KOREAN J. FOOD SCI. TECHNOL. Vol. 44, No. 6, pp. 759~762 (2012) http://dx.doi.org/10.9721/KJFST.2012.44.6.759
759
©The Korean Society of Food Science and Technology
Ovalbumin에 의해서 유도된 inducible nitric oxide synthase 발현에 대한
phenethyl isothiocyanate의 억제효과
신화정
1·윤형선
1,2*
1순천향대학교 의료과학대학 의료과학과, 2순천향대학교 의료과학대학 임상병리학과
Phenethyl Isothiocyanate Inhibits Ovalbumin-induced Inducible
Nitric Oxide Synthase Expression
Hwa-Jeong Shin1 and Hyung-Sun Youn1,2*
1Department of Medical Science, College of Medical Sciences, Soonchunhyang University 2Department of Biomedical Laboratory Science, College of Medical Sciences, Soonchunhyang University
Abstract Egg allergies have been reported as one of the most prevalent food hypersensitivities in the pediatric population. One of the major egg allergens is ovalbumin (OVA), which is the major protein in the egg whites. Phenethyl isothiocyanate (PEIC) from cruciferous vegetables has an effect on anti-inflammatory therapy. In the present report, we show that PEIC inhibits the nuclear factor-κB (NF-κB) activation induced by OVA. PEIC also inhibits the OVA-induced inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression and nitrite production. However, PEIC did not suppress the cyclooxygenase-2 (COX-cyclooxygenase-2) expression induced by OVA. These results suggest that PEIC has the specific mechanism for anti-inflammatory responses and efficient anti-allergic activities.
Keywords: egg allergy, inducible nitric oxide synthase, NF-κB, ovalbumin, phenethyl isothiocyanate
서
론
천연물 중에는 박테리아나 바이러스 병원균과 같은 여러 pro-inflammatory 자극에 의해서 유도된 전사인자 nuclear factor-κB(NF-κB)의 활성화를 억제시키며 항염증·항알러지 효과를 가 지고 있는 여러 기능성 물질들이 있다(1-5). 그 중에서도 꽃양배 추(cauliflower)와 같은 십자화과 식물(cruciferous vegetables)에 풍 부한 phenethyl isothiocyanate(PEIC)(Fig. 1A)가 있다. PEIC는 폐 (lung), 식도(esophagus), 젖샘(mammary gland), 간(liver), 소장 (small intestine), 방광(bladder)에 생긴 암을 억제시키며(6), matrix metalloproteinase-2(MMP-2)의 억제에 의한 HT29 colon 암세포의 이동(migration)과 침윤(invasion)을 억제시킨다(7). 또한 PEIC는 대 식세포에서 lipopolysaccharide(LPS)에 의해 유도된 inducible nitric oxide synthase(iNOS)의 발현을 억제하여 nitric oxide(NO)의 생성 을 억제시키는 것으로 보고되었다(8).
식품 알러지(Food allergies)는 식품 단백질에 의해 아토피 피부 염(atopic dermatitis), 알러지 위장관계 질환(allergic gastrointestinal disorders)와 같은 즉각적이며, 생명을 위협하는 만성질환을 유도 하는 부작용적인 면역반응이다(9). 식품 알러젠(allergen)으로 우 유, 계란, 땅콩 등이 있으며, 이 중 계란은 알러지 유발 위험성 이 높은 음식이지만 가공적성이 우수하고, 가격이 싸기 때문에 계란을 이용한 음식들이 많아지면서 오늘날 식생활에서 널리 이 용되고 있는 식품이다. 계란 흰자 단백질 안에는 주요한 계란 알 러젠으로 ovalbumin(OVA)이 있다(10). 45 kDa의 분자량을 가지고 있는 OVA는 계란 흰자 단백질 중 약 54%로 가장 많은 비율을 차지하고 있는 인당단백질(phosphoglycoprotein)이다(11). 식품 알 러지를 예방하기 위해서는 원인 식품의 섭취를 피해야 하지만, 오히려 계란을 이용한 음식들이 많아지면서 계란에 의한 알러지 발생은 증가하고 있는 추세이다. 최근에는 식품 알러지를 억제시 키기 위해서 계란과 같이 섭취가 불가피한 경우는 알러젠들의 항 원성을 낮추어서 알러지를 최대한 억제시키는 방법이 연구되고 있다. 염증은 여러 분자학적인 기전에 의해서 유도되는데, 그 중에서 도 두 가지 중요한 반응에 의해서 일어나는 것으로 알려져 있다. 하나는 cyclooxygenase-2(COX-2)에 의한 prostaglandins(PGs)의 생 성이고, 다른 하나는 iNOS에 의한 NO의 생산이다(12,13). 염증 이 발생하는 동안 PG나 NO의 생성이 증가하며, 증가된 PG나 NO는 고초열(hay fever), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 관절염 (rheumatoid arthritis), 알츠하이머(Alzheimer’s disease), 암(cancer) 과 같은 여러 질병을 유도하는 것으로 알려져 있다(14,15). 우리는 선행연구에서 OVA가 NF-κB를 활성화 시키며, 활성화 된 NF-κB에 의해서 유도되는 단백질인 COX-2와 iNOS의 발현 을 유도하는 것을 알아내었다(16). 따라서 이번 연구를 통해서 PEIC가 OVA에 의해서 유도된 NF-κB 활성화와 활성화된 NF-κB 에 의해서 유도되는 유전자인 COX-2와 iNOS의 발현을 어떻게 조절하는지 알아보고자 하였다. 이러한 연구는 앞으로 계란 알러 젠에 의한 알러지 예방 및 치료제 개발을 위해 반드시 필요할 것 *Corresponding author: Hyung-Sun Youn, Department of
Biomedi-cal Laboratory Science, College of MediBiomedi-cal Sciences, Soonchunhy-ang University, Asan, Chungnam 336-745, Korea
Tel: 82-41-530-3086 Fax: 82-41-530-3085 E-mail: [email protected]
Received August 1, 2012; revised September 4, 2012; accepted September 14, 2012
760 한국식품과학회지 제 44 권 제 6 호 (2012) 으로 생각한다.
재료 및 방법
재료
실험에 사용한 OVA와 PEIC는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA) 회사로부터 구입하였다. LPS는 List Biological Lab(San Jose, CA, USA) 회사로부터 구입하였다. COX-2와 β-actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA), iNOS 항체는 BD Biosciences(San Jose, CA, USA)로부터 구입하였다. 그 밖의 다른 시약들은 따로 언급이 없는 한 Sigma-Aldrich로부터 구입하 였다.
세포 배양
RAW 264.7 cells(a murine marcrophage cell line, ATCC TIB-71)은 10% (v/v) FBS, 100 units/mL penicillin, 100 mg/mL strep-tomycin, Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)에서 5% CO2/air를 포함하고 있는 37oC 배양기 안에서 배양하였다. Plasmid
NF-κB발광 plasmid는 F. Mercurio(Signal Pharmaceuticals, San Diego, CA, USA)로부터 제공받았으며, iNOS와 COX-2 발광 plas-mid는 Daniel Hwang(University of California, Davis, CA, USA) 으로부터 제공받았으며, heat shock protein(HSP) 70-β-galactosidase plasmid는 R. Modlin(University of California, Los Angeles, CA, USA)으로부터 제공받았다. Transfection을 위한 모든 plamid DNAs 는 EndoFree Plasmid Maxi kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 준비하였다.
트랜스펙션(transfection)과 발광효소 유전자 분석(luciferase reporter gene assay)
트랜스펙션을 이용한 발광효소 유전자 분석법은 선행연구에서 사용한 방법에 의하여 분석하였다(1,2). 발광효소 plasmid DNA와 HSP70-β-galactosidase plasmid DNA를 세포 안으로 트랜스펙션 시키기 위하여 Superfect transfection(Qiagen, Valencia, CA, USA) 시약을 사용 하였다. Luciferase assay system(Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 발광효소 활성화를 측정하였으며, β-galac-tosidase의 활성화를 측정하여 발광효소 활성화 정도를 표준화시 켰다.
Western blotting
세포로부터 추출된 단백질들은 sodium dodecyl sulfate-polyacry-lamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 이용한 방법에 의해 분리 되었으며, polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane으로 전기영 동 방법에 의해서 이전되었다(17,18). PVDF membrane은 0.1% Tween 20과 5% 탈지 건조된 우유를 포함하고 있는 phosphate-buffered saline 용액 안에서 blocking 하였으며, 원하는 1차 항체 를 가지고 blotting하였다. 다음으로 PVDF membrane은 horserad-ish peroxidase와 복합된 2차 항체에 노출시킨 다음, iNtRON Western blot detection system(Seongnam, Korea)을 사용하여 원하 는 단백질의 발현 정도를 규명하였다.
데이타 분석
각각의 데이타 값은 한 세트가 세 벌의 실험으로 얻어졌으며, mean ± standard error mean(SEM)으로 표현되었다.
결과 및 고찰
PEIC는 OVA에 의해서 유도된 NF-κB 활성화를 억제한다. 우리는 선행연구에서 OVA이 염증 및 면역반응을 위해서 중요 한 역할을 하는 전사인자인 NF-κB를 활성화 시키며, 활성화된 NF-κB에 의해서 유도되는 염증 유발 단백질인 iNOS와 COX-2 의 발현을 유도하는 것을 밝혀내었다(16). 이번 연구에서는 십자 화과 식물 추출물 중의 하나인 PEIC가 계란 알러젠인 OVA에 의 해서 유도된 NF-κB 활성화 및 iNOS와 COX-2 발현을 억제시켜 알러지 예방 효과를 가지고 있는지 알아보았다. 첫 번째 실험으 로 PEIC가 OVA와 LPS에 의해서 유도된 NF-κB 활성화에 어떠 한 영향을 미치는지 알아본 결과, PEIC는 OVA와 LPS에 의해서 유도된 NF-κB 활성화를 억제하였다(Figs. 1B, 1C).PEIC는 OVA에 의해 유도된 iNOS 발현을 억제한다. 다음 실험으로 PEIC가 iNOS 발현에 어떠한 영향을 미치는지 iNOS 발광효소 유전자 분석법과 Western blotting 방법을 이용하 여 알아보았다. PEIC는 OVA와 LPS에 의해서 유도된 iNOS의 발 현을 억제시켰다(Figs. 2A-2D). 또한 PEIC는 OVA와 LPS에 의해 서 유도된 iNOS의 생성물인 nitrite의 생성을 억제시켰다(Figs. 3A, 3B).
PEIC는 OVA에 의해서 유도된 COX-2 발현을 억제하지 않는다. 다음으로 우리는 PEIC가 NF-κB 활성을 통해 조절되는 유전자 중 또 다른 하나인 COX-2 발현을 확인하였다. 우리는 선행연구 에서 PEIC가 LPS에 의해서 유도된 COX-2의 발현을 억제하지 못하는 것을 밝혀내었다(16). 이번 연구에서도 PEIC는 OVA에 의 Fig. 1. PEIC suppresses the activation of NF-κB induced by OVA or LPS. (A) The structure of phenethyl isothiocyanate (PEIC). (B,C) RAW 264.7 cells were transfected with NF-κB-luciferase reporter plasmid and pre-treated with PEIC (10, 15µM) for 1 h and then treated with OVA (100µg/mL) (B) or LPS (10 ng/mL) (C) for an additional 8 h. Cell lysates were prepared and luciferase and β-galactosidase enzyme activities were measured as described in Materials and Methods. Relative luciferase activity (RLA) was normalized with β-galactosidase activity. Values are mean±SEM (n=3) of 3 independent experiments in triplicate. *Significantly different from OVA alone, p<0.01 (**) (B). +, Significantly different from LPS alone, p<0.05 (+), p<0.01 (++) (C). Veh, vehicle; PEIC, phenethyl isothiocyanate; OVA, ovalbumin; LPS, lipopolysaccharide.
PEIC에 의한 iNOS억제 761
해서 유도된 COX-2 발현을 억제하지 못하는 것을 Western blot-ting 방법으로 확인하였다(Fig. 4A). PEIC는 또한 LPS에 의해서 유도된 COX-2 발현을 억제시키지 못하였다(Fig. 4B)
NF-κB는 염증을 유발하는 타깃 유전자의 빠른 활성과 다양한 병원체의 자극에 의하여 활성화 된다(19). 그러므로 NF-κB 활성 억제는 항염증 치료제 개발에 중요한 전략으로 여겨진다. 이번 연구에서 우리는 염증을 유발하는데 중요한 요소인 NF-κB 활성
화 및 관련된 두 가지 효소인 COX-2와 iNOS 발현을 PEIC 가 조절할 수 있는지 연구하였다. PEIC는 OVA에 의해서 유도된 NF-κB 활성화는 억제하였다. 그러므로 PEIC가 OVA에 의해서 유도 된 iNOS와 COX-2의 발현을 모두 억제 시킬 것이라고 기대하였 다. 그러나 PEIC는 OVA에 의해 유도된 iNOS 발현은 억제하였 지만, COX-2 발현은 억제하지 못하였다. 이러한 결과는 iNOS와 COX-2 유전자들이 다른 메커니즘에 의해 조절된다는 것을 제안 한다. LPS에 의해 유도된 대다수의 유전자들은 Toll-like receptors (TLRs)의 TRIF-dependent 신호전달체계를 통하여 조절되는 것으 로 알려져 있다(20). 또한 LPS에 의해 유도된 iNOS 발현의 대부 분은 TLRs의 TRIF-dependent 신호전달체계에 의해 조절된다고 보고되었으며(21), COX-2 발현의 대부분은 TLRs의 MyD88-depen-dent 신호전달 체계에 의해 조절된다고 보고되었다(22). PEIC는 OVA에 의해서 유도된 iNOS발현은 억제하였지만, COX-2 발현은 억제하지 못하였다. 이 모든 결과들은 PEIC가 TRIF-dependent 신 호전달체계만을 조절할 수 있다는 것을 보여준다고 할 수 있겠 다. 미래에는 PEIC가 TLRs의 TRIF-dependent 신호전달체계를 어 떻게 조절하여 iNOS의 발현을 억제시키는지 그 작용기전 및 분 자학적인 타깃을 규명하고자 한다. 우리는 처음으로 PEIC가 OVA에 의해 유도된 NF-κB 활성과 iNOS의 발현은 억제하지만, COX-2 발현은 억제하지 않는다는 것을 밝혀내었다. 이러한 모든 결과들은 백신 제조 및 항알러지 제 개발에 있어서 새로운 패러다임을 제공할 것으로 기대한다.
요
약
이번 실험을 통하여 PEIC가 OVA에 의해 유도된 NF-κB 활성 과 iNOS, COX-2 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아 보았다. PEIC는 OVA에 의해 유도된 NF-κB 활성을 억제시켰다. 또한 PEIC는 OVA에 의해 유도된 iNOS의 발현도 억제시켰다. 하지만 PEIC는 OVA에 의해 유도된 COX-2 발현은 억제시키지 못하였 다. 이러한 결과는 iNOS와 COX-2가 서로 다른 메커니즘에 의해 조절된다는 것을 암시한다. 또한 PEIC는 알러지와 같은 만성적 인 질병들을 조절할 수 있는 치료제 개발 및 백신 제조에 중요 한 역할을 할 것으로 기대한다.감사의 글
본 연구는 순천향대학교 학술연구비의 일부 지원으로 수행하 였으며 지원에 감사 드립니다.Fig. 2. PEIC inhibits iNOS expression induced by OVA or LPS. (A,B) RAW 264.7 cells were transfected with iNOS luciferase reporter plasmid and pretreated with 10 or 15µM PEIC for 1 h and then treated with OVA (100µg/mL) (A) or LPS (10 ng/mL) (B) for an additional 8 h. Cell lysates were prepared and luciferase enzyme activities were determined. Values are mean±SEM (n=3) of 3 independent experiments in triplicate. *Significantly different from OVA alone, p<0.01 (**) (A). +, Significantly different from LPS alone, p<0.01 (++) (B). C,D) RAW 264.7 cells were pretreated with 10 or 15µM PEIC for 1 h and then further stimulated with OVA (100µg/mL) (C) or LPS (10 ng/mL) (D) for 8 h. Cell lysates were analyzed for iNOS and β-actin protein by immunoblots. Results are one representative data from three independent experiments.
Fig. 3. PEIC inhibits nitrite production induced by OVA or LPS. (A,B) RAW 264.7 cells were pretreated with 10 or 15µM PEIC for 1 h and then treated with OVA (100µg/mL) (A) or LPS (10 ng/mL) (B) for an additional 20 h. The amounts of nitrite in supernatant were measured using Griess reagent. Values are mean±SEM (n=3) of 3 independent experiments in triplicate. *Significantly different from OVA alone, p<0.01 (**) (A). +, Significantly different from LPS alone, p<0.01 (++) (B).
Fig. 4. PEIC does not inhibit COX-2 expression induced by OVA or LPS. (A,B) RAW 264.7 cells were pretreated with 10 or 15µM PEIC for 1 h and then further stimulated with OVA (100µg/mL) (A) or LPS (10 ng/mL) (B) for 8 h. Cell lysates were analyzed for COX-2 and β-actin protein by immunoblots. Results are one representative data from three independent experiments.
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문
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