 50 10 50 250 10 50 250 mg/kg Control

(5)

김민지

ㆍ

배난영

ㆍ

박시우

ㆍ

김꽃봉우리

ㆍ

박지혜

ㆍ

박선희

ㆍ

안동현

892

후에

, 50-100 μg/mL

농도에서알긴산

(0 h)

시료와비교시농 도의존적으로감소하는것을확인하였다

.

^특히

, 36 h

^반응시 킨알긴산올리고당시료가

100 μg/mL

농도에서

30.93±0.88 μ M

^의^분비량을^보이며

LPS

^단독^처리구에^비해

44%

^억제율 을나타내가장높은

NO

^분비^억제^효과를^가지는^것을^확인하 였다

.

이는

24 h

이후알긴산이

trisaccharide

와

pentasaccharide

로

, 48

^시간^이후부터

monosaccharide

^로^알긴산^{올리고당화에} 따른

NO

생성억제효과로사료된다

.

이와유사한결과로

Yang et al. (2010)

^은^키토산^유래^{올리고당이}

NO

^분비를^{농도의존적} 으로감소시켰으며

,

^분자량이^작을때^보다^분자량이^더^높은^경 우에조금더

NO

분비를억제시켰다고보고하였다

.

염증 관련 cytokines 분비량 측정

대식세포는

LPS

와 같은 항원의 자극을 받아 활성화 되면

TNF-α, IL-6

^및

IL-1β

^등의^분비를^촉진하여^{면역반응을}^조

절한다

. IL-1β

^는 ^국소^{염증반응을} ^매개하며

,

^{종양괴사인자인}

TNF-α

는종양세포를파괴시키는물질로잘알려져있다

(Din-

arello et al., 1990; Stankiewicz et al., 2002).

^또한

, IL-6

^는

T

^세 포의활성화및염증매개물질의발현을통해후천성면역을개 시하는물질이다

(Liu et al., 1998).

^따라서^본^{연구에서는}

,

^알긴 산올리고당화시료의염증성

cytokine

^의^분비에^대한^억제효과 를살펴보았다

.

분비량을측정한결과

(Fig. 4),

시료를

10, 50

및

100 μg/mL

^농도로^처리^시^{농도의존적으로}^각각의

cytokine

^의 분비가유의적으로억제됨을확인하였다

. TNF-α

의경우

0-60

h

^샘플이

10-50 μg/mL

^{농도에서는}^분비^억제에^큰^효과가^없 었으나

, 12-36 h

시료가

100 μg/mL

농도에서

LPS

단독처리구

와비교시약

30%

^정도로^분비^억제^효과가^가장^크게^나타났

다

. IL-1β

의경우에는

0

및

12 h

시료에서는분비억제효과가

크지않았으나

, 24 h

^이후부터^분비^감소에^효과를^보이는^것으

로나타났다

. 100 μg/mL

^{농도에서는}

24-60 h

^샘플이^유의적인 차이가없었으나

, 36 h

시료가

10

및

50 μg/mL

농도에서다른 시료에비해분비억제효과가가장좋았으며

,

^약

30%

^및

40%

정도의분비감소효과를나타냈다

. IL-6

의경우

LPS

단독처리 시

557.52±18.48 pg/mL

^으로^분비량이^{증가하였고}

,

^모든^시료 처리에의해분비감소효과를나타내었지만

, 24-60 h

^처리^시 분비량억제에더효과를나타내었으며

,

특히

, 48-60 h

시료가

100 μg/mL

^농도에서^약

60%

^정도의^감소^효과를^{나타내었다}

. Yoon et al. (2007)

은키토산올리고당이

TNF-a

와

IL-6

의분비 량을효과적으로감소시켰다고보고하였다

. Yang et al. (2010)

의연구에서는키토산올리고당의분자량별항염증효과에대 해측정한결과

, IL-1β

분비량감소에효과가있었지만

,

분비량 감소효과가분자량이작은경우

(1-3 kDa)

^에는^분비^억제에^효 과가없었다고보고하여본연구결과와유사하였다

.

이상의결 과

,

^조효소와^알긴산을^시간별로^반응시킨^결과

, 36 h

^시료에서 가장좋은항염증효과를나타냄을확인하였다

.

iNOS, COX-2 발현에 미치는 영향

iNOS

^는 ^세포내 ^존재하지 ^않으나 ^{외부자극에} ^의해 ^유도된

iNOS

는장시간다량의

NO

분비를촉진하며

,

조직의손상

,

혈 관투과성

,

^부종^등의^{염증반응을}^유발하는^{염증매개성}^물질들 의과잉생산에큰영향을미친다

(Guha and Mackman, 2001).

또한

COX-2

는

cytokine,

자외선

,

세균성내독소등에의해과 발현되어각종퇴행성질환의발병과진행에영향을미치며

,

^특 히체내에발생되는

prostaglandin E

₂

(PGE

₂

)

등의염증인자등 과관련되어염증반응을촉진한다

(Chun and Surh, 2004).

^따라 서알긴산올리고당화시료가세포질내에서의

iNOS

^및

COX- 2

단백질발현에미치는영향을알아보기위해

western blot

방 법을시행하였다

(Fig. 5).

^앞선

NO

^와

pro-inflammatory cyto- kine

의분비억제결과에서

36 h

시료가가장좋은항염증효과 를나타내어

iNOS

^및

COX-2

^의^발현^변화를^{알아보았다}

.

^그^결 과

, RAW 264.7

^세포에

LPS (1 μg/mL)

^{처리하였을}^경우

iNOS

및

COX-2

의단백질발현이증가하였고알긴산올리고당화시

료

10 μg/mL

^에서는^발현의^변화가^거의^없었지만

, 50 μg/mL

및

100 μg/mL

에서억제되는것을확인하였다

.

이는

36 h

시료 에의한

NO

^분비^억제가

iNOS

^활성^저해에^의한^것임을^확인 하였고

,

^또한

COX-2

^의^발현도^저해됨을 ^확인하여

COX-2

^에 의한염증조절에도효과를나타낼것으로사료된다

. NF-κB p65 활성화에 미치는 영향

LPS, TNF-α

또는외부자극에의해활성화된

NF-κB p65

는 세포핵내로이동되어전사조절인자로서작용하면서

iNOS

^및

PBS 0 h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h

0 20 40 60 80 100

120 10 μg/mL

PBS LPS 0 h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h

0 10 20 30 40 50 60 70

a A

d F

b bC b b c c

D E D E

c

f d e de

Bb a

g

1 2 3 4 5 6 7 1 Tetramer

Pentamer Hexamer

% Edema formation

0 20 40 60 80 100 120

a

d f

b c

d b

d e

10 50 10 50 250 10 50 250 mg/kg Control

Fig. 3. Inhibitory effect of alginate (0 h) and alginate oligosaccharides (12, 24, 36, 48, and 60 h) on the production of nitric oxide in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated in the presence of LPS (1 μg/mL) alone or in combination with samples (10, 50, and 100 μg/mL) for 24 h. The culture media of the treated cells were used to measure NO levels. Means with different letters (a-d : 10 μg/mL, A-F : 50 μg/mL, a-g : 100 μg/mL) above the bars are significantly different (P<0.05).