자소엽 주정 추출물이 고지방식이로 유도된 대사증후군 및 비알코올성 지방간 개선에 미치는 영향
최지영1*․김지원2*․권은영2
1조선대학교 식품영양학과
2경북대학교 식품영양학과
Effects of the Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo Ethanol Extract (PFE) on the Improvement of Metabolic Syndrome and
Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Induced by High-Fat Diet
Ji-Young Choi1*, Ji-Won Kim2*, and Eun-Young Kwon2
1Department of Food and Nutrition, Chosun University
2Department of Food and Nutrition, Kyungpook National University
ABSTRACT Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo (PF) is a traditional herb that belongs to the lamiaceae family.
PF has been reported to have numerous biological activities, including antioxidant, anti-allergic, anti-inflammatory, anticancer, and neuroprotection effects. This study examined the effects of PF ethanol extract (PFE) on obesity and its complications, particularly focusing on non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) in C57BL/6J mice fed high-fat diets (HFD). Male mice were fed a normal diet (ND), a HFD, or HFD+PFE (1% w/w, PFE) for 12 weeks. The PFE treatment ameliorated dyslipidemia and hyperglycemia HFD-induced obese mice coupled with the enhanced energy expenditure. The liver weight and hepatic lipotoxicity markers (GOT and GPT) were reduced significantly in the PFE group than in the HFD group. Moreover, the hepatic lipid profiles and morphological analysis showed less hepatic lipid accumulation in the PFE group than the HFD-fed mice. In particular, the expression of hepatic lipogenic genes (Acc1 and Cidea) was down-regulated, whereas the expression of fatty acid oxidation-related genes (Pgc1α and Pparα) was increased. These results suggest that PFE can prevent or attenuate the development of HFD-induced obesity and NAFLD.
Key words: Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo ethanol extract, high-fat diet-induced obesity, non-alcoholic fatty liver disease, energy expenditure, hypolipidemic effect
Received 14 July 2020; Accepted 13 August 2020
Corresponding author: Eun-Young Kwon, Department of Food and Nutrition, Kyungpook National University, Daegu 41566, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-53-950-6231
Author information: Ji-Young Choi (Researcher), Ji-Won Kim (Grad- uate student), Eun-Young Kwon (Professor)
*These authors contributed equally to this work.
서 론
지방조직의 주된 역할은 체내에 에너지를 저장하는 것이 다. 그러나 과도한 에너지 섭취로 인해 체내 대사 활동으로 소모되지 못한 잉여 에너지는 중성지방의 형태로 지방조직 에 축적된다. 이러한 지방조직이 필요 이상으로 과도하게 축적되면 정상적인 생리 및 생화학적 기능에 영향을 미친다 (Grundy, 1998). 특히 간에서의 지질 대사 조절 밸런스가 무너지게 되면 간조직의 지질 축적 및 인슐린 저항성을 초래 한다. 대사증후군의 합병증인 비알코올성 지방간(non-al-
coholic fatty liver disease, NAFLD)은 전 세계적으로 유 병률이 증가하는 추세로 단순한 지방구의 축적인 가벼운 지 방증(simple hepatic steatosis)에서부터 지방간염(stea- tohepatitis), 간경변증(hepatic fibrosis) 및 간암(liver can- cer)과 같은 만성질환으로 진행될 수 있다(Park 등, 2006).
NAFLD 환자의 경우 혈중 중성지질과 요산 수치 증가 및 HDL-콜레스테롤 수치 감소 등의 특징을 보였다(Marche- sini 등, 2001). 간의 섬유화(fibrosis)는 낮은 아디포넥틴 (adiponectin) 수치로 인해 촉진된다고 추정하였으며(Bu- gianesi 등, 2005), 아디포넥틴이 간의 섬유화를 억제할 수 있다는 연구결과가 밝혀져 있다(Ding 등, 2005).
자소엽(Perilla frutescens var. acuta)은 차즈기 또는 주 름소엽으로 불리며 꿀풀과(labiatae)에 속하는 1년생 초본 식물의 잎을 말린 것으로 아시아권에서 식용으로 오랫동안 사용되어 온 식물이다. 자소엽의 지표 성분으로는 rosmar- inic acid, elemicin 및 dillapiole 등이 있고, 특히 rosmar- inic acid는 자소엽의 주성분이다(Zhao 등, 2015). 자소엽
은 항응고(Jeoung 등, 2008), 항알레르기(Makino 등, 2003) 등의 효능이 보고되어있고, 주성분인 rosmarinic acid의 간 보호(Osakabe 등, 2002)에 관한 효과가 입증되어 있다. 또 한, 자소엽 주정 추출물의 경우 강력한 항산화제(Kim 등, 2007)로서 염증성 사이토카인을 억제하고 항염증성 사이토 카인의 발현 증가에 효과 있는 것으로 보고되어 있다(Ueda 등, 2002). 현재까지 간 보호 효과에 관한 연구는 있지만 식이로 유도된 NAFLD에 대한 연구는 부족한 실정이다.
따라서 본 연구에서는 C57BL/6J 마우스를 이용하여 12 주 동안 자소엽 주정 추출물을 고지방식이에 혼합해서 제공 한 뒤 체중, 혈장 지질 농도 및 간 지질 대사의 유전자 발현 측정 등을 통해 기능성 식품 소재로서 자소엽의 대사증후군 및 NAFLD 개선 효과를 조사하였다.
재료 및 방법
실험 재료
본 연구에 사용된 국내산 자소엽은 Pureherb(Yeong- cheon, Korea)로부터 건조물을 구매하여 사용하였다. 자소 엽은 70% 에탄올을 사용하여 5시간 동안 초음파 추출하였 고 추출물은 여과, 농축 후 동결건조하여 동물실험에 사용하 였으며 추출 수율은 17.6%였다.
실험동물
4주령 수컷 C57BL/6J 마우스는 (주)중앙실험동물(Seoul, Korea)에서 구매하여 1주일간 pellet 형태의 Lab chow를 제공하여 적응시킨 후 실험을 진행하였다. 동물 실험실 사육 조건은 항온(22~24°C), 항습(45~55°C), 명암주기는 12시 간 주기로 일정한 조건을 유지하여 개별 케이지 안에서 사육 하였으며 실험 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였다.
동물실험에 사용된 식이는 미국영양학회(American Insti- tute of Nutrition, AIN, USA)가 추천하는 AIN-93G 사료 (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, USA)를 구매 하여 사용하였다(Reeves 등, 1993). 실험동물을 난괴법 (randomized block design)에 따라 각 처리 군당 10마리씩 총 3군, 정상식이군(normal diet, ND), 고지방식이군(high- fat diet, HFD, 60% kcal fat), 1% 자소엽 주정 추출물을 첨가한 고지방식이군(PFE)으로 나누어 12주간 급여하였 다. 동물실험은 경북대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 진행하였다(승인번호: 2017-0109).
해부 및 시료수집
실험 기간 중 4주마다 12시간 절식 후 마취 없이 꼬리에서 채혈하여 혈당을 측정하였다. 사육종료 12시간 전 절식한 실험동물을 isoflurane(5 mg/kg body weight, Baxter, Deerfield, IL, USA)으로 마취하여 개복한 후 대동맥으로부 터 혈액을 채취하여 3,000 rpm에서 15분간 원심분리해 혈 장을 수집하였다. 실험동물의 간, 근육, 부고환 백색지방
(epididymal white adipose tissue), 신 주위 백색지방(pe- rirenal white adipose tissue), 피하지방(subcutaneous white adipose tissue), 견갑골간 백색지방 및 갈색지방(in- terscapular white and brown adipose tissue) 조직은 식 염수에 수차례 세척 후 표면의 수분을 제거하고 무게를 측정 하였다. 모든 시료는 분석 시까지 -70°C에 보관하였다.
간조직 및 지방조직의 형태학적 분석
간 및 지방조직은 일정 크기로 잘라 10% 포르말린 용액 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 고정한 후 알코 올로 탈수하고 파라핀으로 포매하였다. 이를 4 μm의 두께로 잘라 hematoxylin&eosin(H&E) 및 Masson’s trichrome (MT)(Sigma-Aldrich)으로 염색하였다. 모든 염색된 샘플 은 광학현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 200배 에서 관찰하였다.
혈장 지질 수준 측정
혈장 중성지방, 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 농도는 아산제약(Asan Pharm Co., Seoul, Korea)의 효소 kit을 사 용하여 측정하였다. 혈장 아디포카인(leptin, resistin, mono- cyte chemotactic protein-1(MCP-1))의 함량 측정은 Mul- tiplex detection kit(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 및 Luminex 200 labmap system(Bio-Rad)을 사용하여 측정 하였다. 혈장 아디포넥틴은 mouse adiponectin/Acrp30 (R&D systemsTM, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 측 정하였다.
혈장 GOT와 GPT 활성도 측정
간세포 손상과 관련이 있는 glutamic oxaloacetic trans- aminase(GOT)와 glutamic pyruvic transaminase(GPT) 활성도는 Reitman과 Frankel(1957)의 비색 분석법을 이용 해 발색법 원리에 의한 아산제약(Asan Pharm Co.)의 시약 kit을 사용하여 측정하였다.
대사율 측정
대사율 측정은 간접 열량계(Oxylet; Panlab, Cornella, Spain)를 이용하여 측정하였다. 실험동물은 개별 metabolic chamber에 넣고 식이와 물은 자유롭게 공급하였으며 온도 는 25°C를 유지하였다. O2와 CO2 분석기는 고순도의 가스 로 보정하였다. O2의 소비와 CO2의 생산은 compute-as- sisted data acquisition program(CHART5.2; AD Instru- ment, Sydney, Australia)을 사용하여 3분 간격으로 마우스 개별로 저장되었으며 24시간동안 지속하여 측정하였다. En- ergy expenditure(EE)는 다음과 같은 식으로 계산하였다.
EE (kcal/day/body weight0.75)＝VO2×1.44×{3.815+
(1.232×VO2/VCO2)}
Table 1. Primer sequences used for RT-qPCR
Primer Primer direction Sequence
Gapdh: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Forward Reverse
5′-AAGGTCATCCCAGAGCTGAA-3′
5′-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′
Acat: acetyl-coenzyme A acetyltransferase Forward Reverse
5′-AGAAATCAAGCAAAGGTCCA-3′
5′-AGGAGTCCTTGGGTAGTTGT-3′
Acc1: acetyl-CoA carboxylase 1 Forward
Reverse
5′-GCCTCTTCCTGACAAACGAG-3′
5′-TGACTGCCGAAACATCTGTG-3′
Cidea: cell death-inducing DNA fragmentation factor alpha subunit-like effector A
Forward Reverse
5′-TTTCAAACCATGACCGAAGTAGC-3′
5′-CCTCCAGCACCAGCGTAACC-3′
Cpt1α: carnitine palmitoyl-CoA transferase 1-alpha Forward Reverse
5′-ATCTGGATGGCTATGGTCAAGGTC-3′
5′-GTGCTGTCATGCGTTGGAAGTC-3′
Fas: fatty acid synthase Forward
Reverse
5′-GCTGCGGAAACTTCAGGAAAT-3′
5′-AGAGACGTGTCACTCCTGGACTT-3′
Lipe: lipase E Forward
Reverse
5′-GGCTCACAGTTACCATCTCACC-3′
5′-GAGTACCTTGCTGTCCTGTCC-3′
Pgc1α: peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha
Forward Reverse
5′-AAGTGTGGAACTCTCTGGAACTG-3′
5′-GGGTTATCTTGGTTGGCTTTATG-3′
Pparα: peroxisome proliferator-activated receptor alpha Forward Reverse
5′-CCTGAACATCGAGTGTCGAATAT-3′
5′-GGTCTTCTTCTGAATCTTGCAGCT-3′
Pparγ: peroxisome proliferator-activated receptor gamma
Forward Reverse
5′-GCATGGTGCCTTCGCTGA-3′
5′-TGGCATCTCTGTGTCAACCATG-3′
Scd1: steroly-CoA desaturase 1 Forward
Reverse
5′-CCCCTGCGGATCTTCCTTAT-3′
5′-AGGGTCGGCGTGTGTTTCT-3′
Sirt1: sirtuin1 Forward
Reverse
5′-TGTGAAGTTACTGCAGGAGTGTAA-3′
5′-GCATAGATACCGTCTCTTGATCTG-3′
간조직 지질 함량 측정
간조직 지질은 Folch 등(1957)의 방법을 따라 추출한 다 음, 추출액을 37°C에서 질소 가스로 휘발 시켜 isopropa- nol(Sigma-Aldrich)로 희석하였다. 정량을 위해 효소 시약 에 유화제로 3 mM cholic acid(sodium salt)와 발색 시 일 어나는 탁도를 제거하기 위해 0.5% Triton X-100(Sigma- Aldrich)을 혼합하여 지질 성분을 추출한 후 혈장 중성지질, 콜레스테롤 및 유리지방산 정량법과 동일하게 정량하였다.
Real-time quantitative PCR 분석
간조직에서 지방산 합성 및 산화와 관련된 유전자 발현 변화를 관찰하였다. 실험동물의 간조직 0.1 g 당 1 mL의 Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 total RNA를 추출하여 분석 시까지 -80°C에서 보관하였다. Total RNA(1 μg)를 Takara® Prime ScriptTM real time kit (Takara Bio, Shiga, Japan)을 사용하여 cDNA로 역전사한 다음 TB Green® Premix Ex TaqTM kit(Takara Bio)을 사 용하여 정량화하였다. 각 유전자의 발현을 분석할 수 있는 primer는 (주)제노텍(Daejeon, Korea)에서 합성하였다. 증 폭은 95°C에서 30초, 95°C에서 5초, 60°C에서 30초를 1 cycle로 하여 총 39회 반응시켰다. 이때 각 cycle 마다 형광 신호를 모니터링하여 나타나는 threshold cycle(Ct)을 분석 하여 각 실험군 간의 mRNA 발현을 CFX-96 real time sys-
tem(Bio-Rad)으로 정량분석하였다. 증폭에 사용한 유전자 primer 염기서열은 Table 1과 같다.
통계처리
실험 결과는 SPSS 프로그램(Statistical Package for the Social Sciences ver 23.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 통계처리 하였다. 실험군 간의 유의성 을 검정하기 위해 분산분석(ANOVA)을 한 후 P<0.05 수준 에서 Duncan’s multiple range test에 의해 검정하였다. 모 든 결과는 mean±SE(standard error)로 나타내었다.
결과 및 고찰
체중 및 식이 섭취량 변화
12주간의 실험 식이 급여 후, 체중 변화 및 식이 효율을 관찰한 결과는 Table 2와 같다. 고지방식이군의 체중 및 체 중 증가량은 정상식이군보다 유의적으로 증가하여 고지방 식이 섭취에 의한 비만 유도를 확인할 수 있었다. 그러나 자소엽 주정 추출물 보충에 의한 체중 감소는 관찰되지 않았 고, 식이 섭취량도 고지방식이군과 자소엽 주정 추출물 섭취 군 간 유의적 차이는 없었다. 또한, 식이 효율은 에너지 밀도 가 높은 고지방식이군이 에너지 밀도가 낮은 정상식이군에 비하여 유의적으로 증가하였으나, 자소엽 주정 추출물 섭취
Table 2. Effect of Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo ethanol extract (PFE) on body weight gain, food intake, energy intake and FER in C57BL/6J mice fed high-fat diet
Measurements Experimental groups
ND HFD PFE
Initial body weight (g) Final body weight (g) Body weight gain (g/d)
21.44±0.42 32.02±0.47a 0.13±0.01a
21.50±0.45 47.61±0.68b 0.31±0.01b
21.07±0.34 45.67±0.88b 0.29±0.01b Food intake (g/d)
Energy intake (kcal/d) FER1)
3.16±0.13b 12.00±0.36a 0.010±0.001a
2.81±0.05a 14.34±0.26b 0.021±0.001b
2.84±0.11a 14.47±1.45b 0.021±0.001b The data are presented as mean±SE. Means not sharing a common letter are significantly different among the groups at P<0.05.
ND, normal diet (AIN-93); HFD, high-fat diet (60% kcal fat); PFE, HFD+1% Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo ethanol extract.
1)Food efficiency ratio=body weight gain/ energy intakes per day.
A B
C D
epididymal perirenal subcutaneous Interscapular Interscapular total total WAT WAT WAT WAT BAT WAT muscle 20
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
Fig. 1. Effect of Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo ethanol extract (PFE) on adipose tissue and muscle weights, adipocyte size of epididymal WAT and energy expenditure in C57BL/6J mice fed high-fat diet. The data are presented as mean±SE. Means not sharing a common letter (a-c) above the bars are significantly different among the groups at P<0.05. ND, normal diet (AIN-93);
HFD, high-fat diet (60% kcal fat); PFE, HFD＋1% Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo ethanol extract. (A) WAT, white adipose tissue; BAT, brown adipose tissue; total WAT, sum of the depots of interscapular WAT, subcutaneous WAT and visceral WAT. (B) Hematoxylin and eosin (H&E) stained transverse-section of epididymal WAT (×200). (C and D) Energy expenditure.
군과 고지방식이군 간의 유의적 차이는 관찰되지 않았다.
지방조직 중량 및 에너지 대사율 변화
부고환 백색지방조직, 신 주위 백색지방조직, 피하 백색 지방조직, 견갑골 백색･갈색지방조직 및 다리 근육을 적출 하여 무게를 측정한 후 체중 100 g 당 조직 무게로 제시하였 다(Fig. 1A). 부고환 백색지방조직을 제외한 나머지 지방조 직 무게는 정상식이군에 비해 고지방식이군에서 유의적으 로 증가하였으므로 고지방식이에 의한 비만 유도가 잘 되었 음이 입증되었다. 자소엽 주정 추출물 섭취군의 모든 지방조
직 무게는 고지방식이군과 유의적인 차이가 없었다. 반면, 부고환 백색지방조직의 형태학적 분석 결과에 의하면 고지 방식이군은 정상식이군에 비해 지방세포의 크기가 큰 것으 로 관찰되었으나 자소엽 주정 추출물 섭취군에서 관찰된 지 방세포 크기는 정상식이군 보다는 크지만 고지방식이군에 비해 감소한 것으로 관찰되었다(Fig. 1C). 지방세포 크기의 측정은 항비만 효능을 입증할 수 있는 효과적인 방법으로 알려져 있다(Park 등, 2005). 따라서 자소엽 주정 추출물 보충은 고지방식이 유도 비만에 의한 지방세포 비대 억제 효과를 가지는 것으로 나타났다. Fig. 1B는 시간대별 에너
Table 3. Effect of Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo ethanol extract (PFE) on plasma lipid and adipokine levels in C57BL/6J mice fed high-fat diet
Measurements Experimental groups
ND HFD PFE
Triglyceride (mmol/L) Total cholesterol (mmol/L) HDL-cholesterol (mmol/L)1) nonHDL-cholesterol (mmol/L)2)
1.09±0.06a 3.70±0.14a 0.77±0.04a 2.93±0.13a
1.48±0.06b 5.84±0.17c 1.21±0.04b 4.63±0.14c
1.24±0.08a 4.98±0.22b 1.06±0.28ab 3.92±0.17b MCP-1 (pg/mL)
Resistin (ng/mL) Leptin (ng/mL) Adiponectin (ng/mL) L:A ratio3)
12.87±0.75a 4.14±0.97a 1.12±0.26a 5.87±0.14c 0.19±0.04a
23.08±2.62b 22.47±3.17c 9.59±1.03c 4.61±0.17a 2.10±0.26c
17.91±3.83ab 10.73±1.19b 4.84±0.73b 5.23±0.24b 0.96±0.16b
The data are presented as mean±SE. Means not sharing a common letter are significantly different among the groups at P<0.05.
ND, normal diet (AIN-93); HFD, high-fat diet (60% kcal fat); PFE, HFD+1% Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo ethanol extract.
1)HDL-cholesterol, high density lipoprotein-cholesterol.
2)nonHDL-cholesterol, non-high density lipoprotein-cholesterol＝(Total cholesterol)－(HDL-cholesterol).
3)L:A ratio, leptin : adiponectin ratio.
지 소비량 변화를 나타낸 그래프이다. 정상식이군과 고지방 식이군은 7시, 8시, 9시, 23시, 0시, 1시, 2시, 3시에 에너지 소비량의 유의적인 차이가 나타났다. 한편, 자소엽 주정 추 출물 섭취군에서는 동일한 시간대에 에너지 소비량이 고지 방식이 대조군보다 증가하는 경향을 나타냈다. Fig. 1D는 에너지 소비량 결과를 낮, 밤, 24시간으로 비교하여 나타낸 그래프이며 낮과 밤은 6시와 18시를 기준으로 하였다. 정상 식이군에 비해 고지방식이군에서 낮, 밤, 24시간 모두 에너 지 소비량이 유의적으로 낮게 나타났고 자소엽 주정 추출물 섭취에 의해 밤 시간대의 에너지 소비량이 고지방식이군에 비해 유의적으로 증가하였다. 또한, 24시간 측정 결과에서 도 고지방식이군에 비해 자소엽 주정 추출물 섭취군의 에너 지 소비량이 유의적으로 증가하는 결과를 보였다. 본 연구결 과 자소엽 주정 추출물 보충으로 인한 체중과 체지방의 중량 은 유의미한 변화를 보이지 않았지만 자소엽 주정 추출물은 에너지 소비량을 증가시키고, 지방세포 크기를 감소 시켜 고지방식이 유도 비만 마우스의 에너지 대사를 일부 개선시 키는 것으로 관찰되었다.
혈장 지질 농도 및 아디포카인 농도 개선 효과
자소엽 주정 추출물 보충이 혈장 지질 수준 및 아디포카인 농도에 미치는 영향은 Table 3과 같다. 혈장 중성지질 및 총 콜레스테롤 농도는 고지방식이군에서 정상식이군에 비 해 유의적으로 증가하였으며 이는 고지방식이 섭취로 인해 고지혈증이 유도되었다고 판단한다. 고지방식이에 의해 증 가한 중성지방, 총 콜레스테롤 및 nonHDL-콜레스테롤 농 도는 자소엽 주정 추출물 보충으로 인해 유의적으로 감소하 는 결과를 보였다. 선행 연구에 따르면 혈중 중성지방 농도 가 높아지고 HDL-콜레스테롤이 감소하는 경우, 비알코올 성 지방간의 발병 위험이 2배 이상 증가한다고 보고된 바 있다(Struben 등, 2000). 따라서 자소엽 주정 추출물 보충
은 혈장 지질 수준을 개선하여 이상지질혈증 및 지방간 등의 질환 예방에 효과적일 것으로 판단된다.
지방세포에서 발현되고 분비되는 아디포카인은 에너지 균형, 당 대사, 지방 대사 및 염증 등의 대사성 질환 발생에 관여하는 것으로 밝혀지면서 이들과 만성질환에 관한 많은 연구가 진행되고 있다(Tilg와 Moschen, 2006). MCP-1은 염증반응을 개시하는 중요한 인자로 본 실험에서 고지방식 이 섭취에 의해 증가된 혈장 MCP-1의 수준은 자소엽 주정 추출물 보충에 의해 감소하는 경향을 보였다. Leptin은 식이 섭취, 에너지 소비 및 신경 내분비 기능의 조절뿐만 아니라 대사 장애에 기여하는 전염증 상태의 중요한 매개체로 작용 한다(Perez-Perez 등, 2017). 또한 resistin은 인슐린 신호 경로를 조절하여 인슐린 저항성을 유도하고 비만, 제2형 당 뇨병과 관련되는 것으로 보고되었다(Sentinelli 등, 2002).
본 연구결과 자소엽 주정 추출물은 고지방식이에 의해 증가 된 leptin과 resistin 수준을 각각 49%, 52% 유의적으로 감 소시켰다. 한편, 고지방식이에 의해 분비가 저하된 아디포넥 틴의 농도는 자소엽 주정 추출물 보충으로 인해 유의적으로 증가하였으며, 인슐린 저항성 및 대사증후군의 지표로 사용 되고 있는 leptin : adiponectin ratio(L:A ratio)도 고지방식 이군에 비해 유의적으로 낮게 나타났다. 따라서 본 실험 결 과, 고지방식이 유도 비만에 의해 발생하는 아디포카인 조절 불균형은 자소엽 주정 추출물 보충에 의해 현저히 개선되는 것을 확인할 수 있었다.
공복 혈당 조절 효과
전체 실험 기간 12주 동안 4주 간격으로 공복 시 혈당을 측정한 결과, 정상식이군의 혈당은 일정 수준으로 유지되는 반면, 고지방식이군 및 자소엽 주정 추출물 섭취군의 혈당은 점차 증가하는 추세를 보였다(Fig. 2). 고지방식이군의 혈당 농도는 4주부터 정상식이군에 비해 유의적으로 높게 나타났
Fig. 2. Effect of Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo etha- nol extract (PFE) on fasting blood glucose concentration in C57BL/6J mice fed high-fat diet. The data are presented as mean
±SE. Means not sharing a common letter (a-c) are significantly different among the groups at P<0.05. ND, normal diet (AIN- 93); HFD, high-fat diet (60% kcal fat); PFE, HFD+1% Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo ethanol extract.
A B
Fig. 3. Effect of Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo ethanol extract (PFE) on liver weight and hepatic morphology in C57BL/6J mice fed high-fat diet. The data are presented as mean±SE. Means not sharing a common letter (a-c) above the bars are significantly different among the groups at P<0.05. ND, normal diet (AIN-93); HFD, high-fat diet (60% kcal fat); PFE, HFD＋1% Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo ethanol extract. (A) Liver weight (g/100 g BW). (B) Hematoxylin and eosin (H&E) and Masson’s trichrome (MT) stained transverse-section of liver. The result of MT staining indicates layers of fibrosis (blue) surrounding hepatic potal vein.
Original magnification ×200.
으며, 12주차에 자소엽 주정 추출물 섭취군의 공복 혈당은 고지방식이군에 비해 유의적으로 낮게 나타났다. 선행 연구 에 의하면 혈중 resistin 농도와 인슐린 저항성 사이의 유의 적인 상관관계가 존재한다(Silha 등, 2003). Kaplan(1998) 의 연구에서 비만의 경우 체내에서 leptin의 농도가 증가하 면 leptin의 시상하부 자극이 둔감해지며 인슐린 저항성이 유발된다고 보고하였다. 따라서 자소엽 주정 추출물 보충으 로 인한 혈당 감소, 인슐린 저항성과 관련이 있는 혈장 lep- tin, resistin 농도의 감소 결과를 함께 고려했을 때, 자소엽 주정 추출물은 인슐린 저항성 개선 효과가 있으며 이는 비만 에 의해 발병하는 제2형 당뇨병의 개선에도 도움이 될 것으 로 사료된다.
간조직 중량 변화
체중 100 g 당 간 무게의 비교 및 간조직의 형태학적 분석 결과는 Fig. 3과 같다. 고지방식이 섭취에 의해 증가한 간조 직 중량은 자소엽 주정 추출물 보충에 의해 유의적으로 감소 하였다(Fig. 3A). 간조직의 간문맥을 중심으로 고지방식이 군에서 가장 많은 지방구의 축적이 관찰되었고 자소엽 주정 추출물 보충에 의해 지방구의 축적이 억제되었다(Fig. 3B).
Feng 등(2011)의 연구에서 자소엽 주정 추출물을 투여한 군 에서 간조직 지질의 축적이 감소하였고 혈중 지질 농도를 조 절하여 심혈관 질환 예방을 입증함을 보고하였으며, 본 실험 결과는 이러한 선행 연구와 유사한 결과를 나타냈다. 간조직 의 섬유화에 미치는 영향을 알아보기 위해 실시한 Masson’s trichrome 염색 결과, 고지방식이에 의한 섬유화가 자소엽 주정 추출물 보충에 의해 억제된 것을 확인하였다(Fig. 3B).
따라서 자소엽 주정 추출물 섭취군의 간조직 중량 감소는 혈장 지질 수준 개선과 더불어 간조직 내 지방 축적 억제와 관련이 있고 이러한 결과는 고지방식이 섭취로 인한 간조직 의 섬유화를 억제하는 것과 관련성이 있는 것으로 사료 된다.
간조직 지질 함량 및 혈장 GOT, GPT
간조직 지질 수준을 측정한 결과는 Fig. 4A와 같다. 간은 중성지질을 포함한 콜레스테롤의 주된 생합성이 일어나는 곳으로 합성된 중성지질은 정상적으로 대사되지 않으면 간 에 축적되어 지방간을 유발한다(Schaefer, 1995). 또한, 콜 레스테롤은 유리 형태로 지단백과 결합하여 순환계로 분비 됨으로써 혈액 중 총 콜레스테롤의 농도를 조절하는 역할을 한다(Yao 등, 1985). 고지방식이에 의한 간조직 지질(유리 지방산, 콜레스테롤 및 중성지방)의 증가는 자소엽 주정 추 출물의 보충으로 인해 유의적으로 감소하였다.
A B
Fig. 5. Effect of Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo ethanol extract (PFE) on hepatic gene expressions involved in lipid metabolism in C57BL/6J mice fed high-fat diet. The data are presented as mean±SE. Means not sharing a common letter (a-c) above the bars are significantly different among the groups at P<0.05. ND, normal diet (AIN-93); HFD, high-fat diet (60% kcal fat); PFE, HFD＋1% Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo ethanol extract.
A
B
Fig. 4. Effect of Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo ethanol extract (PFE) on hepatic lipid profiles, and the plasma levels of glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) and glutamic pyruvic transaminase (GPT) in C57BL/6J mice fed high-fat diet. The data are presented as mean±SE. Means not sharing a common letter (a-c) above the bars are significantly different among the groups at P<0.05. ND, normal diet (AIN-93); HFD, high-fat diet (60% kcal fat); PFE, HFD+1% Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo ethanol extract.
간 독성 지표인 GOT와 GPT는 간세포에 존재하는 효소 로서 혈장에서의 높은 활성도는 간조직의 손상을 의미한다.
또한, 간염이나 고혈당 상태에서도 GOT와 GPT 효소의 활 성이 증가하며 간의 상대적 중량도 증가하는 것으로 보고되 었다(Reitman과 Frankel, 1957). 혈장 GOT 및 GPT 농도 는 고지방식이군이 정상식이군에 비해 유의적으로 증가하 였지만 자소엽 주정 추출물 보충으로 인해 현저하게 감소하 였다(Fig. 4B). 따라서 자소엽 주정 추출물 보충은 간조직 중량 감소 및 지방증 개선과 더불어 혈장 지질 수준도 개선 되어 자소엽 주정 추출물이 체내 지질 수준 감소에 효과적일 수 있다는 가능성을 제시하였다.
간조직 내 지질 대사 관련 유전자의 발현
본 실험에서는 간조직 내 지방산 합성 및 산화와 관련된 유전자 발현변화를 측정함으로써 자소엽 주정 추출물의 비 알코올성 지방간 개선 효과의 일부를 규명하고자 하였다. 지 방 산화와 관련된 유전자의 주된 조절 인자인 Ppar은 어느 조직에서 발현되느냐에 따라 α, γ, δ 세 가지로 분류되며, 그중 Pparα은 주로 간, 신장, 심장에 주로 분포하고 미토콘 드리아 내의 지방산 β-oxidation에 관여하는 유전자의 발 현을 조절하여 세포 내 지방 축적을 억제한다(Schoonjans 등, 1996). Pparγ는 지방세포 분화 및 기능을 조절하는 주요 인자 중 하나로 중성지방 축적에 관여하는 유전자의 발현을
조절한다(Tontonoz 등, 1994). Sirt1에 의한 AMPK의 활성 화는 포도당으로 인한 지질 합성에 관여하는 유전자(Fas, Acc1, Scd1)의 발현을 조절하여 지질 축적을 억제한다(Hou 등, 2008; Soliman, 2011). 실험 결과, 자소엽 주정 추출물 보충은 간조직 지질 합성에 관여하는 유전자인 Acc1 및 Cidea의 발현을 고지방식이군에 비해 유의적으로 감소시켰 고, Pparγ 및 Acat의 mRNA 발현은 감소하는 경향을 나타 냈다(Fig. 5A). 지방산 산화에 관여하는 Pgc1α와 Pparα 유 전자의 발현은 고지방식이군에 비해 자소엽 주정 추출물 섭 취군에서 유의적으로 증가하였다(Fig. 5B). 자소엽 주정 추 출물 섭취군의 Sirt1 mRNA 발현은 고지방식이군의 mRNA 발현 수준보다 증가하는 경향을 보였다. 이러한 간조직 지질 대사와 관련된 유전자의 발현 변화 결과는 간조직 지질 함량 결과와 일치하는 것으로 나타났다. 따라서 자소엽 주정 추출 물의 보충은 고지방식이에 의한 간조직의 지질 합성 억제 및 지방산 산화를 촉진함으로써 비알코올성 지방간 및 대사 증후군 증상의 완화에 효과가 있는 것으로 사료된다.
요 약
비알코올성 지방간은 비만 및 인슐린 저항성을 바탕으로 하 는 대사증후군의 원인 질병으로 최근 그 발병률이 증가하고 있다. 본 연구진은 고지방식이에 의해 유도되는 비만 마우스 동물모델에 자소엽 주정 추출물을 식이에 보충하여 급여한 후 비만으로 인해 나타나는 표현형 분석과 유전자 발현 분석 을 통해 대사증후군 및 비알코올성 지방간 억제 효과를 검토 하였다. 자소엽 주정 추출물 보충으로 인한 체중 및 식이 섭취량은 차이가 없었으나 에너지 소비량 증가와 부고환 백 색지방조직의 지방세포 크기 감소에 기여하였다. 또한, 자소 엽 주정 추출물 섭취군의 경우 고지방식이군에 비해 혈장 총 콜레스테롤, 중성지방 및 아디포카인 농도가 유의적으로 감소하여 혈액의 지질 수준 및 아디포카인 불균형이 개선되 었고 공복혈당 수준도 유의적으로 감소하였다. 고지방식이 섭취에 의해 증가한 간조직 중량 및 지질 축적은 자소엽 주 정 추출물 보충으로 인해 현저하게 감소하였다. 마찬가지로, 간 독성 평가 지표인 혈장 GOT와 GPT 수준도 자소엽 주정 추출물 섭취군에서 유의적으로 감소하였다. 간 조직 내 지질 합성에 관련된 유전자인 Acc1 및 Cidea의 발현 수준은 자소 엽 주정 추출물 보충에 의해 고지방식이군 보다 유의적으로 감소하였고, 지방산 산화 관련 유전자인 Pgc1α 및 Pparα의 발현은 자소엽 주정 추출물 섭취군에서 유의하게 증가하였 다. 본 실험 결과를 종합하여 볼 때 자소엽 주정 추출물 첨가 는 에너지 소비량 증가 및 간조직의 지질대사 조절 유전자발 현 변화를 통한 혈중 지질 수준과 간조직 지질 수준을 개선 시켰으며 이러한 결과는 고지방식이로 유도된 비만 및 비알 코올성 지방간 개선에 긍정적으로 기여할 수 있을 것으로 판단된다.
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