Effects of Sophorae Radix on Human Breast Adenocarcinoma Cells

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▒ 교신저자 김병주, 경남 양산시 물금읍 범어리 부산대학교 한의학전문대학원 Tel 051-510-8469 Fax 051-510-8420 E-mail [email protected]

고삼의 인체 유방암세포에 미치는 효과

이희정, 김민철, 임보라, 배고은, 김형우

, 권영규, 김병주

부산대학교 한의학전문대학원 양생기능의학부, ¹약물의학부

Effects of Sophorae Radix on Human Breast Adenocarcinoma Cells

Hee Jung Lee, Min Chul Kim, Bora Lim, Goeun Bae, Hyung Woo Kim

, Young Kyu Kwon, Byung Joo Kim Division of Longevity and Biofunctional Medicine,

Division of Pharmacology School of Korean Medicine, Pusan National University

Objective : The purpose of this study was to investigate the anti-cancer effects of Sophorae Radix and the effects of Doxorubicin (DOX) in human breast adenocarcinoma cells (MCF-7).

Method : We used human breast adenocarcinoma cell line, MCF-7 cells. We examined cell death by MTT assay and caspase 3 assay with Sophorae Radix. To examine the inhibitory effects of Sophorae Radix, cell cycle analysis was done the MCF-7 cells after three days with Sophorae Radix. The reversibility of Sophorae Radix was examined on one day to five days treatment with 100 ㎍/ml Sophorae Radix.

Result : Sophorae Radix inhibited the growth of MCF-7 cells in a dose-dependent fashion. Also we showed that Sophorae Radix induced apoptosis in MCF-7 cells by MTT assay, caspase 3 assay and sub-G1 analysis. Sophorae Radix combined with DOX markedly inhibited the growth of MCF-7 cells compared to Sophorae Radix or DOX alone.

After 3 days treatment of MCF-7 cells with Sophorae Radix, the fraction of cells in sub-G1 phase was much higher than that of the control group.

Conclusion : Our findings provide insight into unraveling the effects of Sophorae Radix in human breast adenocarcinoma cells and developing therapeutic agents against breast cancer.

Key Words : Sophorae Radix, Human Breast Adenocarcinoma Cell, MCF-7, Doxorubicin (DOX)

Ⅰ. 서론

유방암은 미국을 비롯한 서구 국가에서 발병률이 높은 암으로 한국을 포함한 동양인에서는 발생이 다소 낮은 편이지만 식생활, 수유방법 및 환경의 변화 등으로 인해 한국 여성에서 발생율은 위암에 이어 2위를 차치하고

있으며 매년 급증하고 있는 추세이다. 유방암과 가장 유사한 한의학적 질환으로는 乳巖, 乳雍, 吹乳, 乳中結核, 乳癖, 乳痰 등이 있는데 이중 유암이 현재 유방암에 가장 부합되며 그 밖의 명칭들은 유암을 단계별로 다양하게 분류한 것으로 보이며 蔬氣行血法을 기본으로 삼고 있다.

유방암(breast cancer)은 유방에 생기는 악성 종양으로, 서구 국가에서는 제일 많은 암이며, 우리 나라에서도 점점 증가하고 있는 추세이다. 유방암의 주요 증상은 통증이 없는 멍울이 유방에 생기는 것이다.

이때 멍울은 단단하며 때로는 혈액 등 분비물이 스며

나오기도 한다. 거울 앞에 좌우 유방이 똑같은지 살펴 보는 것이 중요하며 손으로 살짝 눌러가며 멍울이 잡히는지도 점검해야 한다. 유방암은 결혼을 늦게 한 여성이나 독신여성, 아기를 낳지 않거나 적게 낳은 여성, 모유를 먹이지 않는 등 수유 경험이 없는 여성, 사춘기가 빨리 오거나 폐경이 늦게 온 여성, 고지방식 등 서구식 식습관에 익숙한 여성이나 집안에 유방암 환자가 있는 여성에게 많이 발생한다. 유방암 치료는 수술이 가장 중요하며, 수술 후 잔류 암세포 억제를 위해 항암요법을 쓰게 된다. 과거 유방암 수술은 유방 전체를 거의 절제해 여성들에게 수술 후 많은 심리적 고통을 안겨 주었지만, 최근엔 유방 모양을 보존하면서 암 덩어리만 제거하는 부분 절제수술이 개발돼 널리 이용되고 있다. 또한 호르몬 요법이나 방사선치료를 이용하기도 한다.

또한 유방암을 치료하기 위한 항암제중 식물추출물 및 성분이 유방암의 예방과 치료에 긍정적인 효과를 나타 내고 있다는 보고가 MCF-7 인체 유방암 세포주에서 많이 밝혀 지고 있다.

일과성 수용체 전압 (transient receptor potential, TRP) 이온 채널은 시각을 주관하는 단백질로 초파리 에서 처음 발견되었다. TRP 단백질 그룹은 포유류를 포함한 동물계 전반에 걸쳐 잘 보존되어 있고 이들은 기능이 서로 다른 21개의 유전자 형태가 존재하고, 최근에서야 그 기능이 이해되기 시작하였다. 다양한 TRP 채널들은 세포질 내의 칼슘 레벨을 증가시킴으로써 다양한 종류의 자극인자에 반응한다. 즉, 단맛, 쓴맛을 구분할 수 있으며, 따뜻함, 뜨거움, 그리고 차가운 감각도 구분 가능하다.

또한 TRP 채널은 세포사멸에 관련되어 있는 것으로 알려지고 있다. 그 중 대표적인 것이 melastatin그룹에 속한 TRPM7 이온통로이다.

TRPM7 이온통로는 많은 기능이 알려지고 있는데 그 중에서 마스트 세포 (mast cells),

인간 두경부 암 세포 (huamn head and neck carcinoma cells),

인간 조골세포 (human osteoblast-like cells)

와 유방암 세포

의 세포사멸에 관여 한다고 알려지고 있다.

고삼은 콩과에 속하는 다년생 초본식물인 도둑놈의 지팡이 ( Sophora flavescens Aition )라는 식물의 뿌리로 한방에서는 이 식물의 뿌리를 약제로 이용한다.

우리나라 전역에 자생하고 성질은 차고 무독하며 강한 쓴맛을 지니고 있으며

항부정맥 등에 효능이 있다고

알려져 있다.

또한 한방에서는 황달, 간질, 해열, 이뇨, 진통, 구충제 내복용으로 쓰이고 있으며, 강장제로 민간 약재로 이용되어 왔다.

고삼에 의한 항암효과 연구로는 Abbott 등

이 Sarcoma 180, lymphoid leukemic 1210과 melanotic melanoma에서 항암 효과가 있음을 밝혔듯이 여러 논문에서 제시되어져

있지만

항암제의 효과를 증가시키는 보조제로서의

역할에 관한 체계적인 연구는 이루어지지 않았다. 또한 고삼에 의한 세포사멸에 TRPM7 이온통로의 관련성에 대한 연구도 이루어지지 않았다. 이에 본 연구에서는 고삼 추출물을 이용하여 유방암세포에서의 항암효과 및 관련 기전을 알아보고 항암제에 대한 병용투여로 항암의 효과를 증진시키는 효과를 관찰하고자 한다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 재료

1) 약재

본 실험에 사용된 고삼(苦蔘, Sophorae radix, SR)은 콩과에 속한 고삼 Sophora flavescens Aiton 의 주피를 벗긴 근으로 2010년 10월 경북 상주에서 생산된 것을 화림제약 (부산, 한국)을 통하여 구입하였다. 세척되고 세절된 상태로 구입된 苦蔘 50 g을 분쇄기로 분쇄한 다음, 에탄올 1,000 ml를 이용하여 상온에서 48시간 추출하였다. 추출액을 원심분리하여 얻은 상층액을 와트만지 (Watman paper)를 이용하여 2회 반복 여과한 후, 감압농축기 (EYELA, Japan)를 이용하여 감압 농축하였다. 감압 농축된 추출액은 동결 건조되었으며, 최종적으로 얻어진 추출물은 6.43 g으로 수율은 12.9%였다.

2) 대상 세포주

이 실험에 사용한 인체 유방암세포는 서울대학교

암세포주 은행에서 구입한 유방암 세포주 MCF-7이며,

adenocarcinoma의 histopathology 특징을 나타내고

있다.

2. 방법

1) 암세포의 배양

암세포주는 10% fetal bovine serum (Gibco BRL, MD), 1% broad-spectrum antibiotics (Gibco BRL, MD)가 함유된 RPMI-1640 (Gibco BRL, MD) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO

incubator (Precision Scientific Inc. NY)에서 배양하였고, 세포는 0.1% Trypsin-EDTA (Sigma, MD)를 이용하여 37℃에서 5분간 처리한 후 회수하였다.

2) MTT assay

세포 생존율 측정은 세포 배양판 (12-well)에 암세포를 1 ml씩 분주하여 24시간 이상 배양 후 고삼추출물을 다양한 농도로 처리한 다음, 37℃, 5% CO

하에서 72시간 배양한 후, MTT용액 (5 mg/ml)을 배양액 최종 부피의 1/10되게 첨가 하였다. 3시간 후 배양액을 제거하고 형성된 formazan 침전물을 dimethyl sulfoxide (DMSO) 1 ml로 녹여서 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3) Caspase 3 assay 측정

Caspase 3 assay kits를 BioMol (Plymouth, PA, USA)에서 구입하여 측정하였다. 405 nm의 흡광도에서 여러 번 측정하였다.

4) Flow cytometry를 이용한 세포주기 분석

고삼이 MCF-7세포의 증식을 억제하는데 있어서 세포 주기의 어느 단계를 지연시키는지 flow cytometry를 이용하여 분석하였다. 고삼을 첨가한 배지에서 3일간 배양된 MCF-3세포를 PBS용액으로 세척한 후, 4℃에서 30분간 70% ethanol로 고정하였다. 고정후 propidium iodide (Sigma, USA)로 DNA를 염색하여 Becton Dickinson FACStar Flow Cytometry를 이용하여 세포주기를 비교 분석하였다.

5) 전기생리학적 막전류 측정

세포들을 도립현미경(inverted microscope) 위에 설치되어 있는 작은 실험용(300μl)로 옮긴 후 분당

2-3ml 속도로 세포외 용액을 관류시켰다. 유리전극의 저항은 3-5MΩ의 것을 사용하였다. Patch clamp 증폭기(Axopatch 1-D, Axon Instruments, USA)를 통하여 나오는 신호는 digital oscilloscope(Hitachi, Japan), 생리기록기(Recorder 220, Gould, USA)를 통해서 관찰하였고, 고정전압과 자극전압의 조정 및 전류의 기록은 pClamp software v 6.0(Axon Instruments, USA)와 IBM-compatible computer를 사용하였다.

TRPM7 전류를 관찰하기 위해서 세포외 관류용액은 NaCl 135, KCI 5, CaCl₂1.8, glucose5, MgCl₂1.2, HEPES 10 mM을 사용하였으며 tris를 사용하여 pH를 7.4로 교정하였다. 전극내 용액은 NaCl 10, KCI 102, CaCl₂1, ATP 5, GTP 1, MgC1₂1, EGTA (ethyleneglycol- bis-(β-aminoethylether) N,N,N',N'-tetra-acetic acid) 10 mM, pH 7.2 (KOH로 교정)인 용액을 사용하였다.

6) 통계 분석

대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검정은 SPSS 16.0 (SPSS Inc, Chicago)의 Independent t-test를 사용하였으며 유의수준 p<0.05를 사용하였다.

실험결과는 mean ± SD 또는 빈도(%)로 기재하였다.

Ⅲ. 결과

1. 암세포 살상 효과

암세포 살상 효과를 측정하기 위하여 50, 100, 150, 200 ㎍/ml의 농도로 각각 3회씩 시험한 결과 고삼에 의한 MCF-7효과 2일후인 (A)에서는 50 ㎍/ml 이상에서 암세포 살상 효과를 볼 수 있었으며, 4일후인 (B)에서는 100 ㎍/ml 이상에서 뚜렷한 암세포 살상 효과를 볼 수 있었다 (Figure 1). A에 있어서는 50 ㎍/ml에서 71.1

± 9.6 %, 100 ㎍/ml에서 32.3 ± 6.4 %, 150 ㎍/ml에서 19.2 ± 4.7 %, 200 ㎍/ml에서 4.4 ± 2.2 %의 결과를 보였다. B에 있어서는 50 ㎍/ml에서 42.3 ± 2.6 %, 100 ㎍/ml에서 9.3 ± 4.0 %, 150 ㎍/ml에서 3.4 ± 0.9 %, 200 ㎍/ml에서 1.3 ± 0.2 %의 결과를 보였다.

이러한 결과는 A, B 모두 통계적으로 유의하게 암세포

<Figure 1> Effect of Sophorae Radix extract on cytotoxicity in MCF-7 cells.

MCF-7 cells were incubated with Sophorae Radix extract as indicated dose (㎍/ml). After 2 days (A) or 4 days (B), cell viability was measured by MTT assay as described in materials and methods. The values are expressed as percent (%) of control and each column represents the mean ± S.D. *P<0.05. **P<0.01.

HEK 293 cells

<Figure 2> Effect of Sophorae Radix extract on transient receptor potential melastatin 7 (TRPM7) channels.

(A) Representative current-voltage relationship. Effect of Sophorae Radix extract on overexpressed TRPM7 in HEK293 cells.

(B) Representative current-voltage relationship. Effect of Sophorae Radix extract on TRPM7–like current in MCF-7 cells.

(C) Effect of Sophorae Radix extract on cell viability with a MTT–based viability assay in HEK293 cells with overexpressed TRPM7 channels.

Cell viability was significantly decreased by Sophorae Radix extract. Inhibition of TRPM7 channels by 2-APB and La3+ reduced Sophorae Radix extract cytotoxicity. The values are expressed as percent (%) of control and each column represents the mean ± S.D. *P<0.05. **P<0.01.

살상 효과가 있다는 것을 확인한 결과로 MCF-7은 고삼에 의해서 50 ㎍/ml 이상 농도에서 항암작용이 나타나고, 4일후에서는 100 ㎍/ml 이상 농도에서 뚜렷한 항암작용이 있음을 의미한다.

2. 세포사멸에 TRPM7 이온통로의 관련성 확인

고삼에 의한 세포 사멸에 어떤 이온통로가 관련되어 있는지를 확인해 보았다. 최근 Guilbert연구 그룹에서 유방암세포주인 MCF-7에서 유방암세포의 세포 사멸에 일과성 수용체 전압 (Transient Receptor Potential, TRP) melastatin 7 (TRPM7) 이온통로가 관여하고 있음이 밝혀졌다.

따라서 고삼에 의한 MCF-7세포 사멸에 TRPM7 이온통로의 관련성을 알아 보았다.

먼저 TRPM7을 HEK293세포에 과발현 시킨 후 고삼

100 ㎍/ml 을 투여해 보니 TRPM7 이온통로의 억제를 확인 할 수 있고 (Figure 2A), MCF-7 세포에서 TRPM7 전류를 측정한 후 이곳에 고삼을 투여 했을 때 역시 감소함을 알 수 있었다 (Figure 2B). TRPM7 이온통로의 억제제라고 알려지고 있는 lanthanium chloride (La3+) 과 2-APB를 이용하여 TRPM7의 관련성을 알아 보았다.

La3+과 2-APB에 의해서 고삼에 의한 세포 사멸 억제를 확인 할 수 있었다 (Figure 2C). 따라서 고삼에 의한 세포 사멸에는 TRPM7 이온통로가 관여하고 있음을 알 수 있었다.

3. Caspase 3를 통한 암세포 사멸 확인

고삼에 의한 세포사가 apoptosis에 의한 것인지

확인하기 위하여 농도별로 세포사멸의 진행 정도를 알아

<Figure 3> Sophorae Radix extract induces apoptosis in MCF-7 cells.

After 2days (A) or 4days (B), caspase 3 activities measured by enzyme assays. The specific activity was obtained from three samples per group.

CTRL: MCF-7 cells. *P<0.05. **P<0.01.

<Figure 4> Sophorae Radix extract leads to increase apoptosis in MCF-7 cells.

MCF-7 cells were incubated with Sophorae Radix extract as indicated dose (㎍/ml). After 2 days (A) or 4 days (B), sub-G1 peak was measured by FACScan as described in materials and methods. The values are expressed as percent (%) of control and each column represents the mean

± S.D. *P<0.05. **P<0.01.

보았다. Caspase는 cystinyl aspartate-specific protease로 세포질에서 pro-form으로 존재하고 특정 위치의 proteolytic 과정에 의해 활성화된다. 이로 인해 세포의 DNA 복제 및 유전자 발현과 관련된 단백질 및 핵의 구조 유지, 세포의 항상성 유지 등과 관련된 단백질 들을 파괴시키거나 관련된 단백질을 활성화시켜 apoptosis를 유도하게 된다. Caspase 3 activity를 측정한 결과 고삼에 의해 caspase 3 activity가 증가 함을 알 수 있다 (Figure 3).

4. Flow cytometry를 이용한 세포주기 분석

고삼에 의한 세포사가 apoptosis에 의한 것인지 확인하기 위하여 flow cytometry를 이용한 세포주기 sub-G1분석을 실시 하였다. Apoptosis가 일어나면 기존의 fluorescence peak가 왼쪽으로 이동해 새로운 sub-G1 fluorescence peak가 만들어 진다. 고삼에

의한 Sub-G1 분석 결과 고삼 농도에 비례해서 sub- G1 peak가 증가함을 알 수 있다 (Figure 4).

5. 고삼의 세포 증식억제 효과의 가역성

고삼이 MCF-7세포의 증식 억제 작용의 가역성을 보기 위해, 대조군과 고삼 200 ㎍/ml을 첨가하여 24시간 동안 배양시킨 후 고삼을 제거한 군, 그리고 고삼 200

㎍/ml을 첨가해서 계속 그대로 둔 군으로 나누어 관찰 하였다. 접종후 24시간 뒤에 고삼을 첨가하여 24시간 배양했다가 첨가한 고삼을 제거한 날, 즉 접종 2일째는 제거군과 제거하지 않은 군에서의 억제성이 약 50%

정도로 차이가 없었고, 대조군 보다는 유의하게 낮았다.

고삼을 제거한지 3일째 즉 접종 4일째 제거군의 세포

억제는 약 16 % 정도로 제거하지 않았던 군의 세포억제

약 80 % 보다 세포수가 현저히 많았다. 이러한 경향은

시간이 흐를수록 더욱 현저해짐을 알 수 있다 (Figure 5).

<Figure 5> Reversibility of effects of Sophorae Radix extract in MCF-7 cells.

Closed squares, control group; closed circles, Sophorae Radix treatment for 24 hours followed by replacement with Sophorae Radix free medium;

closed triangles, Sophorae Radix treated group. *P<0.05. **P<0.01.

6. 고삼과 Doxorubicin의 세포 증식에 미치는 상호 작용

Doxorubicin (DOX) 500 nM과 고삼 20 ㎍/ml을 같이 첨가한 군의 세포억제는 약 33 %로 DOX만을 첨가한 군 (약 11 % 억제) 및 고삼만을 첨가한 군(약 0 % 억제)에 비해서 세포 억제가 현저히 증가하였다. 고삼의 농도를 높였을 때는 더욱 현저하여, 고삼 40 ㎍/ml을 DOX 500 nM과 병용 첨가했을 때에는 배양 3일째 대조군에 비해서 약 76 %의 억제 작용을 보였다. 그리고 DOX 1 μM과 고삼을 병용 첨가했을 때에도 농도에 따르는 증식억제 효과가 각각을 따로 첨가 했을 때 보다도 현저하게 증식억제 효과가 증가함을 알 수 있었다.

DOX 1 μM과 고삼 40 ㎍/ml을 병용 투여 하였을 때에는

약 92 % 억제로 세포가 거의 없을 정도로 그 증식 억제 작용이 뚜렷하였다. (Table 1)

Ⅳ. 고찰

암에 의한 사망률은 국내에서 사망원인 1위로, 매년

그 수가 증가하고 있다. 그 중 유방암은 우리나라 여성암

중 암 사망률이 폐암에 이어 2위를 차지하고 있다.

암에 대한 기존의 서양의학적인 치료방법은 다양한

부작용으로 인해 삶의 질이 떨어지고, 암의 전이 및

재발을 막기에는 충분치 못해, 새로운 치료법이 요구

되고 있으며, 최근의 암 치료 연구에 있어서 다양한

한약재의 항암효과에 대한 연구 보고가 있다.

또, 암 치료에서 화학요법에 의한 항암에는 암의 종류에 따라 약리작용이 다양하고

독성에 의한 부작용이 다양하게 나타나기 때문에 암 치료시 문제점으로 항상 지적되고 있다.

따라서 항암제의 부작용을 최소화하고 치료효과를 높이기 위하여 천연식물을 이용한 항암제의 개발이 시도되고 있다.

이러한 관점에서 오랫동안 임상적으로 사용되어져 온 한약재를 이용한 항암제 암예방제 및 암치료제의 개발은 매우 큰 장점을 지닐 수 있기 때문에 이에 관해 많은 연구가 진행되고 있다.

고삼은 옛날부터 한방에서 살충제, 진통제, 구충제 내복용으로 쓰였고, 심한 피부 습진 외용약으로 사용 되었으며 뿌리로 만든 고약은 트리코모나스 질염, 습진, 신경성피부염에 쓰였다.

또한 성미는 차고 무독하며 강한 쓴맛을 가지고 있어 심장. 간, 위, 대장, 방광경에 작용하며 ,청열조습, 살충, 이뇨의 효능이 있고, 열리, 변혈, 황달, 뇨폐, 적백대하, 음종, 음양, 습진, 습창, 피부 소양개선, 마풍, 진통 등을 치료한다고 알려져 있다.

고삼은 일반적으로 염료로 사용되지는 않았으나 국내 도처에 자생하여 구하기 쉽고 피부 질환의 약제로 민간에서 사용되어온 약제이며 뿌리에서 염료를 얻기 때문에 다량의 색소가 채취되고 고삼의 플라보노이드계 화합물 색소는 황색색소를 포함하므로 섬유제품의 염료로나 색조 화장품류의 색소로도 실용 가능하리라 생각되고,

또한 다양한 연구가 진행되어 심장내피 세포에서 xanthine의한 세포독성을 막는 작용,

항균 작용,

항염증 작용,

피부 미생물의 억제 효과

등이 보고 되고 있고, 또한 항암작용도 알려지고 있다.

하지만 다른 작용보다 항암에 대한 연구는 거의 되어 있지 않고 있다.

TRP 통로는 90년대 중반에 초파리의 시각계에 존재하는 광수용체 (photoreceptor)로 처음 발견 되었으며,

이후 사람을 포함한 고등동물의 세포에도 존재함이 알려지면서 연구가 가속화되고 있다. TRP superfamily에 속하는 TRP 통로들은 현재까지 30여 가지가 알려져 있으며 생리적 기능도 각각 다르지만 종류에 관계없이 두 가지의 유사성을 가지고 있다. 첫째, TRP 통로는 비특이적 양이온 통로이면서 주로 칼슘 이온에 대한 세포 내 통로로 작용한다. 칼슘이온의 세포 내 유입은 해당 세포들의 탈분극 및 활성화를 유도하게

된다. 둘째, TRP 통로를 활성화시킬 수 있는 자극의 종류가 작용제 (agonist)로서의 전달자 물질 이외에 광자극, 진동이나 접촉 등의 기계적 자극, 온도자극, 화학자극, 삼투압의 변화 등으로 매우 다양하며, 한 가지 종류의 TRP 통로가 여러 가지 종류의 자극에 반응을 할 수 있기도 하다.4) TRP 통로 단백질의 기본 골격은 6개의 막횡단 영역(transmembrane domain)을 가지는 펩티드 사슬 (peptide chain) 이다. 아미노말단 (N-terminal)과 카르복시말단(Cterminal)이 모두 세포 내측에 위치하고 있으며, 아미노말단으로부터 다섯 번째(TM5)와 여섯 번째(TM6) 막횡단 영역을 연결하는 소수성(hydrophobic) 펩티드 사슬이 양이온이 통과하는 pore loop를 형성하는 것으로 추정된다.

막횡단 영역은 단독 또는 다른 TRP 분자들과 함께 일정한 입체구조를 형성하는 데 기여하는 것으로 생각된다.

TRPM7은 많은 종류의 세포막에 존재하고 있고 다양한 기능을 가지고 있다. 세포내 Mg

농도 조절에 관여하고,

신경세포의 어혈손상에 관여하며,

zebrafish의 골격 형성에 관여하고 있음이 밝혀졌다.

또한 꼬마선충에 서의 배변리듬을 조절하고

림프구의 phosphoinositide- 3-kinase 조절에 관여하며,

위장관에서의 운동조절에 관여하고 있다고 알려지고 있다.

세포사멸에도 관여함이 잘 알려져 많은 연구실에서 TRPM7의 역할에 관한 연구가 진행되고 있다.

본 연구에서는 고삼에 의한 유방암 세포인 MCF-7 세포에서의 항암작용과 TRPM7의 관련성을 알아 보았다.

2일과 4일후에 농도에 의존적으로 고삼에 의해 MCF- 7세포가 사멸되는 효과를 보았고 (Figure 1), 이 사멸에 TRPM7 이온통로가 관여함을 밝혔다. 고삼이 TRPM7 전류를 억제시켰고 (Figure 2A) MCF-7세포에서의 TRPM7 전류도 억제시켰다 (Figure 2B). 또한 고삼에 의한 세포사멸에 TRPM7 억제제 투여로 세포사멸이 억제됨도 확인하였다 (Figure 2C). Caspase 3과 sub-G1 analysis를 통해서 세포 사멸에 apoptosis가 관여함을 알 수 있었다 (Figure 3과 4). 또 고삼에 의한 세포독성에 가역성이 존재함을 확인하였고 (Figure 5), 고삼과 doxorubicin과의 병용투여로 doxorubicin만 투여시 보다 좀 더 나은 세포 사멸을 확인 하였다 (Figure 6).

즉, 고삼에 의한 유방암 세포사멸효과를 보았고, 이때

TRPM7 이온통로가 관여하며, 세포사멸은 apoptosis

임을 알 수 있었다. 또 doxorubicin과의 병용투여로 doxorubicin만 투여시 보다 좀 더 나은 세포 사멸을 확인 하였다. 고삼에 항암제 cisplatin투여시 부작용을 감소시켜주는 것으로 항암제 투여환자에게 고삼을 병행투여하면 항암제 부작용이 감소한다는 논문도 보고되어있다.

따라서 고삼과 같은 한약재를 이용한 항암효과에 대한 체계적인 연구가 이루어 진다면, 그리고 항암작용이 있는 고삼을 이용한 건강보조 식품 등이 개발된다면 많은 암환자들의 삶의 질 향상에 도움이 될 것으로 생각된다.

참고문헌

1. 이채형, 노주원. 유방암 선별검사의 최신 지견. 대한산부인과 학회지 2008; 51: 933-942.

2. Lee JH, Yoo D. Meta Analysis of researches about herbal extracts used in breast cancer in South Korea since 2000. 대전대학교한의학연구소논문집 2007;

16: 12-31.

3. 송바다, 김순례, 김성훈, 신용철, 고성규. Butein에 의한 MCF-7 유방암 세포의 세포사멸에 의한 항암효과.

동의생리병리학회지 2010; 24: 385-389.

4. Clapham DE. TRP channels as cellular sensors.

Nature 2003; 426(6966): 517-524.

5. Wykes RC, Lee M, Duffy SM, Yang W, Seward EP, Bradding P. Functional transient receptor potential melastatin 7 channels are critical for human mast cell survival. J Immunol 2007; 179: 4045–4052.

6. Jiang J, Li MH, Inoue K, Chu XP, Seeds J, Xiong ZG. Transient receptor potential melastatin 7-like current in human head and neck carcinoma cells:

role in cell proliferation. Cancer Res 2007; 67:

10929–10938.

7. Abed E, Moreau R. Importance of melastatin-like transient receptor potential 7 and cations (magnesium, calcium) in human osteoblast-like cell proliferation.

Cell Prolif 2007; 40: 849–865.

8. Guilbert A, Gautier M, Dhennin-Duthille I, Haren N, Sevestre H, Ouadid-Ahidouch H. Evidence that TRPM7 is required for breast cancer cell proliferation.

Am J Physiol Cell Physiol 2009; 297(3): C493- 502.

9. 한약조제사고시연구회. 한약재감별능력평가. 학문사 1996.

10. 신민교. 임상본초학. 남산당 1986;314-316.

11. Kee CH. The Pharmacology of Chinese Herbs.

CRC Press 1993: 63.

12. 이현옥, 박남규, 정승일, 김윤철, 백승화. 고삼의 에틸 아세테이트 추출물로부터 항균물질의 분리. 약학회지 2001; 45: 587-590.

13. 조훈, 원성란, 양은영, 김종수, 유일수, 류도곤, 이정호, 강길웅, 백승화. 고삼추출물의 항균효과(I). 약학회지 1999; 43: 419-422.

14. 한지숙, 신동화. Listeria monocytogenes의 증식 억제에 미치는 뽕나무 및 고삼 에틴올 추출물의 분획별 효과. 한국식품과학회지 1994; 26: 539-545.

15. Abbott BJ, Hartwell JL, Leiter J, Perdue REJr, Schepartz SA. Screening data from the Cancer Chemotherapy National Service Center screening laboratories. Cancer Research 1966; 26: 1461- 1656.

16. Ma L, Wen S, Zhan Y, He Y, Liu X, Jiang J.

Anticancer effects of the chinese medicine matrine on murine hepatocellular carcinoma cells.

Planta Med 2008; 74(3): 245-251.

17. Li H, Tan G, Jiang X, Qiao H, Pan S, Jiang H, Kanwar JR, Sun X. Therapeutic effects of matrine on primary and metastatic breast cancer. Am J Chin Med 2010; 38(6): 1115-1130.

18. Liu T, Song Y, Chen H, Pan S, Sun X. Matrine inhibits proliferation and induces apoptosis of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo. Biol Pharm Bull. 2010; 33(10): 1740-1745.

19. Han Y, Zhang S, Wu J, Yu K, Zhang Y, Yin L, Bi L. Matrine induces apoptosis of human multiple myeloma cells via activation of the mitochondrial pathway. Leuk Lymphoma. 2010; 51(7): 1337- 1346.

20. Dai ZJ, Gao J, Ji ZZ, Wang XJ, Ren HT, Liu XX,

Wu WY, Kang HF, Guan HT. Matrine induces

apoptosis in gastric carcinoma cells via alteration

of Fas/FasL and activation of caspase-3. J

Ethnopharmacol 2009; 123(1): 91-96.

21. Jiang T, Zhu Y, Luo C, Lu X, Zhang W, Qiu F, Huang J. Matrine inhibits the activity of translation factor eIF4E through dephosphorylation of 4E-BP1 in gastric MKN45 cells. Planta Med 2007; 73(11): 1176-1181.

22. 통계청. Death Rate. http://kosis.kr/themes/themes_

02List.jsp 2011.

23. 홍기철, 김주연, 공복철, 최창민, 유심근. 삼릉이 자궁 경부암세포(HeLa cell)의 Apoptosis에 미치는 영향.

대한한방부인과학회지 2005; 18(4): 10-23.

24. 최달영. 귀전우(Euonymus alatus(Thunb) Sieb)가 간암세포(Hep3b)와 자궁 암세포 (HeLa)의 성장억제에 미치는 영향에 관한 연구. 동국한의학연구소논문집 1999; 7(2): 155-62.

25. 박경미, 공복철, 이수정, 최창민, 유심근. 자궁경부암세포 (HeLa cell)에서 유향의 세포고사 기전 연구. 대한 한방부인과학회지 2006; 19(2): 92-106.

26. 박종규, 조옥현, 김송백, 조한백. 몰약이 자궁경부암세포 (HeLa cell)의 Apoptosis에 미치는 영향. 대한한방 부인과학회지 2006;19(1):97-110.

27. 최변탁, 김연희, 이동녕, 김형준. 호장근이 자궁경부암 세포의 성장억제 및 세포고사에 미치는 영향. 대한한방 부인과학회지 2006; 19(1): 1-13.

28. 김주연, 조옥현, 최창민, 조한백. 생지황이 자궁경부암 세포(HeLa cell)에 미치는 영향. 대한한방부인과학회지 2006; 19(1): 69-80.

29. 조정훈, 장준복, 이경섭, 박명원. 당귀작약산이 HeLa cell의 증식억제와 사멸에 미치는 영향. 대한한방부인과 학회지. 2006; 19(2): 34-48.

30. 강용구, 안규환, 공복철, 김송백, 조한백. 도인승기탕이 자궁경부암세포(HeLa cell)의 apoptosis에 미치는 영향.

대한한방부인과학회지 2006; 19(2): 77-91.

31. 정경아, 박경미, 조성희. 삼릉 추출물의 인간 유방암 세포 성장 억제 효과. 대한한방부인과학회지 2006; 19(1):

166-77.

32. 박영수, 한지영, 이태균, 김동일. SKBR3 유방암세포주에 대한 귀전우 메탄올 추출물의 성장억제 및 항산화효과.

대한한방부인과학회지 2005; 18(1): 45-54.

33. 용형순, 고성규. 황금의 유방암 세포주에 대한 항암작용.

대한한방내과학회지 2004; 25(3): 451-60.

34. 조정훈, 장준복, 이경섭, 하지연. 반지련이 HeLa Cell의 증식억제와 사멸에 미치는 영향. 대한한방부인과학회지

2006; 19(4): 47-60.

35. 정선, 김형우, 박지은, 김영균, 조수인. 강황 추출물이 유방암 세포주 MCF-7 증식 억제에 미치는 영향.

대한본초학회지 2006; 21(1): 71-7.

36. 신숙정, 이정호. 삼릉, 황금, 살송편버섯 혼합추출물의 항종양 작용. 생약학회지 2004; 35(4): 324-9.

37. 차승만. 항암 및 항세균 생약의 통계학적 연구. 생약 학회지 1977; 8(1): 1-15.

38. Gillman AG, Rall TW, Nies A, Taylor P. Goodman &

Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics.

Maxwell Macmillan 1991; 18: 1202.

39. Hersh EM, Ereish EJ. In Methods in Cancer Research. New York Academic Press 1986.

40. Chung YT, Park ST, Mun YJ, Kim JM, Choi MK, Han DS, Kim B. Cytotoxic effects of actinomycin D, adriamycin and puromycin in the developmental stage of early mouse embryos. J Wonkwang Medical Sci 1987; 3: 13-34.

41. Valcic S, Timmermann BN, Alberts DS, Wächter GA, Krutzsch M, Wymer J, Guillén JM. Inhibitory effect of six green tea catechins and caffeine on the growth of four selected human tumor cell lines. Anticancer Drugs 1996; 7(4): 461-468.

42. 과학백과사전. 약초의 성분과 이용. 일월서각 1991;

344.

43. 김윤경, 한완수, 정승일, 이기남, 김현주, 이정호. Isolation of Antimicrobial Active Substances from Sophorae Radix. 대한예방한의학회지 2005; 9: 135-141.

44. 박선영, 남윤자, 김동현. 고삼 추출액을 이용한 염색 면포의 염색성과 피부 미생물의 억제효과. 한국의류 학회지 2002; 26: 464-472.

45. 권강범, 이호승, 김인수, 김인규, 류도곤. 고삼 추출물이 XO/HX에 의해 손상된 혈관내피세포에 미치는 영향(I).

동의생리병리학회지 2003; 17: 549-552.

46. 백승화, 강길웅, 최은영. 고삼 메탄올 추출물의 향균 효과에 관한 연구. 기초과학연구지 2000; 18: 111- 114.

47. 우무륜, 구영선, 김동희. 고삼이 알러지성 염증 반응에 미치는 영향. 대전대학교 한의학연구원 논문집 2006;

15: 135-148.

48. 류시용. 고삼의 항암활성 및 활성성분에 관한 연구.

대전대학교 한의학연구원 논문집 1997; 5: 503-507.

49. Vannier B, Zhu X, Brown D, Birnbaumer L. The membrane topology of human transient receptor potential 3 as inferred from glycosylation scanning mutagenesis and epitope immunocytochemistry.

J Biol Chem 1998 ;273(15): 8675-8679.

50. Pedersen SF, Owsianik G, Nilius B. TRP channels:

an overview. Cell Calcium 2005; 38(3-4): 233- 52.

51. Schmitz C, Perraud AL, Johnson CO, Inabe K, Smith MK, Penner R, Kurosaki T, Fleig A.

Scharenberg AM. Regulation of vertebrate cellular Mg2+homeostasis by TRPM7. Cell 2003; 114:

191-200.

52. Aarts M, Iihara K, Wei WL, Xiong ZG, Arundine M, Cerwinski W, MacDonald JF, Tymianski M. A key role for TRPM7 channels in anoxic neuronal death. Cell 2003; 115: 863-877.

53. Elizondo MR, Arduini BL, Paulsen J, MacDonald EL, Sabel JL, Henion PD, Cornell RA, Parichy DM. Defective skeletogenesis with kidney stone formation in dwarf zebrafish mutant for trpm7.

Curr Biol 2005; 15: 667-671.

54. Vriens J, Owsianik G, Voets T, Droogmans G, Nilius B. Invertebrate TRP proteins as functional models for mammalian channels. Pflugers Arch.

2004; 449: 213-226.

55. Sahni J, Scharenberg AM. TRPM7 ion channels are required for sustained phosphoinositide 3-kinase signaling in lymphocytes. Cell Metab 2008; 8: 84-93.

56. Kim BJ, Lim HH, Yang DK, Jun JY, Chang IY, Park CS, So I, Stanfield PR, Kim KW.

Gastroenterology 2005; 129: 1504-1517.

57. 김진철, 임성철, 정태영, 서정철, 한상원. 苦參이 항암제

cisplatin의 膵·心臟 부작용 감소에 미치는 영향. 동의

생리병리학회지 2005; 19: 945-949.