Immunoadjuvant Efficacy of Ginsenoside RK1 against Disseminated Candidiasis

DOI 10.17480/psk.2017.61.4.210

전신성 캔디다증에 대한 RK1 인삼배당체의 면역보조 효능

한용문^# · 유정임

동덕여자대학교 약학대학 면역·미생물학교실

(Received April 12, 2017; Revised June 22, 2017; Accepted July 11, 2017)

Immunoadjuvant Efficacy of Ginsenoside RK1 against Disseminated Candidiasis

Yongmoon Han^# and Zheong-Imm Rhew

Department of ImmunoMicrobiology, College of Pharmacy, Dongduk Women's University, Seoul 136-714, Korea

Abstract — We have previously shown that the antibody, specific for β-1,2 mannotriose on the Candida albicans cell wall (CACW), is protective against disseminated candidiasis and vaginal infection. Nevertheless, the isolation of such epitope requires tremendous amount of time, which is very costly. This led us to find a simple way to obtain an immuoadjuvant capa- ble of inducing protective antibodies. Thus, in the present study, for the discovery of such adjuvant, we examined gin- senoside RK1 against Candida albicans-caused infections. Our data displayed that a formulae of CACW (C. albicans cell wall) combined with RK1 [CACW/RK1] enhanced production of anti-C. albicans antibody in mice. Analyses by IgG-isotyping showed that the formulae suppressed IgG1 (Th2-immune polarized) but enhanced IgG2a (Th1-immune polarized), thus resulting in a Th1 immunity. This effectiveness of RK1 was assessed in the murine model of disseminated candidiasis caused by C. albicans. The assessment indicated that the formulae with RK1 enhanced resistance of mice against the can- didiasis, whereas [CACW] alone was not protective. Overall, RK1 has immunoregulatory activity that provokes the pro- duction of protective antibody in mice through enhancing Th1 immunity.

Keywords ginsenoside RK1, immunoadjuvant, Th1/Th2, Candida albicans, disseminated candidiasis

암과 당뇨병 및 관절염 같은 만성질환은 물론 감염성질환을 면역조절 방법을 통해 치료하고자 하는 시도가 많은 주목을 받 고 있다. 이런 시도는 CD4+ Th 임파구의 Th1- 또는 Th2-면역 반응의 항상성(homeostasis) 조절에 의한 질환치료 가능성으로 부터 시작해서^1,2) 아주 최근에는 새로운 Th(조력)임파구로 Th17^3,4)과 Treg(regulatory T cell)가^5,6)등장하면서 이에 대해서 도 많은 연구가 진행되고 있다. 이런 조력임파구는 상호간의 견 제와 협조를 통해서 숙주의 면역력 항상성 유지에 관여하는데, 이들 세포간의 상호통제는 대단히 복잡해서 아직까지 작용기전 이 확실하게 규명되지는 못한 상태이다.^1-6)하지만, 분명한 점은

질환발생시 숙주 내에서 조력임파구(세포)간의 항상성 유지에 문 제가 야기된다는 것이다. 이는 Th1 대 Th2의 정상적인 항상성 이 깨졌다는 것을 의미하며 이런 상태를 정상으로 복귀시키면 질 환의 치료가 가능할 수 있다는 개념을 내포한다.

이런 관점에서 본 연구에서는 Th1 대 Th2의 상호반응을 활용 하여 감염성질환에 대한 치료가능성을 연구하고자 하였다. 면역 계에서 중추적 역할을 하는 조력세포는 적절한 신호와 MHC(Major Histocompatability)를 통해 제시되는 항원의 자극에 따라 크게 Th1 면역반응성과 Th2 면역반응성을 갖춘 유효세포로 분화가 된 다.^7,8)이와 같이 Th1 또는 Th2로 분화된 유효세포는 다른 종류 의 cytokine을 분비하는 경향이 있는데, 이런 근거를 바탕으로 해 서 소위 cytokine profile의 개념이 설정되었다.⁹⁾이점을 활용하여 면역반응의 Type을 구분할 수가 있다. 즉, Th2 면역성은 체액성 면역에 주로 작용하고 Th1 면역성은 세포매개성면역을 유도한

다.^10-12) 또한,Th1과 Th2의 면역 유도성을 구분하는 방법으로

IgG-isotyping이 있는데, 이때는 IgG subclass를 기준으로 하여

#

Corresponding Author Yongmoon Han

Department of ImmunoMicrobiology, College of Pharmacy, Dong- duk Women’s University, Seoul 136-714, Korea

Tel.: 02-940-4521 Fax.: 02-940-4195

E-mail: [email protected]

Short Report

IgG1 생성이 많을 때는 Th2 면역성이 더 우세하다고 평가하고 IgG2a(또는 IgG2b)의 생성이 우세할 때는 Th1 면역으로의 지향 성이 더 높다고 판정한다.^13-15)즉, IgG1/IgG2a 비율을 산정해서 수치가 높으면 Th2 면역성이 우세하다고 평가하고 반대로 비율 의 수치가 낮을수록 Th1 면역유도성이 더 우세한 것으로 평가 한다.^13-15)

병원성 진균의 일종인 Candida albicans은 감염 시Th2 면역 성을 선호하는 경향 때문에 항체의 무용론이 제시된 적도 있었

다.^4,7,8)하지만, 지난 30 여 년 동안 본 연구자와 동료연구자들

은 C. albicans 세포벽 부위의 특정 epitope을 항원으로 하여 유 도된 항체는 항 진균효과가 있다는 연구결과를 최초로 보고한 바 가 있고,^16-18)현재는 진균 감염에 대한 항체요법이 거의 정설로 되어가고 있다.그러나 문제는 보호효과가 있는 항체를 실험동물 의 체내에서 유도 생성하기 위해서는 보호성 항체를 유도하는 항 원이 필요한데, 이러한 항원을 얻는 과정은 매우 까다로워서 막 대한 비용이 필요한 단점이 있다. 그러므로, Th1 면역력을 유도 하는 면역보조제의 발견은 매우 고무적일 것이다.

이러한 맥락으로 본 연구실에서는 다양한 약용성분들의 면역 조절효과에 대해 집중적으로 연구를 수행하고 있다. 지금까지 본 연구실에서 규명한 면역조절력이 있는 성분들의 대표적 예를 들 면 다음과 같다. Rg1⁷⁾및 Rd¹⁹⁾인삼배당체, daucosterol은⁸⁾면역 기능항진작용에 의한 항 진균효과를 발현하고, chlorogenic acid,²⁰⁾ lonicerin²¹⁾ 그리고감초성분인 18β-glycyrrhetic acid 등은 면역조절 효과에 의해서 감염성 관절염에 치료효과가 있음을 보고한 바 있 다.²²⁾지속적인 연구의 일환으로, 본 연구에서는 protopanaxadiol 인삼배당체의 일종인 ginsenoside RK1의 면역조절을 통한 진균성 감염증에 대한 효능을 검색하였다. 문헌조사에 의하면 ginsenoside RK1(RK1)의 면역보조효능에 관한 연구보고는 아직까지 없다.

하지만, 타 연구자의 연구에 의하면 RK1는 항염효과²³⁾및 항암 효과가 있으며,^24-25)항 혈소판응집효과와²⁶⁾, 맥관 누출억제효과 가²⁷⁾ 있다.

이에, 본 연구에서는 RK1의 면역조절효능을 검색하기 위해, 동물을 사용하여 RK1의 면역반응 유도성을 IgG-isotyping방법 을 활용하여 조사하였고, 이 유도성에 의한 항 진균효과를 C.

albicans 기인성 전신성 캔디다증(disseminated candidiasis) 동물 모델을 사용하여 검색하였다.

실험재료 및 방법

실험동물

6 주령의 BALB/c 암컷마우스를 중앙실험동물에서 구입하여 본 대학의 동물실 환경에서 1주일간 적응시킨 후 사용하였다. 이 마우스들은 사육기간 동안 멸균된 filter-top cage에서 멸균된 사 료와 물을 자유롭게 먹게 하였다. 동물관리는 본 대학교 동물관

리규정과 동물사용윤리위원회 승인[동덕동물201506-01]에 따라 사용하였다.

균주와 배양조건

C. albicans는 CA-1 균주를 사용하였다.18,20,22,28) 실험에 사용 한균주는 37^oC에서 GYEP(Glucose-Yeast Extract Peptone) 액 체배지에서 24 시간 간격으로 3회 배양한 후 효모형태의 세포를 수집하여 멸균한 인산완충용액(DPBS; pH 7.4; 4^oC)을 사용하여 3회 세척한 다음에 사용하였다. 실험에 필요한 세포수효는 hemocytometer(Gibco, USA)를 이용하여 측정하였다.

RK1 인삼배당체(Ginsenoside RK1: RK1)

RK1는 서울대학교 약학대학 천연물연구소 김영식 교수님으로 부터 기증받아 사용하였다. RK1 추출분리는 기연구에서 사용한 방법²⁹⁾에 따라 한국산 홍삼에서 methylene chloride – methanol – water – isopropanol(6 : 6 : 4 : 1, v/v) 용매를 사용하여 high- speed counter-current chromatography(HSCCC)를 이용하여 분 리하였다. RK1의 순도는 HPLC-ELSD(evaporative light scattering detection) 방법으로 분석하였으며, 순도는 95% 이상으로 평가되었 다.²⁹⁾ RK1은 Dammarane 계열에 속하는 protopanaxadiol 일종 으로 탄소 3번 위치에 glucose-glucose가 연결되어 있다(Fig.

1).^29,30) 본 RK1은 사용하기 전에 상업용 내독소 검색 kit(Sigma)

을 사용하여 endotoxin 오염유무를 확인한 후 사용하였다.

C. albians cell wall extract(CACW)의 분리

C. albians의 세포벽분리는 본 연구실의 기 연구에서 사용한 기법을 적용하였다^9,18)분리법을 간략히 기술하면 다음과 같다.

GYEP 액체배지에 배양한 C. albicans 세포를 수집한 후 disodium EDTA와 trisodium EDTA로 순차적으로 처리하고 β- mercaptoethanol를 첨가해서 처리한 다음에 상등액을 수집하여 투 석막(membrane cut-off = 12,000 Da)에 넣고 멸균된 탈이온수에

Fig. 1 − Chemical structure of ginsenoside RK1, a protopanaxadiol,

isolated from the Korean Red Ginseng. The position C3 is

connected with two molecules of glucose.

대하여 투석하였다. 투석 후, 막 내부의 물질(CACW)을 수집하 여 동결건조기로 분말화 하였다. 분말화된 CACW는 desiccator 가 있는 용기에 저장보관하며 사용하였다.

RK의 면역보조효과(= 항체생성 증가여부)와 면역유도성(Th1/

Th2 balance) 검색

이 검색을 위해서 본 연구실의 기 연구에서 입증한 백신제조 방법 및 접종일정(innoculation regimen)을 적용하였다.^16,22,28)이 방법을 간략히 요약하면, 2 mg의 RK1과 CACW 0.2 mg을 5 ml 용량의 멸균된 플라스틱용기(Sigma)에 넣은 다음에 1 ml DPBS 를 첨가해서 잘 혼합하였다. 이 혼합액에 IFA(Incomplete Freund's Adjuvant, Sigma) 1 ml를 추가로 첨가해서 유화형태의 제형을 제 조하였다(= CACW/RK1). RK1의 면역보조효과를 검색하기 위 한 대조군제형은 0.2 mg의 CACW만을 함유한 제형을 사용하였다 (= CACW). 음성대조군에는 희석액(DPBS)만을 주사하였다. 접종 용량과 접종일정은 0.2 ml/마우스 용량을 복강내(intraperitoneally:

i.p.)로 1차 접종(Day 1)하고 3주 후(Day 22)에 동일한 용량을 동일 한 접종경로로 2차 접종 하였다. 일주일 후(Day 29), 각 마우스 의 꼬리동맥에서 채혈하여 혈청을 분리하였다. 수집한 혈청 내 항 CACW항체의 생성정도는 본 연구실의 기 연구에서 사용한 ELISA방법으로 검색하였다.^8,16,28) RK1의 Th1 대 Th2 면역유도 성검색은 상업용 IgG-isotyping kit(Sigma: ISO-2)를 구입하여 제 조사의 가이드라인에 따라 흡광도로 측정 비교하였다.

[CACW/RK1] 제형의 효능검색

[CACW/RK1]제형의 효능검색은 본 연구실의 기 연구에서 사 용한 방법을 활용하여 평가하였다.²²⁾이 실험방법은 상기에 기 술한 바와 같이 해당 제형([CACW/RK1], [CACW], [DPBS])으 로 동일하게 2회 면역접종하고 Day 29 시점에 모든 마우스들에 게 C. albicans(5 × 10⁵ yeast cell/mouse)를 꼬리정맥으로 감염시 키고 각 마우스 그룹들의 평균생존시간(mean survival times:

MST)을 관측하여 전신성 캔디다증(disseminated candidiasis)에 대한 보호효과를 조사하였다.

통계 − 실험결과는 평균 ± 표준오차로 계산하였고 Student's t-test 를 사용하여 P 값(value)이 5% 미만일 때에 유의성이 있는 것으로 판정하였다. 생존율의 유의성은 Kaplan-Meier 방법(New Statics for Windows; SPSS, Chicago, USA)을 사용하여 판정하였다.

실험결과 및 고찰

RK1의 항체생성의 증진효과

RK1의 항체생성 증진 여부를 검색한 실험결과, [DPBS]음성 대조제형의 경우와 비교했을 때 [CACW/RK1]과 [CACW] 두 제

형 모두는 항 캔디다항체의 생성을 유도하였다(Fig. 2). [CACW/

RK1] 제형으로 면역된 마우스에서 유도된 항체의 정도는 [CACW]

만으로 생성된 항체의 정도에 비해 2.4배 이상 높게 측정되었다 (P < 0.01) (Fig. 2). 이 결과로서 RK1는 CACW의 항체생성을 증진하는 면역보조제의 효과가 있는 것으로 평가가 되었지만 생 성된 항체가 C. albicans 감염에 대해 보호효과가 있는지의 여부 는 이 실험결과 단독으로는 확인할 수 없다. 이에, 항체의 본 감 염에 대한 보호효능을 검색하기 위해서 C. albicans 기인성 전신 성 캔디다증(disseminated candidiasis) 동물모델을 사용하여 [CACW/RK1]제형의 효과를 검색하였다.

RK1의 면역반응유도 효과

먼저, 본 인삼배당체의 Th-면역반응 유도성을 검색하기 위해 수집된 혈청내의 IgG1과 IgG2의 각 생성의 비율을 측정하여 Th1 또는 Th2의 면역반응 우세성 여부를 분석하였다. 분석결과, IgG1 의 경우에 [CACW]제형이 [CACW/RK1]제형 보다 약 42% 더 많이 생성되었다(Fig. 3A). 그러나 IgG2a의 경우에는 [CACW/

Fig. 2 − [CACW/RK1] enhances induction of anti-Candida albicans antisera in mice. Mice (BALB/c strain) were given intrperitoneally (i.p.) with [CACW/RK1], [CACW], or [DPBS]

formulae, respectively. These animals received respective

formulae twice at days 1 and 22. Seven days after the last

immunization, they were bled from the tail for detection of

antibody production. Results indicate that RK1 may exert

immunoregulatory activity with CACW as an antigenic

source in mice.

P < 0.01. CACW; Candida albicans cell

wall: RK1; ginsenoside RK1. Error bar, S.E. Each group

contained 5 mice.

RK1]제형이 [CACW]제형에 비해서 대략 90% 더 많이 생성되었 다(Fig. 3B). 이 결과를 비교 분석해볼 때, Th2 면역반응을 의미 하는 IgG1의 생성은 억제된 반면에 Th1 면역반응을 나타내는 IgG2a의 생성이 증가한 것으로 평가되어 RK1의 첨가는 Th1 type의 면역반응을 우세하게 발현시킨다는 것을 알 수 있었다.

이 결과를 정리한 Table I을 보면, RK1을 함유하지 않은 [CACW]

제형의 IgG1/IgG2a비율이 1.07인데 반하여, [CACW/RK1]제형 에서의 IgG1/IgG2a비율은 0.40으로 산출되었다. 이때 수치간의 차이는 통계적으로 유의성이 있었다(P < 0.05). 결론적으로 이와 같은 분석에 의하면 CACW에 RK1을 첨가했을 때 Th2에 우세 한 면역반응을 Th1 면역성이 우세하도록 유도하는 면역조절력 이 있는 것으로 평가되었다.

[CACW/RK1]제형의 전신성 캔디다증에 대한 보호효과 CACW 항원에 RK1첨가하면 마우스 체내에서 Th1지향성 항 체가 유도된다는 결과에 근거하여, 전신성 캔디다증에 대한 [CACW/RK1]제형의 보호효과 여부를 조사하였다. 본 동물실험

Fig. 3 − [CACW/RK1] formulae suppresses IgG1-production whereas the identical fromulae enhances IgG2a-production as analyzed by IgG isotyping. Antisera obtained from the animals that were treated as mentioned in Fig. 2 were detected for IgG1 (Th2-immune response) and IgG2a (Th1-immune response), respectively. Results displayed that RK1 might shift Th2 response into Th1 response (P < 0.05). This phenomenon is found to be beneficial for curing for C. albicans infections. [Refer mathematical analysis presented in Table I.] CACW; Candida albicans cell wall: RK1; ginsenoside RK1. Error bar, S.E. Each group contained 5 mice.

Table I − Addition of RK1 to CACW used as an antigen caused dominant Th1 type-immunity.

Average of: Ratios of:

Treatments [IgG1] [IgG2a] [IgG1]/[IgG2a]

CACW

0.31 0.29 1.07

CACW/RK1

0.21 0.53 0.40

*

C. albicans cell wall;

Ginsenoside RK1

Fig. 4 − [CACW/RK1] formulae protects mice against disseminated candidiasis. [CACW/RK1]-immunized mice were challenged intravenously with live C. albicans and their survivability were measured during an observation period of 30 days.

Control mice groups were given [CACW] or [DPBS] only before the challenge. Data showed that the [CACW/RK1]- immunized mice survived longer than control animal groups against the disease ( P < 0.05). Although mice that received [CACW] produced anti- C. albicans antisera, these mice were not protected. The protection may be polarization of Th2 immunity into Th1 immunity by RK1.

This may be due to immunoregulatory activity of RK1.

CACW; Candida albicans cell wall: RK1; ginsenoside

RK1: MST; mean survival times. Each group contained 7

mice.

결과, 30일의 관측기간 동안에 [CACW/RK1]로 면역된 마우스들의 평균생존시간은 17.4일로 음성대조군의 평균생존시간(=5.1일)보다 12일 이상 더 연장되었으며(P < 0.05), 관측기간 동안에 3마리는 생존하였다(Fig. 4). 이에 반해서 [CACW]제형으로 면역된 마우 스군의 평균생존기간(=6.6일)은 음성대조군(5.1일)에 비교할 때, 1.5일정도의 차이가 있지만 통계적으로 유의성은 없으며 관측기 간 14일째 마우스 모두가 사멸하였다(Fig. 4). 이 결과들을 고찰 해보면, [CACW]제형도 마우스 내에서 항체를 유도하지만 이 항 체는 전신성 캔디다증에 대한 보호효과가 없으며 CACW에 RK1 를 첨가했을 때는 보호효과가 발현되는 것을 알 수 있다. 이는 RK1의 Th1지향성 항체 유도에 의한 것으로 여겨진다. 그러므로 RK1은 면역보조제의 효능이 있는 것으로 사료된다.

결 론

본 연구에서는 Ginsenoside RK1의 면역조절력에 의한 전신 성 캔디다증에 대한 보호효과를 연구조사 하였다. 이를 위해, 항 원으로 C. albicans cell wall(CACW)를 사용하여 RK1의 첨가 유 무에 따른 제형을 제조하여 동물에 접종했을 때 유도 생성된 항 체의 증진여부와 IgG isotyping 방법을 적용하여 Th2(IgG1)/

Th1(IgG2a) 비율에 의한 면역 우세성을 분석 평가하였다. 그리 고 RK1의 면역조절력을 통해서 발현된 Th1 면역반응의 우세성 에 따른 효능을 조사하기 위해서 전신성 캔디다증 동물모델을 사 용하였다. 본 연구에서 산출된 결과를 분석해 보면, [CACW/RK1]

백신제형은 본 인삼배당체를 첨가하지 않은 제형에 비해서 실험 에 사용한 마우스 체내에서 항체생성을 증진시켰으며, IgG- isotyping 방법에 의하면 Th1 면역반응이 우세한 항체의 비율이 Th2 지향성 항체보다 훨씬 높게 유도생성된 것을 알 수가 있었 다. 이 결과를 토대로 하여 본 연구실의 많은 기 연구에서 활용 하여 그 시험법이 규정된 전신성 캔디다증 동물모델에서 [CACW/

RK1] 백신제형의 효과를 조사한 바, 본 백신제형으로 면역된 마 우스군의 평균생존기간은 대조군들([CACW]제형과 [DPBS]제형) 의 평균생존시간에 비해서 생존시간이 연장되었다. [CACW]제형 도 마우스 체내에서 항 캔디다항체를 유도 생성했지만 C. albicans 감염에 대해서는 거의 효과가 없었다. 이러한 결과를 통합하여 고찰해 보았을 때, [CACW/RK1] 백신제형의 보호효과는 Th1 면 역 지향성 항체를 우세하게 유도하는 RK1의 효능에 기인하며, 따라서 RK1은 면역보조효과가 있다고 판단할 수 있다. 한편, RK1의 첨가 없이 [CACW]만을 접종한 마우스군의 평균생존기 간이 [DPBS]로 처리된 음성대조군의 생존시간에 비교해서 미약 하지만 차이가 있었다. 비록 이 차이가 통계적으로 유의성은 없 지만, 보호효과가 있다고 할 때 다른 각도에서 추론해 보면 항체 의 생성량이 적기 때문이라고 추론해 볼 수 있다. 하지만, IgG1 생성량의 경우를 상호비교해보면 오히려 [CACW/RK1]제형으로

유도된 생성량보다 [CACW]제형으로 면역된 마우스그룹에서 더 많이 생성되었지만 보호효과는 없기 때문에 본 보호효과가 항체 의 양에는 무관한 것으로 사료된다.

종합하면, 본 연구를 통해서 RK1은 전신성 캔디다증에 보효 효과를 발현하는 Th1 지향성 항체를 유도하는 면역보조력이 있 는 것으로 규명되었다. 이 연구결과는 향후 진균백신 개발과정 에서 Th1-면역반응 유도성이 있는 보조제로서 RK1의 활용 가 능성을 보여주며, 보호성 항체를 유도하는 항원분리과정에서의 연구비용 절감 효과도 기대해볼 수 있을 것으로 사료된다.

감사의 말씀

RK1 인삼배당체를 제공해주신 김영식 교수님(서울대학교 약 학대학 천연물연구소)께 감사를 표합니다. 이 논문은 2016년도 동덕여자대학교 학술연구비 지원에 의하여 수행된 것으로 이에 감사드립니다.

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