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Comparison of Rapid Antigen Test and Real-Time Reverse Transcription PCR for the Detection of Influenza B Virus
Min-Jeong Park, Han-Sung Kim, Young Kyung Lee, Hee Jung Kang, Jae-Seok Kim, Wonkeun Song, and Kyu Man Lee
Department of Laboratory Medicine, Hallym University College of Medicine, Chuncheon, Korea
인플루엔자 B 검사에 사용되는 신속항원검사와 실시간 역전사 중합효소연쇄반응검사의 비교
박민정․김한성․이영경․강희정․김재석․송원근․이규만 한림대학교 의과대학 진단검사의학교실
접수일: 12 / 10 / 6
최종재심접수일: 12 / 11 / 19 게재승인일: 12 / 11 / 22 교신저자：김한성
우)431-070 경기도 안양시 평촌동 896, 한림대학교성심병원 진단검사의학과 전화 : 031)380-3932
FAX : 030)380-3934
E-mail : [email protected]
Background: Rapid antigen test and real-time reverse transcription PCR (rRT-PCR) are widely used for the detection of influenza A virus. In this study, we evaluated and compared the effectiveness of a rapid antigen test, currently used for detecting influenza B virus, with the effectiveness of using rRT-PCR for the same purpose.
Methods: Samples obtained from 92 patients during an outbreak of influenza B were assessed using the rapid antigen test (SD BIOLINE Influenza Ag; SD, Korea) and rRT-PCR (Anyplex FluA/B Real-time Detection; Seegene, Korea).
Results: The sensitivity and specificity of the rapid antigen test were 69% and 100%, respectively, in detecting influenza B when compared to rRT-PCR. Twenty-nine patients (31.5%) were positive for both rapid antigen test and rRT-PCR, while 50 (54.3%) were negative for both rapid antigen test and rRT-PCR. The overall concordance rate between rapid antigen test and rRT-PCR was 85.9%. Thirteen patients (14.1%) were positive only for rRT-PCR.
Conclusions: The rapid antigen test showed high specificity and good correlation with rRT-PCR and is likely to be as useful in the detection of influenza B viruses.
Key Words: Influenza B virus, Rapid antigen test, Real-time PCR
서 론
인플루엔자 바이러스는 Orthomyxoviridae과에 속하는 바이러스로, Orthomyxoviridae과의 5가지 속(genus) 중 Influenza virus A, B, C 세 가지 속이 사람에게 호흡기 감 염을 유발하는 것으로 알려져 있다[1,2]. 인플루엔자 A와 B 는 호흡기 증상과 함께 고열, 근육통 등 전신적인 증상이 동 반되는 반면, 인플루엔자 C는 경증의 상기도감염의 임상상을 보이는 것으로 알려져 있어서[3,4], 인플루엔자의 진단을 위 한 검사는 주로 인플루엔자 A와 B를 대상으로 이루어지고 있 다. 인플루엔자 진단을 위한 검사로는 신속항원검사가 검사
방법이 간단하고, 신속하게 결과를 얻을 수 있어서 1차 의료 기관을 포함한 많은 의료기관에서 쓰이고 있고[5,6], 핵산 검사법도 임상 검사실에 많이 도입되어 이용되고 있다[7,8].
인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한 신속항원검사와 핵 산 검사를 비교한 연구들이 국내외에서 시행되었으나, 인플 루엔자 B를 대상으로 신속항원검사와 역전사중합효소연쇄반 응(real-time reverse transcription PCR, rRT-PCR)을 비교한 연구는 많지 않다. 이 연구는 인플루엔자 B의 진단을 위한 신속항원검사를 rRT-PCR을 비교하여, 신속항원검사 의 유용성을 평가하고자 하였다.
J Lab Med Qual Assur 2012 ; 34：93-7
Table 1. Comparison of rapid antigen test and real-time RT-PCR for the detection of influenza B
Real-time RT-PCR
Rapid antigen test*
Positive Negative Total
Positive 29 (31.5) 13 (14.1) 42 (45.7)
Negative 20 (0) 50 (54.3) 50 (54.3)
Total 29 (31.5) 63 (68.5) 92 (100)
*N(%) of specimens.
Abbreviation: RT, reverse transcriptase.
Table 2. Results of rapid antigen test compared with the cycle threshold (Ct) values of real-time RT-PCR
Ct values Rapid antigen test*
Positive Negative Total
<25 16 (100) 10 (0) 16
25∼30 13 (86.7) 12 (13.3) 15
30∼35 17 (58.3) 15 (41.7) 12
>35 12 (25.0) 16 (75.0) 18
Total 28 13 41
*N (%) of specimens.
Abbreviation: See Table 1.
대상 및 방법
1. 대상
인플루엔자 B가 유행하였던 시기인[9], 2012년 3월 19일부 터 3월 31일까지 한림대학교 성심병원에 내원하여 인플루엔 자 바이러스 신속항원검사를 실시한 814예 중 92예를 무작위 로 추출하여 그 대상으로 하였다. 814예 중 인플루엔자 바이 러스 신속항원검사에서 인플루엔자 A에 양성을 보인 경우가 5예(0.6%)였고, 인플루엔자 B에 양성을 보인 경우가 281예 (34.5%)였다. 이 연구의 대상으로 하였던 92예(남자 37명, 여자 55명)의 평균 연령은 25.2세(1개월-95세)였다.
2. 신속항원검사
신속항원검사는 면역크로마토그래피 방법으로 인플루엔자 A와 B에 각각 특이적인 핵단백을 검출하는 제품인 SD BIOLINE Influenza Ag (SD, Yongin, Korea)를 이용하 였다. 제품에 동봉된 멸균면봉과 용기로 비인두 도말을 채취 한 후 제조사의 지시대로 검사를 시행하였다. 판독은 15분 이후 실시하였고, 반응선과 대조선 모두에 반응이 관찰되면 해당 바이러스에 양성으로, 대조선에만 반응이 관찰되면 음 성으로 판독하였다.
3. rRT-PCR
신속항원검사를 위하여 채취한 비인두 도말을 RNA 추출 전까지 냉장 보관하였다가, QIAamp RNA MinElute Virus Spin kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA)와 QIA cube (QIAGEN) 기기를 이용하여 RNA를 추출하였다.
rRT-PCR은 Anyplex FluA/B Typing Real-time Detection (Seegene, Seoul, Korea) 시약과 CFX96 Real-time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이 용하여 제조사의 지침에 따라 검사를 시행하였다. 20 µL의 one-step RT-PCR master mix 용액에 추출한 RNA 용액 5 µL를 첨가하여 총량이 25 µL가 되도록 조성하였고, 50℃
20분과 95℃ 20분의 반응 후, 95℃ 30초와 55℃ 1분의 반응을 45회 반복하였다.
Anyplex FuA/B Typing Real-time Detection 시약은
인플루엔자 A의 M1 유전자, 인플루엔자 B의 PB1 유전자, 2009년 대유행한 신종 인플루엔자 A의 H1 유전자를 동시에 검출할 수 있는 제품으로 내부 정도관리물질(internal control) 을 포함하고 있다. 내부 정도관리물질이 증폭되며 특이적인 PCR 반응산물이 증폭된 경우를 양성, 내부 정도관리물질만 증폭된 경우를 음성으로 판정하였고, 내부 정도관리물질이 증 폭되지 않은 경우 PCR 억제물질이 있는 것으로 판정하였다.
PCR이 억제된 경우는 추출한 핵산을 각각 1:10으로 희석하여 재검하였다.
4. 통계
rRT-PCR 검사에서 양성 결과를 보인 예들을 Ct값에 따 라 나눈 군에서 신속항원검사의 양성률을 비교하였다.
STATA 12 (STATA Corp., College Station, TX, USA) 프로그램을 이용하여 chi-square test를 실시하였고, 유의수준은 0.05로 하였다.
결 과
총 92예 중 rRT-PCR에서 인플루엔자 B에 양성을 보인 예 가 42예(45.7%), 음성을 보인 예가 50예(54.3%)였고, 인플루엔 자 A에 양성을 보인 예는 없었다. 92예 중 2예는 내부 정도관 리물질이 증폭되지 않아서 1:10으로 희석하여 재검하여 결과 를 얻었다. 신속항원 검사에서는 29예(31.5%)가 인플루엔자 B 에 양성, 63예(68.5%)가 음성을 보였고, 인플루엔자 A에 양성 을 보인 예는 없었다. 총 92예 중 79예에서 rRT-PCR에서 PCR과 신속항원 검사 결과가 일치하였다(85.9%). 두 검사 결 과가 일치하지 않았던 13(14.1%)예는 모두 rRT-PCR 양성, 신속항원 검사 음성인 결과를 보였다(Table 1). rRT-PCR 검 사의 결과를 기준으로 하여 평가한 신속항원 검사의 민감도 와 특이도는 각각 69.0%와 100%였다.
rRT-PCR 검사의 cycle threshold (Ct) 값에 따라 나눈 군에서 신속항원검사의 양성률은 25 미만인 군에서 100%, 25-30인 군에서 86.7%, 30-35인 군에서 58.3%, 35 초과
인 군에서 25.0%로 Ct값이 큰 검체에서 낮은 양성률을 보였 고(Table 2), 통계적으로 유의한 차이를 보였다(P<0.05).
고 찰
인플루엔자 A와 B는 기침, 발열, 상기도 감염 증상, 두통, 근육통 등 증상이 유사하여, 임상 소견만으로 감별하기는 어 렵다[1]. 전세계적으로 대유행을 일으켰던 1918년의 스페인 독감, 1957년의 아시아 독감, 1968년의 홍콩 독감, 최근인 2009년의 신종플루 등이 모두 인플루엔자 A에 의해 발생하 였고[10,11], 치명적인 사례들도 다수 보고되어서, 예방 백 신, 치료, 진단 검사 등은 주로 인플루엔자 A를 대상으로 이 루어져 왔다.
계절형 인플루엔자 A/H1N1형과 인플루엔자 B의 중증도 가 유사한 것으로 알려졌고[3], 대만 등 아시아 국가에서 인 플루엔자 B의 여러 가지 아형에 의한 유행과 치명적인 사례 들이 다수 보고되어서[12], 최근 인플루엔자 B가 주목 받고 있다. 국내에서는 수년간 산발적으로 발생하던 인플루엔자 B 가 2012년 상반기에는 전국적으로 유행하였고[9], 이번 연 구를 시행한 의료기관에서도 2012년 3월 2주간의 연구기간 동안 신속항원검사에서 인플루엔자 B 양성 결과를 보인 예가 281예였다.
인플루엔자 진단을 위한 신속항원검사는 인플루엔자 A만 을 검출할 수 있는 키트, 인플루엔자 A와 B를 모두 검출하며 감별이 가능한 키트와 그렇지 않은 키트가 있으며[7], 최근 에는 이 중 인플루엔자 A와 B를 모두 검출하며 감별이 가능 한 키트가 주로 이용되고 있다. 인플루엔자 진단을 위한 신속 항원검사의 유용성을 평가한 연구들에서 신속항원 검사의 민 감도는 다양하게 보고되고 있는데, 표준 방법이 배양검사인 연구와 핵산검사인 연구에서 민감도의 차이를 보이고 있다 [5,6,13-16]. 전통적인 “gold standard”인 배양검사는 민 감도가 낮기 때문에 최근에는 핵산검사가 인플루엔자를 진단 하는 표준검사로 대체되고 있다[8,17].
핵산검사를 표준 방법으로 BinaxNOW Influenza A&B (Inverness Medical, Waltham, MA, USA)를 평가한 연 구들에서는 인플루엔자 A에는 25.0-61.1%[14-16], 인플 루엔자 B에는 24.4-53.8%[15,16]의 민감도를 보고하였 다. 이번 연구에서 사용하였던 SD BIOLINE Influenza Ag의 유용성을 평가한 연구들에서는 신속항원검사가 54.5-88.4%의 민감도를 보이는 것으로 보고하였으나, 한 연구는 배양검사를 표준방법으로 사용한 연구였고[5], 다른 한 연구는 RT-PCR 양성 예의 97.7%가 배양검사에서 양성 을 보여서[18] RT-PCR의 민감도에 대한 검증이 필요해 보 이는 연구였다. 2009년 유행한 신종 인플루엔자 A에 대한 SD BIOLINE Influenza Ag의 민감도는 계절 인플루엔자 에 대한 민감도에 비하여 낮은 것으로 보고되었다[19]. 이번 연구에서 rRT-PCR을 표준 방법으로 평가한 SD BIOLINE Influenza Ag의 인플루엔자 B에 대한 민감도가 69%였고,
특이도는 100%였으며, 85.9%의 예에서 두 검사결과가 일 치하였다.
이번 연구는 대상 검체 수가 총 92예로 충분하지 못하고, rRT-PCR을 표준 방법으로 선정하였으나 rRT-PCR의 위양 성이나 위음성을 평가하지 않았고, rRT-PCR과 신속항원검 사가 불일치한 결과를 보인 경우 추가적인 검사를 실시하지 않았다는 제한점을 갖는다.
신속항원검사의 민감도는 검체의 종류, 환자의 연령, 검체 채취 시기 등에 따라 차이를 보이는 것으로 보고되고 있고, 검체 내의 바이러스 농도와 관련이 있다[19]. 이번 연구에서 rRT-PCR 검사의 Ct값에 따라 신속항원검사의 양성률이 유 의한 차이를 보여서, 바이러스 농도와 신속항원 검사의 양성 률이 관련이 있는 것을 확인할 수 있었다.
PCR 등 핵산 검사에서는 혈색소, 요소, 여러 가지 효소, 약물과 그 대사 물질, phenol 등이 증폭반응을 억제할 수 있 는 것으로 알려져 있고, 기전이 밝혀져 있지 않은 경우가 많 다[20,21]. 이번 연구에서는 92예 중 2예(2.2%)는 처음 실시한 rRT-PCR에서 내부 정도관리물질이 증폭되지 않았다. 핵산 증폭이 억제된 경우 검체 또는 추출한 핵산을 희석하여 검사 하면 억제 물질을 제거하는데 효과적인 것으로 알려져 있다 [21,22]. 이번 연구에서도 핵산 증폭이 억제된 2예는 모두 희 석을 통하여 억제 물질을 제거할 수 있었다.
이 연구에서 사용한 신속항원검사는 간편하고 신속하게 검 사결과를 알 수 있었고, 인플루엔자 B의 검출에서 뛰어난 특 이도를 보였다. 이번 연구에서 사용한 신속항원검사가 PCR 시행이 어려운 의료기관에서 인플루엔자 B를 진단하는 유용 한 검사로 이용될 수 있을 것으로 생각한다.
요 약
배경: 신속항원검사와 역전사 중합효소연쇄반응(real- time reverse transcriptase PCR, rRT-PCR) 검사는 인 플루엔자 A의 진단에 많이 이용되고 있다. 이 연구는 인플루 엔자 B의 진단에서 현재 사용하고 있는 신속항원검사의 유용 성을 평가해보고자 하였다.
방법: 인플루엔자 B가 유행하였던 시기의 92명의 환자를 대상으로 신속항원검사(SD BIOLINE Influenza Ag; SD, Korea)와 rRT-PCR (Anyplex FluA/B Real-time Detection; Seegene, Korea)을 시행하였다.
결과: 인플루엔자 B 진단에 있어서 rRT-PCR 검사와 비 교한 신속항원검사의 민감도는 69.0%, 특이도는 100%였 다. 신속항원검사와 rRT-PCR 검사에 모두 양성인 환자는 29명(31.5%)이었고 모두 음성인 환자는 50명(54.3%)으 로 두 검사의 일치도는 85.9%였다. 13명(14.1%)의 환자는 rRT-PCR 검사에서만 양성반응을 보였다.
결론: 신속항원검사는 우수한 특이도를 보였고, 신속항원 검사와 rRT-PCR 검사 사이의 일치율도 높았다. 신속항원검 사가 인플루엔자 B의 진단에 유용하게 이용될 것으로 생각한 다.
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