J. of Korean Orthopaedic Research Society Volume 8, Number 2, October, 2 0 0 5
인테그린 α vß3, α 5ß1이 골육종 세포의 증식 및 이동에 미치는 영향
서울대학교 의과대학 정형외과학교실, 서울대학교병원 임상의학연구소*
강현귀・김한수・김갑중・김준혁・설소미*・오주한・이상훈・최선종
= Abstract =
Integrin α vß3, α 5ß1 Effects on Cell Proliferation and Migration in Human Osteosarcoma
Hyun Guy Kang, M.D., Han-Soo Kim, M.D.,
Kap Joong Kim, M.D., Jun Hyuk Kim, M.D., So-Mi Seoul*, Joo Han Oh, M.D., Sang Hoon Lee, M.D., Sun Jong Choi, M.D.
Department of Orthopaedic Surgery, Seoul National University College of Medicine;
Clinical Research Institute of Seoul National University Hospital*, Seoul, Korea
Background: We investigate the influence of cell surface adhesion receptor integrin αvß3, α5ß1contributes to proliferation and migration of tumor cell in osteosarcoma for carves out a new treatment model by regulation of integrin roles in human osteosarcoma.
Materials and Methods: We performed proliferation assay, total 11 cell lines including 7 osteosarcoma cell lines established from patients and 4 osteosarcoma standard cell lines. Murine monoclonal anti-α5β1and anti-αv
β3(Chemicon International Inc. Temecula, CA) were used for growth inhibition assays. We also performed cell motility assay by using the Boyden chamber to evaluate the effect of integrin mediated cell migration. We used the HOS standard osteosarcoma cell lines and each separates contained serum free media with mouse IgG1 negative control antibody, anti-α5β1antibody and anti-αvβ3antibody.
Results: Proliferation of cells decreased significantly in 10 out of 11 cell lines when blocking with αvβ3or α5
β1 respectively. Blocking with anti-αvβ3antibody decreased significantly tumor cell proliferation in 10 cell lines. Among the 10 cell lines, 7 cell lines showed significantly more decrease of proliferation with anti-αvβ3 antibody than with anti-α5β1antibody. Blocking with anti-α5β1antibody decreased significantly tumor cell pro- liferation in 10 cell lines. Among the 10 cell lines, 3 cell lines showed significantly more decrease of prolifera- tion with anti-α5β1antibody than with anti-αvβ3antibody. Including statistically not significant 2 cell lines the
※ 통신저자: 김 한 수
서울특별시 종로구 연건동 2 8 서울대학교 의과대학 정형외과학교실
TEL: 02) 2072-2362 FAX: 02) 764-2718 E-mail: [email protected]
✽ 본 논문의 요지는 2 0 0 5년 대한 골관절 종양학회 춘계학술대회에서 구연되었음.
서 론
원발성 뼈 암 중 골육종은 가장 흔히 발생하는 종양으로 우리나라에서는 4 0 ~ 5 0 %를 차지한다.
소아와 청소년기에 호발하고 성장이 왕성한 부위 인 대퇴골 원위부, 경골 근위부, 상완골 근위부 등에 주로 발생한다. 폐로 가장 흔히 전이되는데, 종양 발생 후 비교적 초기에 전이가 발생하므로 2 0여년 전만해도 5년 생존율이 20% 전후이었으 나 최근에는 진단 및 수술 방법이 발달하고, 무엇 보다도 항암 화학요법의 발전으로 인하여 5년 생 존율이 약 6 5 ~ 8 0 %로 보고되고 있다. 골육종에 서 항암제에 대한 종양조직의 괴사 정도가 가장 신뢰할 수 있는 예후 인자라고 보고되고 있으나 항암제에 대한 골육종의 반응을 예측할 수 있는 방법은 아직 밝혀진 바가 없고 최근 생존율도 더 이상 증가 되지 않고 있는 시점에서 뼈 암 치료의 새로운 타겟을 찾는 것은 항암제만으로 더 이상의 생존율 향상을 기대하기 어려운 시점에서 매우 의 미 있는 시도라고 생각된다.
암이 성장과 전이를 하기 위해서는 일차적으로 종양 세포와 내피 세포들이 주변 조직으로 침윤과 이동이 일어나야 한다. 세포 외 기질 ( e x t r a - c e l- lular matrix, ECM)과 종양 세포 표면 수용체 들의 부착 및 상호작용이 성장, 침윤, 전이에 있어 필수적인 것으로 알려져 있다5 ). 하지만 종양 세포 의 종류에 따라 세포 외 기질에 직접적이 부착 없 이도 생존이 가능하도록 특수한 역할의 세포 부착 물질에 의한 다양한 신호 전달 체계 들도 있다.
세포의 침윤과 이동은 세포 외적뿐만 아니라 세 포 내적 수준에서도 지배되어지며 세포 외 기질 등과 역동적인 상호작용으로 조심스럽게 균형을
이루는데, 침윤 동안 세포는 단백 분해 효소를 분 비하여 세포 외 기질을 파괴하고 재형성시켜 세포 가 쉽게 기질을 통과 하여 새로운 조직 안으로 이 동 하게 되는 것이다.
인테그린은 1 8개의 α와 8개의 ß 단위로 구성 된 세포 표면 수용체 역할을 하는 단백질로 이들 의 조합으로 약 2 5개의 서로 다른 쌍을 이루는 이 형복합체가 알려져 있어 세포가 다양한 세포 외 기질을 인식하여 반응 할 수 있다고 하였다1 5 ). 인 테그린은 세포-세포간, 세포-세포 외 기질간의 상 호반응, 세포구조, 분화, 증식, 세포의 이동성 및 침윤, 종양 세포의 사멸7 )과 발달 등 세포의 많은 과정에서 중요한 역할을 하며, 종양의 진행 및 전 이 과정에 미치는 영향도 광범위하게 연구 되어지
고 있다1 3 , 1 6 ). 생체 밖 또는 생체 내 실험들에서 인
테그린 발현이 종양의 악성화에 동반됨을 보여주
었고1 2 ), 종양의 침윤성 및 전이 성향에도 인테그
린 발현이 동반된다고 하였다3 , 1 4 ). 특히 인테그린 αvß3는 fibronection, fibrinogen, von- Willebrand factor, vitronection, 그리고 c o l- l a g e n과 l a m i n i n등 다양한 세포 외 기질 분자들 과 결합하게 되는 반면에 인테그린α5ß1은 선택 적으로 fibronectin 과 결합하게 된다1 5 ). 인테그 린은 세포 부착을 조절 하는 것 외에도 세포형태 와 생존, 증식 이동, 세포 전사에 대한 분자신호 전달에 중요 역할도 하게 된다고 하였다1 ).
인테그린 αvß3는 악성 흑색종 세포의 고도의 침윤성과 신생 혈관형성 과정에서 높은 발현을 보 이는 반면 종양 전 단계의 흑색종 세포와 이들 혈 관 등에는 낮은 발현을 보인다고 하였으며2 ), 전이 성형이 높은 세포주에서 높은 발현을 보인다고 하 였다.
αvß3 인테그린은 신생혈관에서 높은 발현을 growth inhibition of osteosarcoma cell lines was more obvious (10 out of 11) in blocking with anti-αvβ3anti- body. The migration of cells was significantly decreased when blocked with anti-α5β1antibody and anti-αvβ3 antibody.
C o n c l u s i o n: Under the based on the integrin αvß3, α5β1are central role on proliferation and migration of osteosarcoma cells, we could be more approach to new therapeutic endeavors with antibody to integrin αvß3, α5β1 molecular target of osteosarcoma.
Key Words: Osteosarcoma, Proliferation and migration, Integrin αvß3, Integrin α5β1
보이지만 정상 조직에서는 거의 발견이 안되며 암 조직에서는 많이 발현되며 유방암의 예후에 나쁜 영향을 미치는 것으로 보고 되었다6 ). 인테그린 α5 ß1과 이들 결합부 f i b r o n e c t i n은 종양의 성장 인자에 의해 형성되는 신생 혈관에서 의미 있게 증가되어 보이며, 이들을 차단하는 인테그린 α5ß 1과 f i b r o n e c t n의 항체에 의해 종양의 혈관 생성 이 억제 됨이 보고 되었다8 ).
이러한 인테그린의 역할 및 종양 특성에 대한 영향에 착안하여 이들의 기능을 차단하여 치료에 이용하려는 시도가 연구되고 있는데, Vitaxin (항-αvß3 항체)은 혈관 내피세포의 세포 사멸을 유도하여 신생 혈관형성을 방해하고 이로써 종양 성장 및 전이를 막을 수 있다고 하였고, AIIB2 (항-ß1 인테그린 억제 항체)를 유방암 치료에 시 도되고 있는 등 항암약제 내성을 가지는 종양의 새로운 치료 방법으로의 가능성에 대하여 연구되 고 있다. 골 육종에서도 한계에 이른 기존 항암 제들 이외에 종양의 진행을 억제하려는 다른 개념 의 치료 방법으로 이미 도입된 것 중 대표적인 것 이 HER2 (epidermal growth factor recep- tor type 2)에 대한 단일클론 항체 ( m o n o c l o n a l a n t i b o d y )인데 임상 시험 중이지만 현재까지의 결과는 그리 희망적이지 않다고 보고되고 있으나 이러한 시도는 항암제만으로 더 이상의 생존율 향 상을 기대하기 어려운 시점에서 매우 의미 있는 시도라고 생각된다.
이에 저자는 종양의 악성화 및 전이는 세포 부 착 의존성의 감소 또는 소실 등으로 가능하다는 전재 하에, 이에 연관된 인테그린 αvß3, α5ß1 이 골육종 세포의 증식 및 이동에 미치는 영향에 대해 알아보고 새로운 골육종 치료의 타겟으로의 가능성에 대해 연구 하고자 하였다.
대상 및 방법
환자로부터 얻은 7개의 골육종 세포주와 4개의 스탠다드 골육종 세포주(HOS, U-2OS, MG- 63, Saos-2)를 이용 총 1 1개의 세포주를 대상으 로 하였다. 뮤린 단일클론 αvß3, α5ß1 항체를 인테그린 기능 차단을 위해 사용하였다. 인테그린 의 기능을 차단 한 후에 이들 1 1개의 세포주에서
세포 증식도를 측정하였고, HOS 표준 골육종 세 포주에서 Boyden chamber를 이용하여 세포의 이동성을 측정 하였다.
1. 골육종 세포주 배양
골육종 조직을 항암치료 전 조직 검사 수술 후 즉시 무균적으로 모아서 잘게 자른 후 0 . 2 % proteinase (sigma, P-5147)로 처리한 후 3 7℃
에서 3 0분간 s h a k i n g하면서 i n c u b a t i o n한다.
그런 후 0 . 2％ collagenase (sigma, C-9891)로 바꿔 처리한 후 3 7℃에서 2 ~ 3시간 흔들면서 배 양시킨다. 그런 다음 sterile filter를 통과시킨 다음, 원심분리 후 m e d i a를 제거하고 새로운 media (D-MEM with 10% FBS, penicillin
& streptomycin, GIBCO, USA)에서 배양한 다. 5~7일 간 배양한 후, 0.05% trypsin이 섞 인 E D T A 4 N a로 분리하여 s u b c u l t u r e한다. 스 탠다드 세포주로는 HOS, U-2OS, MG-63, S a o s - 2를 이용하였다.
2. 성장억제 분석 (Growth inhibition assay)
각 골육종 세포를 1.5 ml micro-tube에 seeding (2.5х1 04/100 μl )하기 위해 모두 모은 뒤 희석한 차단 항체 인테그린 αvß3 (CHEMI- COM, GEM1976), 인테그린 α5ß1 (CHEMI- COM, MAB1969)를 각각 10 μg / m l이 되게 사 용하여 처리한 후 3 0분간 3 7℃에서 r o t o r를 사 용하여 잘 섞어주었다. 대조군으로는 m o u s e IgG1 (10 μg/ml, SEROTEC, MCA928)를 사 용하였다.
3. 세포 증식도의 측정 (proliferation assay)
골육종 세포들을 96-well microtiter plates에 분주하여 3시간 배양하며, 각 w e l l에는 1 0 % F B S가 포함된 D-MEM 배지 1 0 0 μl를 채운다.
세포들이 p l a t e에 부착될 수 있도록 3 7℃에서 3 시간 동안 배양한 후, 부착되지 않은 세포들을 제 거하기 위해 P B S로 각각의 w e l l을 세 차례씩 w a s h i n g하였다. 배지를 제거하고 F B S가 첨가되
지 않은 D-MEM 배지를 1 0 0 μl 채운 후 M T S sol. (PROMEGA, G-3581)을 2 0 μl씩 w e l l에 넣고 3 7℃에서 3 ~ 4시간 incubation 후 490 nm 에서 흡광도를 측정하였다(microplate reader, B i o - T e k ) .
4. 세포 이동성 측정
(Boyden chamber assay)
세포가 g e l a t i n으로 코팅된 f i l t e r를 통과하여 이동하는 정도를 관찰하기 위해 boyden cham- ber (Neuro Probe Inc., MD, USA)를 이용하 였다. 8 μm 크기의 구멍을 가진 p o l y c a r b o n a t e filter (OSMONICS, INC.)를 1% gelatin으로 overnight 코팅한 후 실온에서 건조시켰다. 표준 골육종 세포인 HOS 세포를 mouse IgG1 nega- tive control antibody (Serotec Ltd, UK), 인테그린 α5ß1 항체 (Chemicon International Inc., Temecula, CA), 인테그린 αvß3 항체
( C h e m i c o n )가 각각 3 0 μg/ m l씩 첨가된 s e r u m free medium에 세포수가 2×1 06/ m l이 되도록 suspension 시킨 후 3 7℃에서 3 0분 동안 p r e i n- c u b a t i o n하였다. Boyden chamber의 l o w e r c h a m b e r에 a t t r a c t a n t로 10% FBS가 포함된 배지를 2 8 μl씩 첨가하고 그 위에 미리 c o a t i n g 해 놓은 f i l t e r를 얹었다. Upper chamber에 미 리 준비해 놓은 cell suspension을 5 5 μl씩 첨가 하고 3 7℃에서 4시간 i n c u b a t i o n하였다. Upper c h a m b e r에서 lower chamber로 이동한 세포를 diff-quik stain solution (Dade Behring Inc., Newark, USA)을 이용하여 염색한 후 세 포 수를 측정하였다.
결 과 1. 세포증식에 대한 분석
인테그린 αvß3, α5ß1을 차단한 1 1개의 골육
Fig. 1. The number of proliferated cells estimated by Microplate reader. Data is the mean±SD of three determina- tions every each in the 11 osteosarcoma cell lines. Illustration shows that αvβ3 blocking groups are signifi- cantly decreased of proliferation in 10 osteosarcoma cell lines and 7 lines among them are more decreased than blocking α5β1 groups.
종 세포주중 1 0개 군에서 의미 있게 세포증식이 감소됨이 보여졌다. 인테그린 αvß3를 차단 하였 을 때 역시 종양세포 증식의 감소가 1 1개의 세포 주 중 1 0개의 세포주에서 관찰되었으며, 이중 7 개의 세포주에서는 인테그린 α5ß1를 차단 하였 을 때 보다 더욱 현저한 증식의 감소를 보였다.
인테그린 α5ß1를 차단한 골육종 세포주에서도 1 0개의 세포주에서 증식의 억제가 관찰되었으며, 이중 3개의 세포주(Fig. 1: p2, p7, SaOS-2) 에서는 αvß3를 차단 하였을 때 보다 더 많은 증 식의 감소를 보였다(Fig. 1).
2. 세포 이동성에 대한 분석
HOS 표준 골육종 세포주를 4개의 그룹으로 나 누어 아무것도 처리하지 않은 군과 대조군으로 mouse IgG1 항체로 처리한 군 그리고 인테그린 αvß3와 α5ß1을 차단 한 후에 각각 을 b o y d e n c h a m b e r를 통과 시킨 다음 이동된 세포 수를 관 찰 하였을 때, 인테그린 αvß3, α5ß1차단 군에 서 의미 있게 종양 세포의 이동이 감소 되었다 (Fig. 2).
고 찰
종양학적인 면에서 보면 세포의 전이와 내피세
포의 혈관형성적 변이는 세포 외 기질들의 변화가 일어나야만 가능하게 되는데 세포 표면 분자인 인 테그린이 이들 과정을 중계하게 된다. 인테그린계 의 세포부착 단백질은 초기 세포와 세포 외 기질 간의 상호작용에서 부착 의존성 성장( a n c h o r- age-dependent growth), 세포사멸, 분화, 세 포의 이동 및 전이 등에 있어서 주 역할을 하여 실제 악성종양의 특징인 조절불가( d y s r e g u l a- t i o n )가 가능할 수 있게 되었다. 인테그린은 또한 단백질 분해효소들을 활성화시켜 주위조직의 초기 방어막인 기저막의 붕괴를 조절할 수 있는데 이들 기저막들은 laminin, collagen, proteoglycan 등의 단백질 복합체로 구성된 세포의 비세포성 지 지체이다. 실제 이들 기저 막의 형태 및 구조의 파괴 와 변형은 종양의 암 성 침윤에 중요 조직학 적인 표식이 될 수 있다.
MMP (matrix metalloproteinase)는 세포주 위 단백 분해 효소 군으로 MMP-2, MMP-9은 특히 기저 막의 주 구성 물질인 type 4 콜라겐에 대한 높은 효소 활성화를 가진다4 , 9 ). 인테그린 은 직접적으로 collanase MMP-2에 부착하여 세포 의 표면에서 단백질 분해를 시킬 수 있는 활성화 된 형태가 된다고 햄스터의 흑색종 연구에서 밝혔 고2 ), 세포 이동이 쉽도록 기질을 파괴시키고 세포 의 이동성을 조절하여 세포 침윤을 쉽게 유도 한 다고 하였다. 혈관 표면에서의 인테그린 αvß3
Fig. 2. Migration of HOS cells: effects of different integrins. The number of cells indicated is the mean±SD counted per well.
*, p < 0.1; **, p < 0.001
수용체와 M M P - 2와의 관련성2 )이 밝혀지는 등, 세포 외 기질을 녹일 수 있는 M M P - 2에 의한 종 양 의 성장 및 침윤과 전이 능력들이 인테그린에 의해 조절된다1 1 ).
인테그린 수용체의 발현 정도에 따라 종양세포 의 성장속도가 변화한다는 보고들 중 Varner 등 은 대장암 세포에서 인테그린 α5ß1의 발현이 종 양의 증식을 억제하는 효과를 보인다는 상반된 연 구결과를 발표 한 반면 Felding 등의 연구에서는 인테그린 αvß3의 결핍은 종양의 증식을 억제하 였다고 보고 하였다. 인테그린 αvß3가 혈관 성 장인자를 통하여 혈관 내피세포의 상승조절1 0 )을 하는 것으로 보이며, 인 테 그 린 α5ß1도 f i b r o n e c t i n과 결합하여 혈관형성을 조절8 ) 한다 고 하였고 이를 토대로 항 혈관형성치료( a n t i - angiogenic therapy)의 타겟이 확립되고 있다
사람의 골육종에서 인테그린의 세포증식과 이동 에 연관된 분자 생물학적 기전에 대해서는 거의 알려진 바 없지만, 본 연구결과에 따르면 인테그 린 αvß3, α5ß1이 골육종 세포의 증식과 이동에 주 영향을 미치는 것으로 보인다. 본 연구에서 항 암약물 치료에 따른 골육종세포의 형태 및 기능의 변화를 최소화 하기 위해 항암제 치료 전 수술적 조직검사에서 얻은 조직을 7명의 환자로부터 얻어 세포 주를 확립하였고, 상품화된 표준 골육종 세 포 주 간에도 간혹 다른 실험 결과를 보일 수 있 다는 생각에 4가지 종류의 표준 세포 주를 연구에 포함 시켰다. 골육종 세포 증식 면에서 보면 총 1 1개의 세포 주중 1 0개 주에서 인테그린 차단한 군에서 차단 하지 않은 대조 군에 비해 의미 있는 증식의 감소로 보여 골육종에서도 인테그린이 종 양학적 특성에 중요한 역할을 하는 것으로 판단 된다. 이중 인테그린 α5ß1를 차단한 군보다 αv ß3를 차단한 군의 7개의 세포 주에서 현저한 증 식의 감소가 일어 났다. 3개의 세포 주(Fig. 1:
p2, p7, Saos-2)에서는 α5ß1을 차단한 군이 αv ß3를 차단한 군보다 증식의 감소를 보였지만 통 계적으로 유의한 차이( P < 0 . 0 0 5 )는 없었다. 이와 같은 결과를 종합해 보면 골육종 세포의 증식에는 인테그린 αvß3가 α5β1 보다 더 많은 관련이 있 는 것으로 생각 된다.
HOS 세포 주를 아무것도 처리하지 않은 군,
mouse IgG1 항체로 처리한 군, 인테그린 αvß3 를 차단한 군, α5ß1을 차단한 군으로 나누어 실 험한 세포이동에 대한 결과에서 인테그린의 기능 을 차단한 2개의 군 모두 대조 군들에 비해 이동 된 세포수가 현저히 감소됨을 면역조직화학염색을 통해 관찰 할 수 있었다. 이 경우 골육종 세포의 이동 면에서는 인테그린 αvß3, α5ß1 차단 군 간에 유의한 차이 없이 모두에서 세포이동의 감소 가 현저하게 보여져 전술한 Varner 등의 대장암 세포에서의 연구와는 달리 골육종에서는 인테그린 α5ß1도 종양의 증식 및 이동을 촉진하는 역할을 하는 것으로 보인다.
최근의 연구에서 변화된 세포-기질간 상호작용 은 유전적 안정성을 조절하는 여러 기전을 억제 조절함으로서 암의 발생에 영향을 줄 수 있다고 보고되고 있다. 이는 인테그린에 의해 매개된 세 포의 부착 능력이 세포로 하여금 변이를 만들게 하고, 악성 변환이 가능하게 하는 기전을 제공하 는 것이 아닌가 의심하게 하며, 이 가설이 받아들 여 진다면 인테그린에 대한 항체를 이용하여 암세 포의 국소 침습이나 원격 전이, 빠른 성장을 억제 함은 물론, 암세포의 발생을 초기에 방지하는 효 과까지 얻을 수 있을 것으로 기대 된다.
결 론
단일클론 항-인테그린 αvß3 항체를 이용하여 골육종 세포의 증식 및 이동을 억제할 수 있다는 가능성을 확인하였으며, 골육종 에서는 α5ß1보 다 αvß3 인테그린이 종양세포의 증식과 연관된 주 수용체로 여겨지고, 인테그린 αvß3, α5ß1 모두에서 종양세포의 이동과 연관된 주 수용체로 작용한다는 사실을 알게 되었다. 따라서 이들 인 테그린의 신호전달 과정에 대한 억제방법은 골육 종 환자의 새로운 치료의 타겟이 될 수 있을 것으 로 생각 되며, 이들과 연관된 ILK (Integrin linked kinase)와 MMP (Matrix metalpro- t e i n a s e )등 좀더 많은 연구로서 종양특성을 다방 면에서 억제할 수 있는 분자 생물학적인 물질을 찾는 것이 앞으로의 과제라고 생각 한다.
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