The Effects of Dai-saiko-to (Da-Chai-Hu-Tang) on 3T3-L1 Preadipocytes and High-Fat Diet-Induced Obese Mice

大柴胡湯이 3T3-L1 지방전구세포와 고지방식이 유도 비만쥐에 미치는 영향

민들레ㆍ박은정

원광대학교 한의과대학 소아과학교실

Received: October 31, 2014 ∙ Revised: November 14, 2014 ∙ Accepted: November 17, 2014 Corresponding Author: Park Eun Jung

Department of Pediatrics, Wonkwang University Jeonju Oriental Medicine Hospital, 99 Garyeonsan-ro, Deokjin-gu, Jeonju, Jeollabuk-do 561-851, Republic of Korea

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ISSN 1226-8038(Print), 2287-9463(Online), http://dx.doi.org/10.7778/jpkm.2015.29.1.001

Abstract

The Effects of Dai-saiko-to (Da-Chai-Hu-Tang) on 3T3-L1 Preadipocytes and High-Fat Diet-Induced Obese Mice

Min Deul Le․Park Eun Jung

Department of Pediatrics, College of Oriental Medicine, Wonkwang University

Objectives

This experimental study was designed to investigate the effects of Dai-saiko-to (DSH) on differentiation of 3T3-L1 preadipocytes and body weight, serum lipid levels in high-fat diet-induced obese mice.

Materials and Methods

Cells were incubated with DSH at an indicated concentration (0.01-1 ㎎/㎖) for 24h, then the growth rate was assessed by MTS assay. 3T3-L1 preadipocytes were incubated in DMEM for 2 days with the indicated concentrations of DSH. On Day 6, the cells were fixed and the cellular lipid contents were assessed by Oil-Red-O staining. The expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) and cytidine-cytidine-adenosine-adenosine-thymine (CCAAT)/enhancer-binding proteins α (C/EBPα) as adipocyte-specific proteins were determined by real time RT- PCR and western blotting. Four-weeks old mice (wild-type C57BL/6) were used for all experiments. Body weight gain and serum lipid levels were measured in the obesity-induced mice.

Results

DSH did not show toxicity even at the concentration of 1 ㎎/㎖ and DSH significantly inhibited the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes in a dose-dependent manner. Also, DSH significantly reduced the expressions of PPARγ and C/EBPα in a dose-dependent manner. Furthermore, DSH significantly reduced body weight gain, serum glucose, total cholesterol and LDL-cholesterol contents in obesity-induced mice.

Conclusions

These results demonstrated that DSH inhibited 3T3-L1 preadipocyte differentiations and high-fat diet-induced obesity in mice.

Key words : Dai-saiko-to (DSH), Obesity, Adipocyte differentiation, PPARγ, C/EBPα, Serum lipid

비만은 섭취 에너지양이 소비 에너지양보다 많아서 남은 에너지가 체지방으로 조직에 침착되어 각종 대사 장애를 수반하는 질환으로

, 외형상의 문제 뿐 아니라 내장지방 축적, 인슐린 저항성, 지질이상증, 고혈압, 당 뇨병 등의 합병증이 나타나기 쉬우며 심혈관 질환이 발병하기 쉽다

. 특히 소아 및 청소년의 비만은 지방 세포 비대성 (hypertrophic)인 성인기 비만과는 달리 지 방세포 증식성 (hyperplastic)으로 오므로 치료가 어렵고 성인 비만으로의 강한 이행 관계를 가지고 있으며

, 제 2형 당뇨병, 고지혈증, 고혈압 등의 대사증후군 뿐 만 아니라 코골이, 수면장애, 사춘기의 조기 도래와 연 관이 높아

성인기에 시작된 비만보다 적극적인 관 리와 예방 및 치료가 필요하다.

비만 치료에는 생활습관 교정, 식사 조절, 신체활동 증가 외에도 약물 치료, 수술 치료 등을 응용하는데

, 이 중 일부 비만 치료제는 체중감소의 효과에도 불구 하고 부작용으로 인해 사용이 제한되고 있다

. 따라서 독성이 적으면서 체중감소에 효과적인 한약을 이용한 비만 치료 약물 개발에 관심이 높아지고 있다

.

한의학에서는 비만을 肥, 肥胖, 肥人, 肉人, 肥貴人 등으로 표현해 왔으며

, 先天稟膩, 飮食失調, 久臥 久坐, 活動減少, 外感濕邪, 內傷七情 등으로 인하여 痰 濁, 水濕, 積熱, 瘀血, 氣滯, 氣虛 등이 유발되어 발생 하는 것으로 보았다

. 근본적으로는 臟腑의 氣가 虛 하여 運化機能이 失調되어 이차적으로 濕痰이 발생하 고 동시에 水液代謝失調를 유발하며 이것이 다시 비만 의 원인이 되므로

祛痰化濕利水, 通腑泄熱, 活血通 絡, 補氣健脾를 위주로 치료한다

.

大柴胡湯은 <傷寒論>에 처음 收錄된 이래

淸內 解外하여 表裏雙解하는 대표적 處方으로 알려져 있으

胃氣를 調和하여 消痰하는 處方이다

. 따라서 淸熱, 瀉下, 消痰作用을 하는 大柴胡湯이 肥滿症에 유의성 이 있을 것으로 사료되며, 실제로도 비만 및 비만과 관 련한 합병증에 대한 大柴胡湯의 효능을 직 · 간접적으 로 확인하기 위한 실험적 연구도 시행되었다

. 그러 나 기존의 연구들은 주로 지질함량에 미치는 효과에 대한 연구가 대부분으로, 지방세포 분화조절에 관련하 여 세포 수준에서 大柴胡湯이 비만에 미칠 수 있는 영 향에 대해서는 연구된 바가 없었다.

이에 저자는 3T3-L1 지방전구세포와 고지방식이 유 도 비만 동물모델을 이용하여 大柴胡湯 (DSH)이 지방 세포 증식과 그 분화기전 조절에 미치는 영향에 대하 여 연구하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. Materials and methods

1. 材料 1) 약재

본 실험에 사용한 약재는 경희대학교 한방병원에서 구입하였고, 大柴胡湯 (DSH)의 처방 내용과 1貼 분량 은 Table 1과 같다.

2) 검액의 조제

각 건조시료 분량의 10배의 정제수를 넣고 100 ℃에 서 4시간동안 전탕하여 大柴胡湯 추출물 (DSH)을 얻 은 뒤 증류농축장치 (rotary evaporator)에서 감압농축하 고 -20 ℃에서 보관하며 실험에 사용하였다.

Herbal name Pharmacognostic name Amount (g)

柴胡 Bupleuri Radix 16

黃芩 Scutellariae Radix 10

芍藥 Paeoniae Radix 10

大黃 Rhei Rhizoma 8

枳實 Ponciri Fructus 6

半夏 Pinelliae Rhizoma 4

生薑 Zingiberis Rhizoma 4

大棗 Jujubae Fructus 4

Total amount 62

Table 1. Prescription of Dai-saiko-to (DSH)

3) 실험동물

실험동물은 식이로 비만이 유도되는 형질을 가진 C57BL/6종의 4주령 된 생쥐 15마리를 대한바이오링크 로부터 구입하여 사용하였다. 실험 시작 전 1주일 동안 일반 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경

(23 ± 2 ℃, 습도 55 ± 5%)으로 유지하고 12시간씩 명 암을 자동 조절하여 적응시켰다.

4) 실험군의 식이와 검액의 투여 방법

실험 시작부터 5마리는 일반식이를 급여하고, 10마 리는 고지방식이를 4주간 급여하여 비만을 유도하고 5주째부터 비만식이에 약재를 섞어서 10주간 급여하 였다.

동물군은 총 4군 즉 1) 일반식이, 2) 고지방식이, 3) 고지방식이 + DSH, 4) 고지방식이 + EGCG ¹⁾ (positive control)를 투여한 군으로 설정하였다.

마우스에 4주간 60% 고지방식이를 통해 비만 유도 후 5주째부터 14주까지 각 약재를 100 ㎎/㎏/day 용량

(성인 60 kg일 때 하루 섭취량 (≃8g/60kg/day)을 기준

1) EGCG (Epigallocatechin gallate, 갈산염 -3- 에피갈로카테킨 ) 혹은

카테킨 : 녹차엽의 추출물인 폴리페놀의 일종으로 여러 논문

에서 3T3-L1 에 대한 억제효과가 확인되어 신물질의 항비만

효과의 비교 · 검증 지표로 사용됨 .

으로 산정)으로 투여한 약물 투여군과 고지방사료만 투여한 대조군에서 몸무게 변화를 측정하였다. 일반식 이 (Con)와 고지방식이 (HFD)의 kg당 조성의 내용과 분량은 다음과 같다 (Table 2).

5) 지방세포 배양

3T3-L1 지방전구세포를 배양액을 이용하여 5%로 이산화탄소가 공급되는 배양기에서 온도는 37 ℃로 배 양한다. 세포 배양액은 10% fetal bovine serum (FBS)과 항생제 (antibiotics)가 포함된 Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM)을 사용한다. 3-4일 간격으로 배양세포 에 0.25% 트립신 (trypsin)을 넣고 처리하여 세포를 탈 착시켜 계대 배양한다.

6) 분화유도 과정

전지방세포는 분화유도 물질인 인슐린 (1 ㎍/㎖), de- xamethasone (DEX, 1 μM), 1-methyl-3-methylxanthine (IBMX, 0.5 mM)이 함유된 분화유도 배양액으로 교환 하여 2일간 배양하여 지방세포로 분화를 유도한다. 배 양 2일 후 인슐린만 함유하는 배지로 교환하고 약물을 처리하여 2일간 배양하고, 다시 인슐린만 함유한 배지 로 교환한 후 2일간 배양한다 (Fig. 1).

Consistents Con HFD*

Casein 200.0 265.0

L-Cystine 3.0 4.0

Corn Starch 397.486 -

Maltodextrin 132.0 160.0

Sucrose 100.0 90.0

Lard - 310.0

Soybean Oil 70.0 30.0

Cellulose 50.0 65.5

Mineral Mix

35.0 48.0

Calcium Phasphate, dibasic - 3.4

Vitamin Mix

10.0 21.0

Choline Bitartrate 2.5 3.0

TBHQ, antioxidant

0.014 -

Blue Food Color - 0.1

a)

Mineral Mix, AIN-93G-MX (94046) containing (g/kg) : calcium phosphate dibasic 500, sodium chloride 74, potassium citrate 220, potassium sulfate 52, magnesium oxide 24, manganous carbonate 3.5, ferric citrate 6, zinc carbonate 1.6, cupric carbonate 0.3, potassium iodate 0.01, sodium selenite 0.01, chromium potassium sulfate 0.55

b)

Vitamin Mix, AIN-93-VX (94047) containing (g/kg) : thiamin HCl 0.6, riboflavin 0.6, pyridoxine HCl 0.7, niacin 3, calcium pantothenate 1.6, folic acid 0.2, biotin 0.02, vitamin B12 (0.1% trituration in mannitol) 1, dry vitamin A palmitate (500,000 U/g) 0.25, manadione sodium bisulfite complex 0.15

c)

TBHQ : tertiary butylhydroquinone

* High fat diet : 60% of total calories come from fat.

Table 2. Composition of Experimental Diets (g/kg)

2. 方法 1) 세포 실험

(1) 세포 독성 시험 (MTS assay)

지방세포 분화억제 효과 탐색을 위한 약물 처리 농 도 결정을 하기 위해 96 well plate에서 MTS assay를 수 행한다. 각 약물을 처리한 세포를 48시간 배양하고 MTS 시약 10 ㎕를 첨가하여 37 ℃, 5% CO

incubator 에 4시간 반응시킨 후 490 ㎚에서 microplater reader로 흡광도를 측정하였다.

(2) Oil-Red-O 염색법

지방세포로 분화된 세포 내의 지방을 염색하여 분 화정도를 측정하기 위하여 Oil-Red-O 염색법을 수행하 였다. 세포를 10% 포름알데하이드 (formaldehyde)로 1 시간 동안 고정시킨 후 60% 이소프로판올 (isopropyl- alcohol)액으로 세척하였다. 세포를 60% Oil-Red-O로 30분간 염색하였다. 세포질 내 붉은색 과립이 있는 세 포를 분화된 지방세포로 간주하고, 염색된 Oil-Red-O 를 100% 이소프로판올로 녹여내어 500 ㎚에서 흡광도 를 측정하여 지방세포의 분화정도를 측정하였다.

(3) Real-time RT-PCR (Reverse transcription- polymerase chain reaction)

지방분화 진행 중 발현되는 전사인자인 PPARγ와 C/EBPα에 미치는 영향을 알아보기 위해 Real-time RT-PCR을 수행하였다. 지방세포를 분화시켜 약물을 농도별로 처리한 후, QIAZol Lysis reagent를 사용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 template로 power cDNA synthesis kit (Intron)를 이용하여 single stranded cDNA를 제조하였다. 발현 정도는 DNA에 유전자를 특이적으로 증폭하는 PPARγ, C/EBPα primers를 넣어 Real-time RT-PCR 방법을 이용하여 측정하였다.

(4) Western blotting

지방세포를 분화시켜 약물을 농도별로 처리한 후, 3T3-L1 세포를 RIPA buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5),

0.1% SDS (sodium dodecyl sulphate), 0.1% Triton X-100, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulphonyl fluoride)로 용해시 킨 후 8% SDS-polyacrylamide gel 전기 영동한 다음 ni- trocellulose membrane에 transfer한다. 5% skim milk로 blocking한 후 여러 가지 1차 항체 (PPARγ, C/EBPα) 및 horseradish peroxidase (Jackson Lab.)가 부착된 2차 항체 로 반응시키고 ECL 용액 (Amersham Bioscience, Pisca- taway, NJ)을 사용하여 목적 단백질을 확인하였다.

2) 동물 실험 (1) 체중 측정

동물군은 총 4군, 즉 1) 일반식이, 2) 고지방식이, 3) 고지방식이 + DSH, 4) 고지방식이+ EGCG (positive con- trol)를 투여한 군으로 설정하였다. 마우스에 4주간 60% 고지방식이를 통해 비만 유도 후 5주째부터 14주 까지 100 ㎎/㎏/day 용량으로 투여한 약물 투여군과 고 지방사료만 투여한 대조군에서 몸무게 변화를 측정하 였다.

(2) 혈중 지질 측정

동물군은 총 4군, 즉 1) 일반식이, 2) 고지방식이, 3) 고지방식이 + DSH, 4) 고지방식이+ EGCG (positive con- trol)를 투여한 군으로 설정하였다. 마우스에 4주간 60% 고지방식이를 통해 비만 유도 후 5주째부터 14주 까지 100 ㎎/㎏/day 용량으로 DSH가 섞인 고지방식이 를 자유롭게 섭취하게 한 후, 14주째에 동물의 혈청에 서 Total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, Triglyceride, Fructosamine, Glucose를 측정하였다.

3) 통계분석

실험 결과는 각 실험에 대한 평균값 ± S.E.M. 로 표 기 하였고, 각 그룹 간의 차이를 결정하기 위한 통계분 석은 Independent t-Test를 이용하였다. 모든 통계분석 은 SPSS v14.0 statistical analysis software를 이용하여 수 행하였다. P < 0.05인 값을 통계적 유의성이 있는 것으 로 판단하였다.

Fig. 1 The differentiation inducing process of preadipocyte

Ⅲ. Results

1. 세포독성 시험 결과

실험에 사용된 DSH가 지방세포의 생존율에 미치는 영향을 관찰하기 위해 MTS assay를 진행하였다. 그 결 과 DSH 0.01 ㎎/㎖에서 1 ㎎/㎖까지 세포독성이 없음 을 확인하였다 (Fig. 2).

2. 지방세포 분화억제 효과

DSH를 3T3-L1 세포에 처리 후 지방세포 분화억제 정도를 측정하였다. 분화억제 정도는 Oil-Red-O 측정 법을 통하여 확인하였고, 지방세포 분화인자 발현 정 도는 Real-time RT-PCR과 Western blot으로 확인하 였다.

Fig. 2. Effect of DSH on cell viability in 3T3-L1 preadipocytes

Cells were incubated with DSH at the indicated concentration (0.01-1 ㎎/㎖) for 24h and the growth rate was assessed by MTS assay. All values are mean ± S.E.M.

P < 0.05 compared with control. (DSH: Dai-saiko-to; Control: isopropanol)

Fig. 3. Effects of DSH on lipid accumulation in 3T3-L1 cells

3T3-L1 preadipocytes were incubated with MDI differentiation medium for 2 days with the indicated concentrations (0.01-1 ㎎/㎖) of DSH. At day 6, the cells were fixed and stained with Oil-Red-O. The cellular lipid content was assessed by Oil-Red-O staining. All values are mean ±

S.E.M.

P < 0.05 compared with control. (Blank: preadipocyte; Control: adipocyte)

1) 지방축적 억제 효과

Oil-Red-O 측정을 통해서 DSH의 농도별 분화억제 정도를 알아보았다. 3T3-L1 preadipocyte에 DSH를 처 리하여 분화억제 정도를 측정한 결과, DSH 0.01 ㎎/㎖

에서 1 ㎎/㎖까지 농도 의존적으로 지방세포 분화억제 효과를 나타냄을 확인하였다 (Fig. 3).

2) 지방세포 분화조절인자 유전자 발현 억제효과

3T3-L1 세포에 DSH를 처리하여 지방세포 분화조절 인자인 PPARγ, C/EBPα의 유전자 발현 정도를 측정한 결과, DSH 0.01 ㎎/㎖에서부터 농도 의존적으로 PPAR γ, C/EBPα 유전자 발현 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다 (Fig. 4, 5).

3) 지방세포 분화조절인자 단백질 발현 억제 효과 3T3-L1 세포에 DSH를 처리하여 지방세포 분화조절

The PPARγ mRNA levels on day 6 of differentiation were determined by the Real-time RT-PCR. All values are mean ± S.E.M.

P < 0.05 compared with control. (Blank: preadipocyte; Control: adipocyte)

Fig. 5. DSH inhibited gene expression of C/EBPαin 3T3-L1 cells

The C/EBP

mRNA levels on day 6 of differentiation were determined by the Real-time RT-PCR. All values are mean ± S.E.M.

P < 0.05 compared

with control. (Blank: preadipocyte; Control: adipocyte)

인자인 PPARγ와 C/EBPα의 단백질 발현 정도를 Western blot analysis를 통해 측정한 결과, 단백질 level 에서도 역시 PPARγ와 C/EBPα 발현 억제 효과를 확인

할 수 있었다 (Fig. 6 (A) and (B)).

2) GW9662 : PPARγ 의 antagonist 로써 많이 알려짐 . 3T3-L1 에서

지방세포로의 발현을 억제시킴 .

Fig. 6. Effects of DSH on the expressions of adipogenic proteins including PPARγand C/EBPα

The expression levels of master regulators of adipocyte differentiation; PPARγ (A), C/EBPα (B) after induction were measured by western blotting.

(Blank: preadipocyte; Control: adipocyte; EGCG and GW9662

: positive controls)

Fig. 7. The anti-obesity effect of DSH in high-fat diet-induced obese mice

Effect of DSH on body weight gain after 14 weeks of experimental diet feeding. All values are mean ± S.E.M.

P < 0.05 compared with control.

(Normal: normal diet; Control: high-fat diet; DSH: high-fat diet + DSH; Positive: high-fat diet + EGCG)

3. 체중감소 효과

고지방식이로 마우스에서 비만을 유도한 후 체중 변화를 측정한 결과, DSH 투여군에서 약물 투여 5주

(실험 9주) 이후부터 체중증가에 있어서 감소 효과를 확인하였고, DSH 투여 9주 (실험 13주) 이후부터 통계 적으로 유의한 비만 억제 효과를 확인하였다 (Fig. 7).

4. 혈중지질농도 감소 효과

고지방식이로 마우스에서 비만을 유도한 후 혈중지 질농도 변화를 측정한 결과, 고지방식이 + DSH 투여군 에서 통계적으로 유의하게 혈중 Glucose, Total choles- terol 및 LDL-cholesterol이 감소함을 확인하였다 (Fig. 8).

Ⅳ. Discussion

비만은 체내에서 요구되는 에너지의 양보다 많은 에너지를 섭취하고 남은 에너지가 지방으로 바뀌어 체 내에 축적되어 발생되는 일종의 병리현상으로 체내의 지방조직이 과다하게 증가된 상태를 말하며

, 지방세 포의 수와 크기의 증가로 인하여 발생한다

. 세계보건 기구 (WHO)에서는 비만을 단순히 체중이 많은 상태가 아닌, 당뇨병이나 심혈관계 질환과 같은 성인병에 걸 릴 위험을 높이고 이로 인해 사망률을 증가시키는 질 병으로 규정하고 있다

. 이 중 소아 및 청소년의 비만 은 대사증후군과 코골이, 수면장애, 사춘기 조기 도래 와 연관이 높으며

, 단순히 지방세포의 크기가 증가

All values are mean ± S.E.M.

P < 0.05 compared with control. (Normal: normal diet; Control: high-fat diet; DSH: high-fat diet + DSH; Positive:

high-fat diet + EGCG)

하는 성인 비만과는 달리 지방세포의 수가 증가되어 발생하므로 정상체중으로의 전환이 어렵다

. 또한 국 내 소아청소년의 비만 유병률은 1997년 (5.8%)과 비교 시 2005년 (9.7%)에 1.7배 정도 증가하였고

, 이후에 도 꾸준히 10% 정도 (2010년 10.8%)의 비만 유병률을 나타내고 있어

소아청소년 비만의 심각성에 대하여 바르게 인식하고 보다 적극적인 관리와 예방 및 치료 가 필요한 실정이다.

한의학적으로 비만은 서구화된 식생활로 인한 脾胃 기능 실조와 활동량 감소 및 운동 부족으로 인한 氣虛 로 발생한 濕, 痰, 瘀 등의 병리적 산물이 肌膚나 腹膜, 臟腑 등에 留滯되는 것으로

, 祛痰化濕利水, 通腑泄 熱, 活血通絡, 補氣健脾를 위주로 치료한다

.

大柴胡湯은 淸內解外시켜서 表裏雙解하는 대표적 處方으로

, 少陽陽明合病 (少陽轉屬陽明)으로 인한 寒熱往來, 胸脇苦滿, 嘔不止, 鬱鬱微煩, 心下痞鞕, 或 心下滿痛, 大便不利, 舌苔黃, 脈弦有力 등의 症을 치 료하며 外解少陽, 內瀉熱結, 疏肝解鬱 등의 효능이 있 다고 알려져 있다

. 처방 구성은 少陽病의 小柴胡湯 에서 補性 있는 人蔘과 甘草 대신 鎭靜, 收斂하는 芍藥 을 加하고, 蕩滌腸胃하고 消炎解熱하는 大黃과 枳實 을 配劑한 것으로, 肥滿 體質에 便秘가 있는 實證 患者 에게 쓰고, 瘦弱하고 胃腸이 좋지 않아 軟便인 患者에 게는 적합하지 않으므로 유의해야 한다고 하였다

. 大 柴胡湯을 구성하는 개별 약재의 효능과 지질 및 비만 과 관련된 약리작용은 다음과 같다.

柴胡는 繖形科에 속한 柴胡 및 同屬 近緣植物의 根 으로, 苦 · 辛 · 微寒, 無毒하고 肝 · 膽 二經에 작용한 다. 和解退熱 · 疏肝解鬱 · 升擧陽氣하여 感冒風熱 · 寒 熱往來 · 肝氣鬱滯 · 氣虛下陷 등의 병증을 치료한다

. 해열, 진정, 진통, 항염 및 혈압 강하, 혈관수축억제 등 의 효능이 있으며

, 비만을 개선하고 항산화계 효소의 활성을 증가시킨다는 보고가 있다

.

黃芩은 脣形科에 속한 황금 및 同屬 近緣植物의 根 으로, 苦 · 寒, 無毒하고 肺 · 膽 · 胃 · 大腸 四經에 작용 한다. 淸熱燥濕, 瀉火解毒, 止血安胎하여 濕熱黃疸, 瀉痢, 熱淋, 氣分實熱, 肺熱咳嗽, 癰腫瘡毒, 血熱의 出 血, 胎熱不安 등의 병증을 치료한다

. 항염, 해열, 진 정, 혈압강하, 혈관확장, 利尿, 利膽의 효능과 고지혈증 개선 작용이 알려져 있으며

, 지방축적을 억제하고

지질대사 및 항산화방어계에 작용한다는 보고가 있다

. 芍藥은 毛茛科에 속한 함박꽃과 산작약의 根으로, 酸 · 苦 · 凉, 無毒하고 肝 · 脾 二經에 작용한다. 養血

斂陰, 平抑肝陽, 柔肝止痛하여 肝血虧虛, 月經不調, 胎産諸證, 體虛多汗, 肝陰虛動風, 肝陽上亢, 肝急諸 痛 등의 병증을 치료한다

. 解痙, 진통, 항염, 항궤양, 항균, 해열의 효능과 순환계통에 대한 약리작용이 알 려져 있으며

, 고지혈증 개선에 유효하다는 보고가 있다

.

大黃은 蓼科에 속한 장군풀 및 同屬 近緣植物의 根 및 根莖으로, 苦 · 寒, 無毒하고 脾 · 胃 · 大腸 · 肝 · 心 五經에 작용한다. 攻積導滯, 瀉火解毒, 行瘀通經, 淸利 濕熱하여 實熱便秘, 積滯腹痛, 熱毒瘡瘍, 腸癰, 瀉痢 不爽, 瘀血經閉, 濕熱黃疸 등의 병증을 치료한다

. 고 지방식이에 의한 생쥐의 체중증가 및 지방축적을 억제 하고

혈청 지질을 개선하며

지질 대사와 관련된 li- pase, lactate dehydrogenase, creatine kinase 등 효소의 활 성에 영향을 미친다고 알려져 있다

.

枳實은 芸香科에 속한 탱자나무 및 광귤나무와 同 屬 近緣植物의 未成熟한 幼果로, 苦 · 辛 · 微寒, 無毒 하고 脾 · 胃 · 大腸 三經에 작용한다. 破氣行痰, 散積 消痞하여 食積停滯, 腹痛便秘, 瀉痢不暢, 裏急後重, 痰濁阻滯, 胸脘痞滿 등의 병증을 치료한다

. 고지혈 증에 대한 억제 효과가 알려져 있고

, 혈중 지질과 콜 레스테롤 함량 및 혈당과 혈중 인슐린 농도 감소 효과 에 대한 보고가 있다

.

半夏는 天南星科에 속한 반하 (끼무릇)의 地下類球 形의 塊莖으로, 辛 · 溫, 有毒하고 脾 · 胃 · 肺 三經에 작용한다. 降逆止嘔, 燥濕化痰, 消痞散結하여 寒飮嘔 吐, 胃虛嘔吐, 胃熱嘔吐, 姙娠嘔吐, 濕痰, 痰多咳喘, 痰 飮眩暈, 痰濁胸痺, 痰厥頭痛, 胸脘痞悶, 梅核氣, 癭瘤 痰核, 癰疽腫毒 등의 병증을 치료하며

, 비만쥐의 체 중과 중성지질 감소 효과에 관한 보고가 있다

.

生薑은 生薑科에 속한 生薑의 新鮮한 根莖으로, 辛

· 溫, 無毒하고 肺 · 脾 · 胃 三經에 작용한다. 發汗解 表, 溫中止嘔, 溫肺止咳, 解毒하여 外感風寒表證, 胃 寒嘔吐, 風寒咳嗽痰多 등의 병증을 치료하며

, 고지 혈증 개선 효과가 알려져 있다

.

大棗는 鼠李科에 속한 대추나무의 成熟한 果實로, 甘 · 溫, 無毒하고 脾 · 胃 二經에 작용한다. 補脾和胃, 養血安神, 緩和藥性하여 脾虛少食, 脾弱便溏, 氣血津 液不足, 血行不和, 營衛不和, 心悸怔忡, 婦人臟躁 등 의 병증을 치료하며

, 대추 추출액이 rat의 지질 함량 감소에 영향을 미친다는 보고가 있다

.

즉, 大柴胡湯은 柴胡, 黃芩, 芍藥의 寒凉藥으로 少

陽經의 熱을 除去하고, 枳實, 大黃의 苦寒藥으로 陽明

현재까지 大柴胡湯과 관련한 연구

들은 주로 지 질함량에 미치는 효과에 대한 연구가 대부분으로 지방 세포 분화조절에 관련하여 세포 수준에서 大柴胡湯이 비만에 미칠 수 있는 영향에 대해서는 연구된 바가 없 었다. 따라서 저자는 大柴胡湯의 효능과 적응증 및 구 성약물의 약리작용을 통해 cell level에서도 작용을 나 타낼 것으로 판단하여 3T3-L1 지방전구세포를 이용하 여 大柴胡湯이 지방세포 증식과 그 분화기전 조절에 미치는 영향에 대하여 살펴보았다.

세포수준에서 비만은 지방조직에서 섬유아 지방전 구세포 (preadipocytes)의 지방세포 (adipocytes) 분화에 의한 지방세포 수와 크기의 증가가 원인으로 작용한다

52)

. 비만의 경우 지방세포에서 염증반응의 표지 물질들 을 생산하고 분비하는 것으로 알려져 있으며

, 이러한 물질들의 비정상적인 분비가 여러 대사성 질환들의 원 인으로 작용할 수 있다

. 따라서 비만과 그로 인한 여러 질병들의 효과적인 치료제를 개발하기 위해서는 지방세포에서 분비되는 물질과 지방세포의 증식 및 분 화조절 기전에 대한 이해를 바탕으로 지방축적을 감소 시키고 지방세포의 수를 줄이려는 노력이 필요하다.

마우스의 섬유아세포에서 유래된 지방전구세포 3T3-L1은 1974년에 Green 박사에 의해 소개된 이후 비 만 연구를 위하여 지방세포 분화 연구에 가장 많이 사 용되는 모델로 지방세포 분화 전후의 효과를 뚜렷하게 비교할 수 있다

. In vitro에서 3T3-L1 지방전구세포에 분화유도물질 (insulin, dexamethasone 및 3-isobutyl-1- methylxanthine)을 첨가하면 지방세포로 전환되는데, 이는 in vivo에서 일어나는 지방분화 과정과 유사한 형 태를 보인다

.

실험에 사용된 DSH가 지방세포의 생존율에 미치는 영향을 관찰하기 위해 MTS assay를 진행한 결과 DSH 0.01 ㎎/㎖에서 1 ㎎/㎖까지 대조군에 비하여 세포독성 을 나타내지 않아 각 농도에서 지방세포 분화에 대한 DSH의 효과를 실험하였다.

DSH를 3T3-L1 세포에 처리한 후 Oil-Red-O 측정법 을 통하여 지방세포 분화억제 정도를 측정한 결과, DSH 0.01 ㎎/㎖에서 1 ㎎/㎖까지 농도 의존적으로 지 방세포 분화를 억제하였다. 따라서 DSH가 3T3-L1 지 방세포 분화유도과정에서 지방이 축적되는 정도를 유 의하게 감소시킨다는 것을 알 수 있었다.

자에 의해서 억제되고 있다. 비만은 지방세포가 과형 성되는 과정을 거쳐 지방조직이 비대화되는 것으로, 전지방세포의 증식과 분화단계가 비만 형성의 중요한 제어점이라 할 수 있다

.

지방전구세포에서 형태학적으로나 생화학적으로 완벽히 성숙된 지방세포로 분화되는 과정에는 지방세 포 유전자의 조절부위에 중요한 전사활성인자가 활성 되어야 한다

. 이들 중 peroxisome proliferator-acti- vated receptor γ (PPARγ)와 더불어 CCAAT-enhancer binding protein α (C/EBPα)는 지방전구세포에서 지방 세포로의 분화에 있어 가장 핵심적인 기능을 담당한다

61)

. PPARγ와 C/EBPα는 지방세포 분화과정 중 각기 다 른 시점에서 발현이 유도되며 서로 상호 작용을 통하 여 여러 지방세포 특이유전자들의 발현을 조절하고, 지방대사의 활성화와 지방세포 분화를 점진적으로 유 도해 나간다

.

지방전구세포가 adipogenetic signal을 받으면 전사 인자 C/EBPβ와 C/EBPδ의 발현이 유도되고 C/EBPβ와 C/EBPδ 발현의 일시적인 증가는 PPARγ의 발현을 유 도하며, PPARγ의 발현 항진이 C/EBPα의 지방세포 분 화후기 발현 유도를 수반하며 분화를 진행한다

. 즉, PPARγ는 지방세포의 분화에 주요 조절인자로서 성숙 한 3T3-L1 세포의 분화와 지방세포의 기능 유지에 필 요한 유전자의 전사에 중요한 역할을 하며

, C/EBP α는 지방세포의 최종분화 (terminal differentiation)를 유 도하는데 중요한 역할을 하는 전사인자로 이해할 수 있다

.

본 연구에서는 DSH가 지방세포 분화조절인자인 PPARγ와 C/EBPα의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 유전자 및 단백질 발현량에서 확인하였다. 3T3-L1 세 포 분화를 유도하면서 DSH를 농도별(0.01, 0.1, 1 ㎎/㎖) 로 처리하고 지방세포 분화 6일 후 Real-time RT-PCR 을 실시하여 PPARγ 및 C/EBPα의 유전자 발현 정도를 측정한 결과, DSH가 농도 의존적으로 PPARγ 및 C/EBPα의 유전자 발현을 억제하는 것으로 나타났다.

또한 3T3-L1 세포에 DSH를 처리하여 PPARγ와 C/EBP

α 단백질 발현 정도를 western blot analysis를 통해 측정

한 결과, DSH가 단백질 level에서도 PPARγ와 C/EBPα

발현 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 이러한

결과로 DSH는 3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분

화되는 과정을 억제하는 작용이 있으며, 그 기전은 PPARγ와 C/EBPα의 발현 억제와 관련이 있는 것으로 사료된다.

고지방식이로 마우스에서 비만을 유도한 후 DSH 투여군의 체중 변화를 측정한 결과, DSH 투여군에서 DSH 투여 5주 이후부터 체중증가에 있어서 감소 효과 를 확인하였고, 9주 이후부터 통계적으로 유의한 비만 억제 효과를 확인하였다.

Cholesterol은 세포막의 구성성분이며, 각종 steroid hormone을 비롯한 hormone 생산의 원료나 담즙산의 전 구체로서 중요한 물질이다. 혈청 총 cholesterol 함량은 관상동맥질환의 발생과 상관성이 있으며, 고 cholester- ol혈증이 동맥경화증의 위험 신호가 되기 때문에 임상 적으로 중요시되고 있다

. 또한 혈청 총 cholesterol 함량은 비만지수가 높을수록 높게 측정되므로 비만 측 정의 지표가 될 수 있다

. 특히 LDL-cholesterol은 혈청 중 콜레스테롤의 주된 운반형태로 동맥 내 혈관 벽에 콜레스테롤을 축적하여 동맥경화증과 심혈관계 질환 의 발병에 중요한 위험인자로 알려져 있다

. 고지방식 이를 지속하게 되면 LDL-cholesterol의 함량이 현저히 증가하는데

, 이를 감소시키면 HDL-cholesterol 농도 를 증가시켜 지질대사를 개선할 수 있다

.

본 연구에서 고지방식이 유도 비만쥐에 5주 때부터 DSH를 첨가하여 14주까지 급여한 후 혈중지질농도 변 화를 관찰한 결과, 고지방식이 + DSH 투여군에서 통계 적으로 유의하게 혈중 Glucose, Total cholesterol 및 LDL-cholesterol이 감소하여 DSH가 지질대사 개선에 효과적으로 작용함을 확인할 수 있었다.

이상을 종합하여 보면, 大柴胡湯이 지질대사에 관 여하여 작용하며 지방세포 분화과정을 억제하는 작용 이 있고 그 기전은 PPARγ 및 C/EBPα의 발현 억제와 관련이 있는 것으로 사료된다.

본 연구 결과는 지질대사와 비만 관련 유전자 및 단 백질의 발현을 조절하는 大柴胡湯의 비만 치료제로서 의 활용 가능성을 제시한다. 향후 이를 바탕으로 한 임 상적 연구와 개별 약물의 유효 성분과 작용 기전 등에 대한 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Ⅴ. Conclusion

大柴胡湯 (DSH)을 이용하여 지방세포 분화억제 정

도와 고지방식이 유도 비만쥐의 체중 변화, 혈중지질 농도의 변화를 비교 분석한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. DSH는 약물처리 농도에서 세포독성이 없음을 확 인하였다.

2. DSH는 지방세포의 분화를 농도 의존적으로 억제 하였다.

3. DSH는 PPARγ와 C/EBPα의 유전자 및 단백질 발 현을 농도 의존적으로 억제하였다.

4. DSH 투여군에서 가장 유의성 있는 체중감소 효 과를 확인할 수 있었다.

5. DSH 투여군에서 혈중 Glucose, Total cholesterol 및 LDL-cholesterol 농도가 통계적으로 유의하게 감소하였다.

종합하면 大柴胡湯은 고지방식이로 유도되는 비만 을 억제하였으며 그 기전에 PPARγ 및 C/EBPα의 발현 억제가 관여하는 것으로 사료된다.

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