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©The Korean Society of Food Science and Technology
반응표면분석법을 이용한 Aureobasidium pullulans MR의 풀루란 생산을 위한 배양 조건 최적화
조혜미
1· 김예진
1· 유상호
2· 김창무
3· 김계원
4· 박천석
1,*
1경희대학교 식품생명공학과, 2세종대학교 식품공학과,
3국립생물자원관 미생물자원과, 4국립한경대학교 산학협력단
Optimization of cultivation conditions for pullulan production from Aureobasidium pullulans MR by response surface methodology
Hye-Mi Jo1, Ye-Jin Kim1, Sang-Ho Yoo2, Chang-Mu Kim3, KyeWon Kim4, and Cheon-Seok Park1,*
1Department of Food Science and Biotechnology, Kyung Hee University
2Department of Food Science & Biotechnology, Carbohydrate Bioproduct Research Center, Sejong University
3National Institute of Biological Resources
4Academic Industry Cooperation, Hankyong National University
Abstract Aureobasidium pullulans, a black yeast, produces pullulan, a linear α-glucan composed of maltotriose repeating units linked by α(1→6)-glycosidic linkages. Pullulan can be widely used in food, cosmetic, and biotechnology industries.
In this study, we isolated eight strains of A. pullulans from Forsythia koreana, Magnolia kobus DC., Spiraea prunifolia var. simpliciflora, Cornus officinalis, Cerasus, and Hippophae rhamnoides. Among them, A. pullulans MR was selected as the best pullulan producer. The effects of a carbon source, a nitrogen source, and pH on pullulan production were examined. The optimal cultivation conditions for pullulan production by A. pullulans MR were determined by response surface methodology as 15% sucrose, 0.4% soy peptone, and an initial pH of 7 at 26oC. Under these conditions, the predicted pullulan production was 47.6 g/L, which was very close to the experimental data (48.9 g/L).
Keywords: Aureobasidium pullulans, pullulan, optimization, response surface methodology, yeast
서 론
Aureobasidium pullulans는 일반적인 효모의 형태와 비슷한 외 형을 보여주는 곰팡이로 멜라닌(melanin)을 생성하여 검은색으로 세포의 색이 보여지기 때문에 ‘black yeast’로 알려져 있는 곰팡 이다(Chi 등, 2009). 토양, 물, 공기, 돌의 표면 그리고 동·식물체 의 조직 등 다양한 환경에 존재하며 식물체에서는 특별한 질병 을 유발하지 않으면서 존재하는 것으로 알려져 있다(Cheng 등, 2011b). 특히 A. pullulans는 산업에서 이용 가능한 amylase, cellulase, lipase, protease, xylanase 및 mannanase와 같은 다양한 효소와 더 불어 알파 글루칸(α-glucan)의 일종인 풀루란(pullulan)을 세포 외 로 분비하여 생산하는 것으로 잘 알려져 있다. 최근에는 식물 중 에서도 특히 과일, 곡물, 야채류에서 원하지 않는 미생물의 성장 을 억제하는 바이오컨트롤(biocontrol)의 목적으로도 사용이 보고 되었다(Mounir 등, 2007). 따라서 풀루란을 생산하는 균주인 A.
pullulans는 산업적으로 매우 중요한 균주라고 할 수 있다.
풀루란은 Bauer(1938)에 의해 최초로 관찰되었으며 maltotriose 를 기본단위로 하여 α(1→6)-glycosidic 결합으로 이루어진 수용성 다당류(polysaccharide)이다(Cheng 등, 2011b; Singh 등, 2008). 풀 루란의 α(1→4)와 α(1→6)-glycosidic 결합으로 인해 구조적 유연 성과 뛰어난 수용성을 가지며 수용액에서 안정적이고 다른 다당 류와 비교하였을 때 상대적으로 점도가 낮다(Singh 등, 2008). 또 한 인체에 독성이 없고 섭취 시 분해가 잘 일어나지 않아 저칼 로리 식품첨가제로 사용될 뿐만 아니라, 식품의 접착제, 안정제, 필름 포장제, 제약, 코스메틱, 섬유, 제지, 효소 고정화를 위한 담 체 역할 등 여러가지 산업에 있어서 광범위하게 그 활용성이 알 려져 있다(Singh 등, 2008; Yang 등, 2000). 따라서 양질의 풀루 란을 대량생산할 수 있는 용이한 미생물의 스크리닝과 이를 이 용한 효율적인 풀루란의 생산 방법을 연구하는 것이 매우 중요하다.
지금까지 풀루란은 A. pullulans 외에 Rhodotorula bacarum (Chi 등, 2003), Rhodosporidium bobjevae (Seveiri 등, 2020), R.
paludigenum (Singh 등, 2018b), Tremella mesenterica (Fraser 등, 1971), Cyttaria harioti (Waksman 등, 1977), C. darwinii (Oliva 등, 1986), Teloschistes flavicans (Reis 등, 2002)에 의한 생산도 보고 되었으나 A. pullulans의 뛰어난 풀루란 생산으로 인해 A.
pullulans를 통한 풀루란 생산과 그 산업적 활용에 대한 연구가 집중되어 있다(Grumezescu 등, 2017).
기존 연구로는 A. pullulans에 의한 발효 시간이나 온도(Singh 등, 2018a), 통기와 교반속도(Yang 등, 2000), 탄소원(Catley, 1971;
Son 등, 2006)과 질소원(Na 등, 1996)의 종류와 농도, pH (Shin
*Corresponding author: Cheon-Seok Park, Department of Food Sci- ence and Biotechnology, Kyung Hee University, Yongin 17104, Korea
Tel: +82-31-201-2631 Fax: +82-31-201-8116 E-mail: [email protected]
Received December 21, 2020; revised February 8, 2021;
accepted February 8, 2021
등, 1991), 압력(Dufresne 등, 1990) 등의 배양 조건이 풀루란의 생산량과 균체의 성장에 의미 있는 영향을 미친다는 보고가 있 다. 특히 배양액의 pH는 균체의 형태에 영향을 주며 pH 2.0~2.5 에서는 균사체(mycelia) 형태를, pH 6.0~8.0에서는 효모와 같은 모 양의 형태를 우세하게 나타내는 것으로 알려져 있다. 이러한 A.
pullulans의 균체 형태와 풀루란 생산의 상관관계에 대한 연구는 많이 보고되었지만 여전히 논의 중이며, 배양액의 pH가 A.
pullulans의 대사 활동에 대체적으로 영향을 끼치는 것은 선행 연 구들을 통해서 확인되었다(Grumezescu 등, 2017; Ronen 등, 2002;
Shin 등, 1991).
본 연구에서는 국내에서 자생하는 식물을 분리원으로 하여 풀 루란을 생산하는 미생물을 스크리닝하였고 그 중 가장 많은 풀 루란을 생산하는 균주로 A. pullulans MR을 선발하였다. 그 후 선발된 A. pullulans MR을 통한 풀루란 생산 시 필요되는 탄소 원, 질소원, pH, 온도 등과 같은 환경적인 요인에 의한 영향을 연구하였다. 더불어 일반적인 발효에 있어서 목적 물질을 생산할 때 종속변수의 최적화를 위한 실험계획법 중, 하나의 종속변수에 다수의 독립변수들의 영향이 작용할 때 발생하는 중요 인자와 종 속변수의 최대/최소화를 위한 독립변수의 최적조건을 알 수 있는 실험 방법(Kim 등, 2016; Ryu 등, 2019)인 response surface methodology (RSM)을 사용하여 배지 내 탄소원과 질소원의 농도 와 초기 pH가 A. pullulans MR의 풀루란 생산 수율에 미치는 영 향에 대하여 심도있게 연구하였다. 본 연구를 통하여 최적 조건 에서의 풀루란 생산이 가능할 것으로 사료되며 추후 식품소재로 서 이용이 확대되고 있는 풀루란 소재의 효과적인 생산이 이루 어질 것으로 판단한다.
재료 및 방법
실험용 배지
본 실험에서 풀루란을 생산하는 미생물을 스크리닝하기 위하 여 사용한 배지는 AYS배지이다. 이 배지의 성분은 sucrose 5%, K2HPO4 0.5%, NaCl 0.1%, MgSO4·7H2O 0.02%, (NH4)2SO4 0.06%, yeast extract 0.1% (w/v)로 구성이 되어 있다(Shin 등, 1989). 또한 일반적인 균주의 배양은 YPD 배지(yeast extract 0.1%, peptone 0.2%, dextrose 0.2%, agar 1.5%)를 사용하였다.
실험용 시약
본 실험에 사용한 탄소원 기질인 sucrose는 Duchefa (Seoul, Korea), D-(−)-fructose, D(+)-galactose, lactose monohydrate는 Daejung (Siheung, Korea), glucose는 Duksan (Ansan, Korea), D(+)-maltose는 Yakuri Pure Chemicals Co. (Kyoto, Japan)에서 구매하여 사용하였다. 질소원 기질인 ammonium sulfate는 Daejung (Siheung, Korea), sodium nitrate는 Hanawa Pure Chemical Ind.
Ltd. (Osaka, Japan)에서 구매하고 yeast extract와 soy peptone는 BD Difco (Franklin Lakes, NJ, USA), beef extract는 MB cell (Seoul, Korea)에서 구매하여 사용하였다. 풀루란 생성 확인을 위 해 제작한 AYS배지(Shin 등, 1989)의 조성으로 사용된 magnesium sulfate heptahydrate는 Daejung (Siheung, Korea), sodium chloride 는 Samchun Chemicals (Pyeongtaek, Korea), potassium phosphate 는 Bioneer Corp. (Deajeon, Korea)에서 구매하였으며 풀루란의 침 전을 위해 사용된 ethyl alcohol anhydrous, 99.9%는 Daejung (Siheung, Korea)에서 구매하였다.
풀루란 생성 균주의 분리
시료는 국내 전라북도 전주시 덕진구와 완주군, 전라북도 정읍 시 산외면, 대전광역시 유성구, 경상북도 경주시에서 2019년에 채 취한 개나리(Forsythia koreana), 목련(Magnolia kobus DC.), 조팝 나무(Spiraea prunifolia var. simpliciflora), 산수유(Cornus officinalis), 벚나무(Cerasus)와 2017년에 강원도 화천에서 채취한 비타민나무 (Hippophae rhamnoides)의 꽃과 열매를 사용하였다. NaCl (0.8%) 용액 30 mL를 준비된 1 M citric acid를 이용하여 pH 3.3~3.4 정 도로 적정한 뒤 살균하여 준비된 시료 10 g과 함께 으깨어준 후, 으깬 용액을 샘플로 하여 101~105배 연속 희석한 후 YPD agar (BD Difco, Franklin Lakes, NJ, USA) 배지에 200 μL씩 도말하여 배양하였다. 30oC에서 3일간 배양 후 생성되는 단일 colony는 풀 루란 생성 배지로 알려진 AYS배지를 사용하여 28oC에서 3일간 배양하여 풀루란 생성 여부를 확인하였다. 풀루란 생성이 확인된 균주는 현미경으로 그 형태를 관찰하고 아래의 방법으로 ITS1- 5.8S rRNA-ITS2 영역의 염기서열을 확인하여 동정을 하였다 (Kurtzman 등, 2003).
Genomic DNA 추출
분리된 균주를 10 mL YPD broth에 접종한 뒤 28oC, 180 rpm 에서 2일간 배양시킨 후 4,000×g에서 5분간 원심분리하여 배양 액으로부터 균체를 분리하였다. 분리된 효모균 200 μL에 lysis buffer (200 mM Tris-HCl pH 8.5, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) 500 μL와 phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1 (v/v), Bioneer Corp., Deajeon, Korea) solution 500 μL을 첨가 한 후 10,000×g 에서 30분간 원심분리하여 상층액 600 μL을 얻었다. 이 후 상층 액에 3 M sodium acetate 60 μL와 isopropanol 360 μL을 넣고 10,000×g에서 5분간 원심분리하여 침전된 DNA를 얻었다. 침전 된 DNA에 70% ethanol 500 μL를 넣어 세척해준 뒤 10,000×g에 서 1분간 원심분리 후 45oC에서 30분간 ethanol을 제거하였다. 이 후 DNA에 TE-RNase (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 20 μL RNase) 35 μL를 첨가하여 37oC에서 15분간 반응하 여 RNA를 제거한 뒤 genomic DNA를 얻었다. 이렇게 확보된 genomic DNA는 −20oC에 냉동 보관하여 사용하였다.
균주 동정
확보한 균주의 genomic DNA는 종 단위의 동정을 위해 5.8S rRNA를 포함한 ITS1-5.8S rRNA-ITS2 영역을 증폭하였다. DNA 증폭을 위해 yeast universal primer인 ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')와 ITS4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3') primer을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 Thermal cycler (ASTEC PC-320, ASTEC Inc, Fukuoka, Japan) 을 사용하여 95oC에서 10분간 pre-denaturation과정 후, 95oC에서 30초간 denaturation, 55oC에서 1분간 annealing, 72oC에서 30초간 extension의 과정을 30회 반복한 뒤 72oC에서 10분간 post- extension을 수행하였다. 이후 생성된 PCR 산물은 0.8% agarose gel 전기영동 후 정제하여 Macrogen Co. (Seoul, Korea)에 의뢰하 여 염기서열을 분석하였으며 분석된 염기서열은 National Center Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)을 이용하여 동정하였다.
풀루란 생산을 위한 배양조건
A. pullulans MR은 YPD agar 배지에 배양된 채로 4oC에 보관
하였으며 전 배양을 위해 YPD broth 10 mL에 한 백금이 접종하 여 28oC, 200 rpm에서 3일간 배양하였다. 본 배양을 위해 O.D.
(optical density)를 측정하여 O.D.값이 2.5일때 배양액 500 μL를 채취하여 AYS 배지 50 mL에 접종한 뒤 28oC, 200 rpm에서 3일 간 배양하였다. 풀루란의 생산에 영향을 미치는 효과적인 탄소원 과 질소원을 선정하기 위하여 기존 AYS 배지의 탄소원인 sucrose 를 glucose, fructose, galactose, maltose, lactose등으로 대체하여 비교 확인하였으며 질소원의 경우는 무기질소원으로 ammonium sulfate 대신에 sodium nitrate를 유기질소원으로 yeast extract 대신 에 beef extract, soy peptone 등으로 변경하여 실험을 진행하였다.
또한 RSM을 통한 배양 최적 실험에서 배지의 초기 pH 변화에 따른 결과를 알아보기 위하여 배지 초기 pH를 1 M HCl 과 1 M NaOH을 사용하여 적정 후 실험하였다.
배양액의 점도 측정
분리된 A. pullulans 균주들의 다당류 생산을 확인하기 위하여 AYS배지에 28oC, 200 rpm에서 배양 후 각각 3일과 5일 배양액의 점도를 측정하였다. 점도는 회전형 점도계(DV-II+ Pro, Brookfield Engineering Inc., Middleborough, MA, USA)와 RV-1 spindle (Brookfield Engineering Inc.)을 사용하였으며 spindle의 회전 속도 는 200 rpm으로 하여 측정하였다. 측정한 점도의 단위는 cp (centipoise)로 나타내었다.
풀루란의 분리 및 정량
풀루란의 분리 및 정량은 기존에 Singh 등(2009a)에서 보고된 방법을 참고하여 수행하였다. 배양액 5 mL를 10,000×g에서 5분 간 원심분리하여 균체를 제거하고, 풀루란 침전을 위해 상층액 3 배량의 −70oC에서 보관한 99% ethanol을 처리하여 −70oC에서 30 분간 침전하였다. 그 후 4,000×g에서 10분간 원심분리하여 풀루 란 pellet을 얻었으며, 4oC에서 보관한 80% ethanol을 상층액 2배 량만큼 넣어준 후 원심분리(4,000×g, 10 min)하는 과정을 2번 반 복하여 pellet을 세척하였다. 그 후 80oC의 dry oven에서 20시간 이상 두어 ethanol을 제거하여 건조된 풀루란의 무게를 측정하였다.
풀루란의 분자량 측정
시료의 절대 분자량 분포 분석을 위해서는 고속크기배제크로 마토그래피(high-performance size-exclusion chromatography, HPSEC) 시스템에 굴절률 검출기(refractive index detector, RI; RID-10A, Shimadzu, Kyoto, Japan)와 다각도 레이저선 산란 검출기(multiple laser light scattering detector, MALS; Dawn Heleos, Watt Technology Corporation, Santa Barbara, CA, USA)를 장착하여 사용했다. 분석용 컬럼으로는 Shodex OH pak SB-806 HQ와 SB- 804 HQ (8.0 mm ID 300 mm, Showa Denko, Tokyo, Japan)을 연결하여 컬럼 오븐의 온도를 55oC로 유지해서 사용했다. 분자량 과 크기 분포는 Astra software (Version 5.3.4.20 for Windows, Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA, USA)를 이용 해서 계산했다. Pullulan 표준품 시리즈 P-5, P-10, P-20, P-100, P-200, P-400, P-800 (Shodex Standard Pullulan Kit P-82, Showa Denko)을 각각 0.2%의 농도로 3차 증류수에 용해시켜 상 대 분자량 분석을 위한 표준곡선 작성에 사용하였다.
반응표면분석법을 이용한 실험설계
A. pullulans MR의 풀루란 생산에 대한 최적 조건을 알아보기 위해 JMP pro 13 software (SAS institute Inc., Seoul, Korea)의 Design of experiment (DOE) 방법 중 하나인 custom design을 이
용하여 실험을 설계하고 결과에 따른 반응 표면 모델을 분석하 였다. 풀루란의 생산(g/L)을 종속변수(Y)로 설정하고 예비실험을 통해 풀루란 생산에 영향을 주는 주요 요인인 sucrose (X1), soy peptone (X2), initial pH (X3)를 독립변수로 설정하였다. 각각 독 립변수의 범위는 2.5% ≤ X1≤ 20%, 0.01% ≤ X2≤ 0.4%, 2 ≤ X3≤ 10 로 설정하였으며 독립변수의 각 범위에 대하여 26군의 실험조건 을 설계하였다(Table 2).
결과 및 고찰
균주 선발
실험을 위해 채취한 꽃과 열매 시료에서 다양한 종류의 효모를 분리할 수 있었다. 분리된 효모들은 각각의 ITS1-5.8S rRNA-ITS2 영역을 증폭하여 얻어진 PCR 산물의 염기서열을 BLAST sequence analysis tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 이용하여 분석 후 동정하였다. 특히 Filobasidium magnum, Cryptococcus tephrensis, C. aureus, Pseudomicrostroma glucosiphilum, Papiliotrema flavescens 와 같은 효모를 분리하였으며 분리된 균주 중 풀루란을 생성하는 균주로는 A. pullulans가 유일하게 발견되었다. 최종적으로 8개의 A. pulllulans 균주를 분리하였으며, 분리된 균주 중 풀루란 생산 능력이 가장 뛰어난 균주를 선발하기 위해 AYS배지에 접종하여 28oC, 200 rpm에서 각각 3일과 5일 배양 후 배양액의 점도를 측정 하여 생산된 다당체의 양을 간접적으로 확인하였다(Table 1). 더불 어 생산된 다당체를 배양액으로부터 분리하여 농축하고 α-glucosidic 결합을 잘라주는 pullulanase로 분해하여 maltotriose가 생성됨을 확 인하였다. 이는 분리된 균주로부터 생산되는 다당체가 풀루란임을 확인한 것이다. 배양액의 점도와 분리, 정제 후 농축한 풀루란의 생산량은 Table 1과 Fig. 1에 정리하였다.
일반적으로 10 g/L 이하의 풀루란을 생산하는 반면에 A.
pullulans CB와 A. pullulans MR만이 10 g/L 이상의 풀루란을 생 산하는 것으로 확인이 되었다. 특히 A. pullulans MR의 경우 3일 과 5일 배양 후의 풀루란 생산량은 각각 20.4, 24.1 g/L로 8개의 A. pullulans 균주들 가운데 가장 많은 풀루란 생성능을 일관성 있게 보여주었다. 따라서 풀루란 생산 최적화 실험을 위한 균주 로 A. pullulans MR을 선발하여 추후 실험을 진행하였다.
배양 시간에 따른 풀루란 생산량 비교
A. pullulans MR의 풀루란 생산에 있어 최적 배양 시간을 알 아보기 위해 AYS배지에서 배양 후 28oC, 200 rpm에서 24시간 간 격으로 8일 동안 배양 후 생성되는 풀루란을 비교하였다(Fig. 2).
Table 1. Viscosity of culture media grown with isolated A.
pullulans strains Strain of A. Pullulans
Viscosity (cp) of culture medium
3 days 5 days
CB 2,438±7.6 2,488±30.6
MR 2,460±5.0 2,532±29.3
SSU 2,008±14.4 2,093±2.9
JP 1,915±13.2 1,953±5.8
GJGNR 1,801±2.8 2,159±15.3 DJSSU 1,878±7.6 2,082±11.6
GNR 1,953±5.7 1,955±13.3
HGU 1,923±11.5 1,945±5.0
그 결과 1일부터 5일까지 풀루란의 생산량이 계속해서 증가하여 5일에는 풀루란 생산량이 최대인 23.4±0.28 g/L에 도달하였다. 균 주의 성장을 건조균체량으로 측정하여 살펴본 결과 건조된 균체 량 역시 5일차까지 6.0±0.57 g/L로 점차 증가하는 모습을 보이다 가 그 이후로 균체량이 더 증가하지 않는 양상을 띄었다. 이는 A. pullulans MR이 배양 5일차에 접어들면서 균체가 성장을 멈추 는 정지기에 도달하게 되고, 풀루란의 생산량 역시 균체의 성장 과 함께 증가하는 일차대사산물의 특징적인 형태를 보여주면서 증가하다가 정지기에 접어들면서 변화가 거의 없는 정상상태로 유지되는 것으로 관찰되었다. Son 등(2006)의 A. pullulans HP- 2001를 이용한 풀루란의 생산 실험에서 균주의 성장이 40시간 후 멈추고 정지기에 들어가지만 풀루란의 생산은 72시간까지 지속
적으로 증가한다는 실험과는 약간 상이한 결과가 나타났다. 하지 만 이는 플라스크 배양과 회분식 발효조에서의 조건 차이에 의 한 결과에서 기인한 것으로 보여지며 특히 A. pullulans의 배양 형태와 풀루란의 생산이 밀접한 관계가 있다는 보고들이 있는 바 발효 조건에 따른 균주의 형태에 대한 연구가 추후 필요할 것으 로 생각된다(Son 등, 2006).
생산된 풀루란의 평균분자량은 고속크기배제크로마토그래피 시 스템을 이용하여 측정하였다. 결과적으로 약 1.13×106으로 측정 이 되었다 (data not shown). 이는 A. pullulans가 생산하는 풀루 란의 평균 분자량이 배양 조건과 균주에 따라 1.5×104에서 1.0×107 의 값을 갖는 풀루란을 생산한다는 선행연구와 일치하는 것을 알 수 있다(Kim 등, 2000).
Fig. 1. Pullulan production of 8 strains of Aureobasidium pullulans.
Fig. 2. Pullulan and cell production of Aureobasidium pullulans MR by time.
배양 온도에 따른 풀루란 생산량 비교
선행 연구들을 통하여 A. pullulans의 풀루란 생산을 위한 최적 온도가 균주에 따라 26oC부터 30oC에 걸쳐 다양하게 나타난 것 을 알 수 있다(Cheng 등, 2011a; Finkelman과 Vardanis,, 1982;
Gibson 등, 2002; Jiang, 2010). 따라서 A. pullulans MR의 풀루란 생산에 있어서 최적 배양 온도를 알아보기 위해 AYS배지에 접 종 후 배양온도조건을 26, 28, 30oC로 다르게 설정하여 5일간 배 양한 뒤 각 온도별 풀루란의 생산량을 비교하였다(Fig. 3). A.
pullulans MR의 경우 26oC에서 배양하였을 때 27.6±0.57 g/L로 가 장 높은 풀루란 생산량을 보였으며 28oC일때 25.1±0.99 g/L, 30oC 일때 생산량이 급격하게 줄어서 10.1±0.99 g/L의 풀루란이 생산되 는 것을 알 수 있었다. 반면에 A. pullulans MR의 건조된 균체 생성량은 26oC일 때 4.5±0.42 g/L, 28oC에서 5.6±1.13 g/L, 30oC 일 때 5.2±0.28 g/L로 관찰되었다. 낮은 온도인 26oC에서 균체의 양이 20% 정도 적게 생성되나 풀루란의 생산은 오히려 9% 이 상 증가하는 결과가 매우 흥미롭게 보였다. 하지만 오히려 30oC 에서는 균체의 양이 줄어들었음에도 불구하고 급격하게 풀루란 의 생산이 낮아짐을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 동일한 A.
pullulans 균주일지라도 풀루란 생산과 균체의 성장에 있어 각각 의 최적 온도가 같지 않다는 McNeil 등(1990)의 연구결과와 일 치하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 A. pullulans MR의 풀루 란 생산을 위한 최적 배양 온도를 26oC로 정하여 이후 실험을 수행하였다.
예비실험을 통한 AYS배지의 최적 탄소원, 질소원 선정 RSM을 이용한 배양 조건 최적화 실험을 하기에 앞서 기존의 AYS배지를 기본 배지로 하여 A. pullulans MR의 풀루란 생산을 위한 탄소원과 혼합질소원의 종류에 따른 영향을 알아보기 위해 예비 실험을 진행하였다. 풀루란 생산을 위한 배양 배지의 탄소 원으로는 sucrose, glucose, maltose, fructose, mannose, galactose, xylose, soluble starch 등의 사용이 보고된 바 있다(Sheng 등, 2016; Zajic과 LeDuy, 1977). Duan 등(2008)의 경우 탄소원으로
sucrose, fructose, maltose 보다 glucose를 사용하였을 경우 풀루란 의 생산량이 가장 높았으며 maltose와는 2배 이상의 풀루란 생산 량 차이를 보였다고 보고하였다. 또한 Yim 등(1984)의 경우 단당 류와 이당류뿐만 아니라 soluble starch에서 corn starch나 potato starch, tapioca starch보다도 현저하게 높은 풀루란이 생산되는 것 을 보고한 바 있다. 하지만 A. pullulans에 의한 풀루란 생산을 비 교한 기존 연구들 중 상당수가 풀루란 생산에 있어 가장 뛰어난 탄소원으로 sucrose를 지목하였다(Ma 등, 2014; Prasongsuk 등, 2007; Sheng 등, 2016).
본 실험에서는 sucrose 외에 단당류와 이당류인 glucose, fructose, galactose, maltose, lactose를 기질로 사용하였으며, 혼합 질소원의 경우 무기질소원인 ammonium sulfate, sodium nitrate와 유기질소원인 yeast extract, beef extract, soy peptone을 조합하여 26oC에서 5일간 배양 후 최적 탄소원과 질소원 조합을 선정하였 다. 먼저 탄소원의 경우 기존 AYS배지의 기본 탄소원인 sucrose 을 사용하였을 때 23.0±0.23 g/L로 6개의 기질 중 가장 풀루란 생성량이 높았으며 maltose를 첨가한 경우 역시 21.6±0.57 g/L로 다량의 풀루란이 생성되는 것을 알 수 있었다. 그러나 단당류인 glucose, fructose, galactose를 사용하였을 때에는 현저히 낮은 생 성량을 보여주었다(Fig. 4). 그리고 질소원의 경우 ammonium sulfate와 soy peptone의 조합이 18.4±0.28 g/L로 sodium nitrate와 soy peptone의 조합보다 0.4 g/L 더 근소하게 많은 풀루란이 생성 되며, 유기질소원으로 soy peptone을 사용할 경우 무기질소원의 종류에 관계없이 풀루란의 생산량이 가장 높은 것을 확인하였다 (Fig. 5). 따라서 AYS배지의 최적 탄소원으로 sucrose, 혼합질소원 으로 ammonium sulfate와 soy peptone의 조합을 선정하였다. 또 한 예비 실험을 통해 선정된 배지 내 탄소원과 질소원의 농도에 따른 풀루란을 알아보기 위해 RSM의 독립변수로 sucrose와 soy peptone를 사용하였다.
반응표면분석법을 이용한 풀루란 생산 조건 최적화
앞선 결과들을 토대로 A. pullulans MR의 풀루란 생산을 위한 Fig. 3. Pullulan and cell production of Aureobasidium pullulans MR by temperature.
배양 조건 최적화를 위하여 RSM을 수행하였다. JMP pro 13 software의 Custom design을 통한 실험 설계와 26개의 각 실험군 에 따른 실험결과는 Table 2에 나타내었으며 회귀분석을 통한 실 험 모델의 2차 회귀식은 다음과 같이 분석되었다.
Y = 1.87X1+ 40.62X2+ 20.50X3− 0.13X1X2+ 0.09X1X3 + 0.40X2X3− 0.08X12− 47.63X22− 1.58X32− 55.93
Table 2의 결과를 토대로 나타난 분산분석표(ANOVA, Analysis of variance)와 실험에 중요한 영향을 주는 실험인자를 알아보는 effect test의 통계값은 각각 Table 3과 Table 4에 나타내었다. 실 험 모델의 R-square (R2, 결정계수)는 1에 가까울수록 실험 모델
의 data를 신뢰할 수 있으며 최소 0.75 이상의 값을 가져야 하는 데 본 실험 모델의 R-square 값은 0.77로 분석되었다. 그리고 p- value (probability, 유의확률)의 경우 그 값이 0.05보다 작을 경우 실험 모델이 통계적으로 유의성(significant)을 가진다고 볼 수 있 으며 0.01보다 작을 경우 통계적으로 매우 유의(high significant) 하다고 볼 수 있는데 실험 모델의 p-value는 0.0012로 통계적으 로 매우 유의하다는 것을 알 수 있다. 또한 반응 모델의 적합성 검정(Lack of fit) 테스트 역시 p-value가 0.05보다 클 경우 유의 성이 없는, 즉 모델의 적합성에 결여가 없음을 나타내는데 p-value 가 0.5464로 본 모델의 적합성에 결여되는 부분이 없다는 것으 로 볼 수 있다.
Fig. 4. Pullulan production of Aureobasidium pullulans MR by carbon sources in media.
Fig. 5. Pullulan production of Aureobasidium pullulans MR by nitrogen sources in media.
Table 4의 effect test 역시 source의 p-value가 0.05 이하의 값을 갖는 인자일 경우 의미 있는 영향력을 가지며 p-value가 0.1보다
높을 경우 의미 있는 영향을 미치지 않는다고 볼 수 있는데 initial pH의 경우 0.0001의 p-value 값을 가지며 initial pH*initial pH의 경우도 0.0002로 풀루란의 생산 변화에 있어 배지의 초기 pH가 가장 큰 영향력을 미치는 것을 알 수 있다.
얻어진 데이터를 토대로 세가지 변수의 상호작용을 통한 3D 반응표면도와 반응등고선은 Fig. 6에 나타내었다. 최종적으로 maximizing desirability를 통해 풀루란 생산의 최적점을 찾았으며, 최대의 풀루란을 생산하기 위한 세가지 종속 변수의 최적 조건 은 sucrose 15%, soy peptone 0.4%, initial pH 7로 분석되었다.
위의 조건에서 A. pullulans MR의 풀루란 최대 생산 예측 값은 47.6 g/L였으며 확인 실험을 통해 얻은 풀루란 값은 48.9±3.4 g/
L로 예측된 풀루란 생산량과 매우 근접한 값을 얻을 수 있었다.
이처럼 RSM 분석 방법을 효과적으로 활용하여 A. pullulans MR 균주에서의 풀루란 생산 조건을 최적화 할 수 있었고, 예측 된 값과 매우 유사한 값을 실험을 통하여 얻어낼 수 있었으며 이 를 풀루란 생산을 위한 최적화 공정에 이용할 수 있을 것으로 판 단하였다.
요 약
본 연구에서는 A. pullulans MR의 풀루란 생산에 있어 배양 조 건에 따른 변화를 살펴보았다. 먼저 시간과 온도에 따른 건조된 균체량과 풀루란 생산량의 변화를 비교하였으며, 기존의 AYS배 지내 탄소원과 혼합질소원 변화에 따른 풀루란 생산량을 비교하 였다. 그 결과 sucrose와 ammonium sulfate, soy peptone을 본 실 험의 최적 탄소원과 혼합질소원으로 결정하였으며, 그 후 반응표 면분석법을 통해 탄소원인 sucrose와 질소원인 soy pepetone의 최 적 농도와 최적 초기 pH를 알 수 있었다. 분산분석 결과를 토대 로 비교하였을 때 A. pullulans MR의 풀루란 생산에 있어 세가 Table 2. Experimental design and result
Run numbers
X1 X2 X3 Y
Sucrose (%)
Soy peptone
(%) Initial pH Pullulan (g/L)
1 15 0.01 7 37
2 2.5 0.2 4 5.8
3 7.5 0.2 7 29.4
4 15 0.4 8 53.4
5 12.5 0.4 4 16.9
6 2.5 0.01 9 10.6
7 2.5 0.4 9 19
8 12.5 0.2 9 44.4
9 15 0.2 3 3.8
10 12.5 0.05 2 0.6
11 5 0.01 3 1.6
12 7.5 0.2 7 31.2
13 5 0.4 2 0.8
14 10 0.05 10 9.6
15 15 0.2 9 30.1
16 10 0.4 10 10.9
17 20 0.4 10 16.6
18 15 0.2 9 23.7
19 15 0.2 8 36.7
20 10 0.2 7 32.2
21 20 0.1 8 31.2
22 10 0.01 8 21.6
23 15 0.01 7 17.4
24 20 0.4 7 38.4
25 20 0.01 10 15.5
26 10 0.4 8 32.5
Table 3. Analysis of variance (ANOVA)
Sources SS1) DF2) MS3) F-value p-value Model 3,945.22 9 438.36 5.79 0.0012 Lack of Fit 997.06 13 76.70 1.07 0.5464
Pure error 214.18 3 71.39
1)SS: sum of squares
2)DF: degree of freedom
3)MS: mean squares
Table 4. Effect Tests
Sources Nparm DF1) SS2) F Ratio Prob>F
Sucrose 1 1 277.61 3.67 0.0735
Sucrose*Sucrose 1 1 132.20 1.75 0.2049
Soy peptone 1 1 186.81 2.47 0.1358
Soy peptone*Soy peptone 1 1 16.08 0.21 0.6511
Initial pH 1 1 1,849.82 24.44 0.0001*
Initial pH*Initial pH 1 1 1,676.97 22.15 0.0002*
Source*Soy peptone 1 1 0.30 0.01 0.9504
Source*Initial pH 1 1 29.96 0.40 0.5382
Soy peptone*Initial pH 1 1 0.62 0.09 0.9292
1)DF: degree of freedom
2)SS: sum of squares
지 변수 중 특히 초기 pH가 풀루란 생산에 가장 큰 영향을 미 친다는 것을 확인하였다.
결과적으로 A. pullulans MR을 26oC에서 5일간 배양할 경우 반 응표면분석법을 이용하여 얻은 최적 배양 조건은 sucrose 15%, soy peptone 0.4%, 초기 pH 7이였으며, 위의 배양 조건에서 예측 할 수 있는 풀루란의 최대생산량은 47.6 g/L이었다. 이후 확인 실 험을 위해 A. pullulans MR을 동일 조건으로 배양한 뒤 풀루란 의 생산량을 관찰한 결과 48.9±3.4 g/L로 예측된 값과 근접한 값 을 얻을 수 있었다.
추가적으로, sucrose의 경우 기존의 선행연구들에서도 A.
pullulans의 풀루란 생산을 위한 탄소원으로 보고가 되었지만, 배 지내 sucrose의 함량이 5%를 초과하게 될 경우 오히려 풀루란의 생성을 저해한다는 결과가 보고된 바가 있다(Shin 등, 1987b). 이 는 배지내 sucrose의 함량이 높아 질수록 sucrose의 농도에 의한 삼투압 현상과 낮은 수분활성도로 인해 발생하며(Singh 등, 2009b), sucrose뿐만 아니라 glucose와 maltose에서도 같은 결과가 나타내 는 것이 보고된 바 있다(Shin 등, 1987a). 하지만 이러한 보고들 과 다르게 본 연구에서는 오히려 sucrose의 함량을 5%에서 15%
까지 높아졌음에도 불구하고 풀루란의 생산이 오히려 증가하는 반대의 결과가 나타났다. 또한 A. pullulans MR의 풀루란 생산에 있어 가장 큰 영향을 미친 초기 배지의 pH의 경우 A. pullulans 균주에 따라 최적 pH가 pH 3.8부터 pH 7.5까지 다양하게 나타 나는 것을 알 수 있었는데(Singh 등, 2018a; Wang 등, 2013;
Shin 등, 1991) A. pullulans MR의 경우 비교적 중성인 pH 7에서 가장 많은 양의 풀루란이 생산된 것을 알 수 있었다.
본 실험을 통해 A. pullulans MR의 풀루란 대량생산 가능성을 확인하였고, 이를 활용하여 식품, 화장품, 제약 등 여러 광범위한 분야에서 미생물 유래 다당류인 풀루란의 산업적 활용이 가능할 것이라 생각한다.
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Fig. 6. 3D response surfaces and contours for pullulan production by Aureobasidium pullulans MR. (A) The interaction between sucrose and soy peptone, (B) The interaction between sucrose and initial PH, and (C) The interaction between soy peptone and initial pH.
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