Substrate Specificity of Protein Kinase UL97, an antiviral target, on Mutant Peptide Substrates Derived from a Peptide, KESYSVYVYKV

KESYSVYVYKV로부터 변형된 펩타이드 기질을 이용한 항바이러스제의 타깃이 되는 UL97 단백질 인산화 효소의 기질 특이성

백 문 창^#

경북대학교 의과대학 분자의학교실

(Received September 22, 2008; Revised October 27, 2008)

Substrate Specificity of Protein Kinase UL97, an antiviral target, on Mutant Peptide Substrates Derived from a Peptide, KESYSVYVYKV

Moon-Chang Baek^#

Department of Molecular Medicine, School of Medicine, Kyungpook National University, 101 Dongin-dong, Jung-gu, Daegu 700-422, Korea

Abstract

— Human cytomegalovirus expresses an unusual protein kinase UL97, a member of H

V

U

L

family of protein kinase. UL97 can phosphorylate nucleoside analogs such as ganciclovir as well as protein/peptide. It has previously been reported that UL97 is able to phosphorylate a KESYSVYVY

^K

V peptide and that P+5 position (

^K

) is important. We exam- ined the extent of contribution of other positions (P-4 through P+6) of the peptide to be substrate of UL97 using alanine substituted peptides (Ala scanning) and deleted peptides. The result suggested that the E (P-2) is negative effect and P+5 (K) is still important. The peptide YSVYVYK is the shortest substrate enough to show high activity, which could be a start- ing point to develop peptidomimetic drug. This study would give important information to deeply understand the substrate specificity of UL97 and develop an antiviral drug using the small peptide identified here.

Keywords □

alanine scanning, deleted peptide, protein kinase UL97

세포가여러가지생물학적인과정을전달하는신호전달체계는 주로단백질인산화효소에의해조절되고있고

,

^{이들은아주많은}

종류가밝혀져있다

.

^{이들은기질을인식하기위해서각효소마다}

기질특이성을가지고있으므로이들에대한연구가지속적으로이 루어지고있다

. Human cytomegalovirus (HCMV)

^{는면역력이약}

한사람이나신행아에서아주치명적인질병을일으키는바이러스 로써

UL97

이라는단백질인산화효소를가지고있다

.

^1,2)이효소

는바이러스복제시

nucleocapsid

^{가핵을빠져나가는시기에중요}

한역할을하고관련된여러가지단백질들을인산화시키는것으 로알려져있다

.

^3,4)이과정을억제시키는항바이러스제는현재까

지알려져있지않다

.

^{여러가지약들이}

HCMV

^{의감염을치료하}

는데이용되고있으나여러가지독성들의문제들로인해사용이

제한되고있다

. UL97

은특이한인산화효소이고작용기전이특이

하여이를타깃으로하여약물을개발하는것은아주장점이있다

.

실제로

maribavir

라는약이개발되어

,

⁵⁾이는세포배양시에

HCMV

복제를선택적으로억제시킬수가있고

,

^그타깃은

UL97

^이되는

것으로보고되어있다

.

^이는

UL97

^{이새로운항바이러스제를개발}

하는데있어서중요한타깃이될수있음을보여주는것이다

. UL97

^은

ganciclovir

^{와같은핵산유도체를인산화시킬수있으}

며^1,6)또한

UL44, histone H2B

와같은단백질과펩타이드들을인 산화시킬수있는독특한성질을가지고있다

.

^7-9)이효소는세포 배양시에

HCMV

^{복제에있어서필수적이다}

.

^9,10)

UL97

^의기질특

이성을알아보기위해이효소에대한기질로서

calf thymus

의히

스톤

H2B

를발견하였고

,

이들로부터

5

군데의인산화효소위치를 밝혔다

.

^이들모두

serine

^잔기였다

.

^{특히가장활성이높은펩타이}

드로

KESYp

S

VYVYKV

임을확인하였다

.

⁷⁾이펩타이드는

cyclic AMP-dependent protein kinase(PKA)

에의해서도인산화되었으나

인산화되는위치가다름을확인할수있었다

. UL97

^{은이효소는}

H

V

U

L단백질인산화효소계에속하며

, N

말단에

300

잔기이상의 긴아미노산으로이루어진도메인이존재하고여러가지부분이변 형되어있는동시에

,

^{기존에알려져있는단백질인산화효소가가}

지고있는여러가지모티프를또한가지고있다

.

^11,12)따라서이효

#본논문에관한문의는저자에게로

(

^전화

) 053-420-4948 (

^팩스

) 053-426-4944

(E-mail) [email protected]

소에대한기질특이성을알아보는것은아주중요한연구가된다

.

본연구에서는이펩타이드를이용하여여러가지변형된펩타

이드시리즈를이용하여

UL97

인산화단백질의기질특이성을자

세히밝힘과동시에기질로가능한작은펩타이드를찾아내어펩 타이드유사약물

(peptidomimetic drug)

의기반이될수있는가 능성을보여주었다

.

실험 방법

세포및바이러스

Spodoptera frugiperda

9 cells(Sf9)

은

American Type Culture Collection

으로부터구입하였고

, 10% fetal bovine serum(Atlanta Biologicals), 100 units/m

^l

penicillin, 100

^µ

g/m

^l

streptomycin B

^를

포함하는

Grace's insect medium(In vitrogen)

를이용하여

27

도 에서

suspension

방법을이용하였고

,

¹³⁾

multiplicity of infection (MOI) 5

^{를이용하여}

Sf9

^세포

(2

^×

10

⁶

cells/m

^l

)

^{를감염시켰다}

.

Baculovirus발현GST-UL97의정제

모든칼럼용시약은

Amersham Bioscience

^{에서구입하였다}

.

Glutathione S-transferase(GST)-UL97

^{은전에발표된방법처럼}

baculovirus

^{를이용하여발현시켰다}

.

^7,9,14)

Baculoviurs

^에의해발

현된

GST-UL97 glutathione-Sepharose affinity

칼럼을이용하여

1

^{차정제를하였고}

,

^{간단히설명하면}

lysis buffer(1

^×

phosphate- buffered saline, 10 mM EDTA, 2 mM DTT, 10 % glycerol, 1 mM PMSF, 1 mM benzamidine, protease inhibitors from Sigma)

로

3 m

^l

glutathione affinity column

^{을세척하고}

, GST-UL97

^단백질

은

elution buffer(50 mM Tris[pH 8.0], 10% glycerol, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 50 mM NaCl, 10 mM reduced glutathione)

을 이용하여분리해내었다

. 2

^{차정제를위해이온교환칼럼인}

Q- Sepharose

칼럼을이용하였고

,

친유성

(hydrophobic)

칼럼인

phenyl- Sepharose

칼럼을

3

차정제를위해이용하였다

.

최종얻어진단

백질을

Centricon-30

^{을이용하여농축하였다}

.

^{얻어진단백질은}

10% SDS-PAGE

를통하여순수하게분리되었음을확인하였

다

.

^7,9,14)

GST-UL 97

의농도는

150

µ

g/m

l이었다

.

펩타이드의합성

KESYSVYSYKV

^{를기본으로하여각아미노산의위치를하나}

씩

Alanine

^{으로치환한펩타이드}

(Fig. 1)

^{를합성하고}

,

^{또한길이를}

Fig. 1 −

Alanine scanning of KESYSVYVYKV peptide. (A) Twelve of synthetic peptides derived from the wild type peptide were incubated with

GST-UL97 protein kinase in kinase buffer containing radioactive ATP. After 30 min incubation, the phosphopeptides were resolved

on chimeric polyacrylamide gels, and the phosphorylated species were quantified by phosphoimager. X-axis indicates concentration

(

^µ

M) of each peptide and y-axis indicates phosphoimager unit (left) and peptide numbers (right), respectively. (B) A phosphoimage

result from a peptide gel when 600 nM of each peptide was used. The number of each lane corresponds to the peptide numbers on

A panel.

달리하기위하여

N

또는

C-

말단으로부터

1

개아미노산이감소된 펩타이드

(Fig. 2)

^{를합성하였다}

.

^{또한활성이있는가장작은펩타}

이드를찾기위해

N

및

C-

말단의양쪽에서절단된펩타이드

(YSVYVYK, SYSVYVYK, SYSVYVY)

도합성하였다

.

모든펩타이

드는전형적인

Fmoc

^{방식을이용하여합성된것을}

Research

Genetics(

미국

)

사로부터구입하였다

.

Protein kinase assay

합성된펩타이드를농도별

(200, 400, 600

µ

M)

로

GST-UL97 (100 ng)

^과

kinase buffer (0.2 mg/m

^l

BSA, 100 mM NaCl, 50 M [

^γ

-

³²

P] ATP(300 Ci/mmol))

^에서

, 30

^분동안

30

^{도에서반응시킨}

다

.

반응후

,

이를펩타이드용젤⁶⁾을이용하여분리한다

.

이를

phosphorminager(Molecular Imager)

^{를이용하여}

radioactivity

^를

정량한다

.

실험 결과 및 고찰

Alanine치환된펩타이드를이용한기질특이성연구

GST-UL97

^{은은히스톤}

H2B

^{를인산화시킬수있었고}

,

^몇가

지 펩타이드를합성하여 그활성을 확인하였다

.

그 중에서

KESYSVYVYKV

^{라는펩타이드가활성이가장좋았다}

.

^본연구

에서는이들펩타이드중에서활성에중요한역할을하고있는 잔기를더욱자세히알아보기위하여각아미노산의위치를

Alanine(A)

^{으로치환하여그활성을확인하였다}

. Fig. 1

^에서보이

는것처럼

,

대부분은원래골격이되는

wild type(12

번

)

펩타이 드와거의유사한활성을보였다

.

하지만두번째아미노산인

Glu

를

Ala

^{로치환한경우그활성이}

2

^{배가까이증가하는것을확인}

하였다

.

이는음이온이

UL97

과상호작용하는데있어서억제효

과가있다는것을보여주고있다

.

^{또한인산화되는위치와가까}

운

P-1(Y)

^과

P+1(V)

^를

A

^{로치환한펩타이드들}

(4

^번

, 6

^번

)

^은그

활성이

3

배이상감소하는것을확인하였다

.

또한인산화위치를

A

^{로치환한펩타이드}

(5

^번

)

^{는예상한대로그활성이사라졌다}

.

^또

한기존에

P+5

^의

K

^{가중요하다는보고와일치하게본연구에서}

도

10

번펩타이드는그활성이거의사라진것으로다시한번 확인하였다

.

절단된펩타이드를이용한기질특이성연구

단백질인산화효소의기질은인산화된위치를바꾸거나일부 Fig. 2 −

Deleted mutants derived from KESYSVYVYKV peptide. (A) Eleven of synthetic peptides derived from the wild type peptide were

incubated with GST-UL97 and radioactive phosphopeptides were resolved on chimeric polyacrylamide gels. The phosphorylated

species were quantified by phosphoimager. X-axis indicates concentration (

^µ

M) of each peptide and y-axis indicates phosphoimager

unit (left) and peptide numbers (right), respectively. (B) A phosphoimage result from a peptide gel when 600 nM of each peptide was

used. The number of each lane corresponds to the peptide numbers on A panel.

아미노산을변형하여단백질인산화효소와는비가역적인결합을 만들어억제제개발도가능하다

.

^따라서

A

^{로치환된펩타이드에}

의한연구와더불어활성을갖는펩타이드중가장작은크기가 되는펩타이드를찾는연구는약물개발에기초가되는연구가될 수있다

.

따라서기본형에해당하는펩타이드의

N

말단과

C

말단 으로부터아미노산한개씩을줄여나가그펩타이드들의활성을 확인하였다

. N

^{말단으로부터크기를줄어든펩타이드는그활성}

이감소되는현상을보여주고있다

.

특히

N

말단에

E

가노출된펩 타이드

(2

번

)

는그활성이현격히감소됨을볼수가있는데

,

이

는앞의

Ala

^{치환실험과유사하게음이온의효과를보여주고있}

다

. C

말단을줄여가는펩타이드들중에

, P+5

번

(K)

가제거된펩 타이드들

(9

번

, 10

번

)

의경우그활성이절반가까이감소되었고

, 3

^{개이상감소된펩타이드들}

(7

^번

, 8

^번

)

^{의경우그활성이거의사}

라짐을확인하였다

.

또한

,

가장작은크기의펩타이드를찾기위해 양쪽으로부터크기를줄인펩타이드들

(4

번

, 5

번

, 6

번

)

중에서는

P+5

^번의

K

^가제거된

6

^{번펩타이드는그활성이거의사라졌고}

,

나머지

4

번

, 5

번펩타이드들은그활성이기본형에비해서는다 소감소했으나그활성은여전히잘나타나는것을확인할수있 었다

.

^즉

, N

^{말단의아미노산들에비해}

C

^{말단의아미노산들이}

UL97

효소와결합하여활성을나타내는데중요한잔기임을알

수있었다

.

이를바탕으로해서프로테이즈에의해분해가잘되 지않는화학구조로변형하여인산화효소

UL97

^{에특이적으로}

결합하는펩타이드유사약물을개발하는데이용가능할것으로 사료된다

.

결 론

본연구결과는기존에보고된

UL97

^{의기질특이성을더자세}

히알아보고또한펩타이드유사약물을개발하기위하여활성이 충분하며가장작은크기의펩타이드구조를확인하는데목적을 두었다

.

^{기존의보고는인산화되는}

Ser

^으로부터

C

^{말단쪽으로}

5

번째위치

(P+5)

에

K

나

R

을포함하는양이온기를갖는아미노 산이중요한것으로보고되었다

.

^{본연구에서}

Ala

^{치환및가장작}

은펩타이드로

YSVYVYK

인것으로보아

,

인산화되는

Ser

가까 이의

N

말단쪽에양이온기

, P+1

의

V, P+5

위치에

K

가중요한 역할을하는것을알게되었다

.

^{이는학문적으로}

UL97

^의기질특

이성을이해하고산업적으로는펩타이드유사약물을개발하는데 기초가되는결과를보여주었다

.

감사의 말씀

이논문은

2006

^{년도정부재원}

(

^{교육인적자원부학술연구조성사}

업비

)

으로한국학술진흥재단의지원을받아연구되었음

(KRF-2006- 003-E00082).

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