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책임저자 : 이동호, 대전시 중구 대흥동 520-2
301-723, 가톨릭대학교 대전성모병원 외과 Tel: 042-220-9520, Fax: 042-220-9565 E-mail: [email protected] 게재승인일：2009년 9월 2일
미세침흡인으로 얻은 갑상선 유두암 세포에서 p27 발현과 경부림프절 전이의 연관성
가톨릭대학교 의과대학 외과학교실, 1병리학교실, 2미생물학교실
이관주ㆍ이정의1ㆍ김정수ㆍ김태규2ㆍ이상철ㆍ김정구ㆍ안창준ㆍ김세준ㆍ이동호
The Relationship between the p27 Expression of Papillary Thyroid Cancer Cells Obtained by FNA and Cervical Lymph Node Metastasis
Kwan Ju Lee, M.D., Jung Hea Lee, M.D.
1, Jeong SooKim, M.D., Tai Gyu Kim, M.D.
2, Sang Chul Lee, M.D.,Jeong Goo Kim, M.D., Chang-Joon Ahn, M.D., Say June Kim, M.D. and Dong Ho Lee, M.D.
Purpose: The p27 gene as a tumor suppressor gene is as-
sociated with colorectal cancer, gastric cancer and breast cancer. Some studies have shown a relationship between the underexpression of p27 and lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma. The aim of this study is to eval- uate the relationship between a p27 expression of the papil- lary thyroid cancer cells obtained by fine needle aspiration (FNA) and cervical lymph node metastasis.Methods: This study included 60 patients with papillary thy-
roid cancer and who underwent total thyroidectomy or lobectomy. Central lymph node dissection was routinely done. Out of these patients, 30 patients underwent a FNA procedure during the operation. Immunohistochemical stain- ing for p27 antibody was performed on the papillary thyroid cancer tissues and cells.Results: Cervical lymph node metastasis is correlated with
the tumor size and lymphovascular invasion (P＜0.001).The underexpression of p27 for the papillary thyroid cancer tissues and cells was associated with lymph node meta- stasis (P=0.009).
Conclusion: An evaluation of the p27 expression for the
papillary thyroid cancer cells obtained by FNA may be use- ful as a predictor for lymph node metastasis before surgery.(Korean J Endocrine Surg 2009;9:155-160)
Key Words: Papillary thyroid cancer, Fine needle aspiration,
p27, Lymph node metastasis
중심 단어:갑상선 유두암, 미세침흡인, p27, 림프 절 전이
Departments of Surgery, 1Pathology and 2Microbiology, The Catholic University of Korea College of Medicine, Seoul, Korea
서 론
갑상선암은 모든 악성종양의 1% 정도를 차지하고 있지 만 조기검진의 발달로 점차 그 진단율이 증가되고 있다. 그 래서 이에 대한 관심 또한 늘어가고 있다. 갑상선암 중에서 가장 많은 비율을 차지하는 유두암은 경부림프절로 전이를 쉽게 할 수 있다. 림프절의 전이는 처음에 중심림프절에서 일어나고 그 후 경부의 측면과 종격 상부에서 나타나게 된 다.(1) 이러한 림프절의 전이는 치료시의 이환율과 국소부 위 재발의 위험성을 증가시킨다.(2,3) 갑상선 유두암에 있어 서 중요한 예후인자들로 환자의 나이, 성별, 종양의 크기, 갑상선 주위 침범, 원격전이 등의 임상적, 조직병리학적 요 소들이 알려져 왔다.(4,5) 하지만 갑상선 주위 침범 이외의 다른 인자들은 림프절의 전이를 예측하는 인자로는 불명확 하다.(6) p27은 염색체 12p13에 위치한 종양억제 유전자로 p27의 저발현이 몇몇 악성종양에서 림프절 전이와 관련이 있고,(7-10) 갑상선 유두암에서 또한 p27 저발현이 림프절 전이와 관련이 있는 것으로 알려져 있다.(1,11-13) 본 연구 에서는 미세침흡인을 통해 얻은 갑상선 유두암 세포에서의 p27에 대한 면역조직화학염색을 시행하여, 발현된 결과를 조직에서의 결과와 비교하고자 하였고, 미세침흡인 갑상선 유두암 세포에서 p27발현의 임상적 유용성을 알아보고자 하였다.
방 법 1) 환자
2008년 10월부터 2009년 2월까지 가톨릭대학교 대전성모
Fig. 1. Immunohistochemical staining for p27 in papillary thyroid cancer cells (×400). (A) There are tumor cells with brown-colored nuclear staining for p27 (positive). (B) The tumor cells without staining for p27 were seen (negative).
Fig. 2. Immunohistochemical staining for p27 in papillary thyroid cancer specimens. (A) The nucleus of tumor cells was not stained with p27 antibody (grade 0, ×200). (B) Strong staining for p27 is shown. The stained nucleus has brown color (grade 2, ×400).
병원 외과학교실에서 미세침흡인세포검사를 통해 갑상선 유두암으로 진단받고 중앙경부 림프절 절제술과 갑상선 전 절제 또는 일엽절제술을 시행 받은 환자 60명을 대상으로 하였다. 조직슬라이드는 수술 후 획득한 갑상선 조직으로 만들었고, 60명 중에서 30명의 환자를 임의로 선택하여 수 술 시 전신마취 상태로 초음파 유도 미세침흡인을 시행하 여 세포슬라이드를 만들었다. 60명의 환자 모두에게 실험 에 대해 서면으로 설명을 하였으며 동의서를 구하였다.
2) 연구방법
(1) 면역조직화학적 염색
① 세포슬라이드 염색: 90% 알코올에 슬라이드를 넣고 1시간 이상 고정한 후 증류수와 인산염완충 식염수(pho- sphate-buffered saline)로 씻어내었다. 슬라이드를 0.01 M 구
연산 나트륨 용액에 담그고 가압증기멸균기에서 100oC로 10분간 가열한 후 증류수와 인산염완충 식염수로 씻어내었 다. 3% H2O2에서 3분간 처리하였고 차단용액(Biogenex, San Ramon, CA, USA)에서 10분 동안 처리하고 1：1,000으로 희 석시킨 p27항체(DB Transduction Laboratories, Franklin La- kes, NJ, USA)에 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 효소 중 합체(enzyme polymer)를 갖는 anti-mouse/anti-rabbit IgG (Bio- genex)에 30분간 반응을 시켰다. Diaminobenzidine chrom- ogen으로 처리한 후 헤마톡실린으로 대조염색을 하여 광학 현미경으로 관찰하였다.
② 조직슬라이드 염색: 포르말린에 고정한 후 만들어진 파라핀으로 고정된 조직을 4μm 두께로 잘라낸 후 탈파라 핀화 시킨 후 3% H2O2에 5분간 처리하고 증류수와 인산염 완충 식염수로 씻어내었다. 그 후 슬라이드를 0.01 M 구연
Table 1. Cervical lymph node metastasis and clinicopathological features
Node metastasis
‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Total (%) P value Positive (%) Negative (%)
Age P=0.45
＜45 yr 11 (45.8) 13 (36.1) 24 (40) ≥45 yr 13 (54.2) 23 (63.9) 36 (60)
Multiplicity P=0.17
Present 10 (41.7) 9 (25.0) 19 (31.7) Absent 14 (58.3) 27 (75) 41 (68.3)
Size P=0.047
≤1 cm 12 (50.0) 27 (75.0) 39 (65.0) ＞1 cm 12 (50.0) 9 (25.0) 21 (35.0)
ETE* P=0.37
Present 10 (41.7) 11 (30.6) 21 (35.0) Absent 14 (58.3) 25 (69.4) 39 (65.0)
Capsule invasion P=0.09
Present 14 (58.3) 13 (36.1) 27 (45.0) Absent 10 (41.7) 23 (63.9) 33 (55.0)
LV† invasion P＜0.001
Present 19 (79.2) 11 (30.6) 30 (50.0) Absent 5 (20.8) 25 (69.4) 30 (50.0)
*ETE = extrathyroidal extension; †LV = lymphovascular.
Table 2. The relationship between lymph node metastasis and grades of p27 immunoreactivity according to the intensity of the stained tumor cells
Grade
‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Total (%) P value Grade 0* (%) Grade 1† (%) Grade 2‡ (%)
Node metastasis P=0.009
Negative 8 (36.4) 13 (65.0) 15 (83.3) 36 (60.0)
Positive 14 (63.6) 7 (35.0) 3 (16.7) 24 (40.0)
*Grade 0 = negative staining; †Grade 1 = faint or moderate staining; ‡Grade 2 = strong staining.
산 나트륨 용액에 담그고 가압증기멸균기에서 100oC로 10 분간 가열한 후 증류수와 인산염완충 식염수로 씻어내었 다. 차단용액(Biogenex)에서 10분 동안 처리한 후 1：1,000 으로 희석시킨 p27항체(DB Transduction Laboratories)에 실 온에서 1시간 동안 반응시킨 후 효소 중합체를 갖는 anti- mouse/anti-rabbit IgG (Biogenex)에 30분간 반응시켰다. Dia- minobenzidine chromogen으로 처리한 후 헤마톡실린으로 대 조염색을 하여 광학현미경으로 관찰하였다.
(2) 염색판독: 가톨릭대학교 대전성모병원 병리과 의사가 염색된 슬라이드를 판독하였다. 세포슬라이드에서 종양세 포가 하나라도 염색이 된 경우를 양성으로, 하나의 세포에 도 염색이 되지 않은 경우를 음성으로 판독하였다(Fig. 1).
조직 슬라이드는 3단계로 판독하였다. 전혀 염색이 되지 않은 경우를 음성으로 grade 0, 약하게 또는 중간 정도의 강
도로 염색된 경우를 grade 1, 진하게 염색된 경우를 grade 2로 분류하였다(Fig. 2).
(3) 통계처리: p27에 대한 발현과 림프절 전이 및 다른 임 상병리학적 요소들과의 관계를 SPSS version 12.0를 이용하 여 통계학적으로 분석하였다. 통계처리는 Fisher’s exact test 및 Chi-square test를 이용하였고 P value가 0.05 미만인 경우 를 통계학적으로 의의가 있다고 평가하였다.
결 과 1) 성별, 나이 및 수술방법
성별은 남성이 3명(5.0%), 여성이 57명(95.0%)이었으며 환자들의 나이는 28세부터 71세까지였고 평균연령은 48.1±
10.2세였다. 수술 방법은 갑상선 전절제와 중앙경부 림프절 절제술을 53명(88.3%)에서, 일엽절제술 및 중앙경부 림프절 절제술을 7명(11.7%)에서 시행하였다.
2) 임상조직학적 특징과 경부림프절 전이
경부림프절 전이를 갖는 환자는 60명 중 24명으로 40.0%
를 차지하였다. 1 cm보다 큰 종양의 경우 1 cm 이하의 종양 보다 림프절 전이가 많았고(P=0.047), 림프관을 침범한 경 우가 그렇지 않은 경우보다 림프절 전이가 많았다(P＜
0.001). 45세를 기준으로 나눈 환자의 나이, 갑상선외 조직 침범, 피막 침범은 경부림프절 전이와 통계학적 의의를 보 이지 않았다(Table 1).
3) 갑상선 유두암 조직에서 p27발현
p27에 대한 면역조직화학적 염색에 양성인 경우는 38명 (63.3%)이었고 음성을 보인 경우는 22명(36.7%)이었다. 갑 상선 유두암 조직에서 p27발현과 경부림프절 전이와의 관 계를 살펴보면, p27이 저발현될수록 경부림프절 전이가 더 많았으며 통계학적 의의를 보였다(P=0.014) (Table 2). 임상 조직학적 특징 중 림프절 전이와 통계학적 의의를 보였던 종양의 크기에서는 1 cm 이하의 종양과 1 cm 보다 큰 종양 사이에서 p27 발현의 차이를 보이지 않았고(P=0.43), 림프 관을 침범한 종양과 그렇지 않은 종양에서도 역시 p27 발현
Table 3. The expression of p27 according to the tumor size and lymphovascular invasion Grade
‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Total (%) P value Grade 0* (%) Grade 1† (%) Grade 2‡ (%)
Size P=0.43
≤1 cm 12 (54.5) 14 (70.0) 13 (72.2) 39 (65.0)
＞1 cm 10 (45.5) 6 (30.0) 5 (27.8) 21 (35.0)
LV§ invasion P=0.53
Present 12 (54.5) 11 (55.0) 7 (38.9) 30 (50.0)
Absent 10 (45.5) 9 (45.0) 11 (61.1) 30 (50.0)
*Grade 0 = negative staining; †Grade 1 = faint or moderate staining; ‡Grade 2 = strong staining; §LV = lymphovascular.
Table 4. Comparison between FNAC staining for p27 and lymph node metastasis
Node metastasis
‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Total (%) P value Positive (%) Negative (%)
FNAC* staining P=0.024
Positive 1 (7.7) 8 (47.1) 9 (30.0) Negative 12 (92.3) 9 (52.9) 21 (70.0) Total (%) 13 (43.3) 15 (56.7) 30 (100)
*FNAC = fine needle aspiration cytology.
Table 5. Comparison between FNAC staining and tissue staining for p27
Tissue staining
‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Total (%) Positive (%) Negative (%)
FNAC* staining
Positive 8 (72.7) 1 (5.3) 9 (30.0) Negative 3 (27.3) 18 (94.7) 21 (70.0)
Total 11 (36.7) 19 (63.3) 30 (100)
*FNAC = fine needle aspiration cytology.
과 통계적 의의를 보이지 않았다(P=0.53) (Table 3).
4) 미세침흡인 갑상선 유두암 세포에서 p27발현과 림 프절 전이
30명의 환자에게 미세침흡인을 시행하여 p27에 대한 면 역조직화학적 염색을 시행한 결과 9명(30.0%)의 환자에서 양성을 보였고 21명(70.0%)의 환자에서 음성을 보였다 (Table 4). p27 발현에 양성인 환자에서 그렇지 않은 경우보 다 림프절 전이를 많이 보였고, 통계적 의의를 보였다 (P=0.024).
5) 조직슬라이드와 세포슬라이드에서 p27발현의 비교 조직슬라이드의 결과를 기준으로 세포슬라이드에서 p27 발현을 비교하였다. 민감도는 72.7%로 다소 낮게 나왔고 특 이도는 94.7%였으며 양성예측치는 88.9%, 음성예측치는 81.0%였다(Table 5).
고 찰
갑상선 유두암에서 림프절의 전이는 20∼50%로 보고되 며 level VI인 중앙경부 림프절로의 전이가 가장 흔한 것으 로 되어 있다.(14) 갑상선 유두암은 높은 생존율을 보이지 만 원격전이를 할 수 있으며, 재발률이 높고 국소적 재발의
75%가 경부림프절 전이로 나타난다.(15) 이러한 특징에도 불구하고 치료방법이 일관되지 않고 전절제를 선호하는 경 우와 일엽절제를 선호하는 경우, 림프절의 기본적 절제술 을 권하는 경우와 그렇지 않은 경우, 림프절 제거 범위에 있어서도 변형 근치적 경부림프절 곽청술을 하는 경우와 그렇지 않은 경우 등 여러 의견들이 있다. 하지만 이에 대한 전향적인 연구는 없는 상태이다. 이러한 관점에서 림프절 의 전이 위험성이 높은 군과 낮은 군을 선별할 수 있다면 수술 방법의 선택에 어느 정도 도움을 줄 수 있으리라 생각 한다.
갑상선 유두암에서 경부림프절 전이와 다른 임상 조직학 적 특징들과의 관계를 살펴보면 본 연구에서는 종양의 크 기가 1 cm 이하인 경우보다 1 cm보다 큰 경우 림프절 전이 를 잘 하였고 종양세포의 림프관 침범이 있었던 경우가 그 렇지 않은 경우보다 림프절 전이를 잘 하였다. Khoo 등(1) 은 45세를 기준으로 한 환자의 나이, 갑상선외 조직침범, 종 양의 다발성 등이 림프절 전이와 관련이 있다고 보고하였 다.
p27은 종양억제 유전자로 chromosome 12p13에 위치하며 cyclin-dependent kinase를 억제한다. 이는 세포주기의 G1기 에서 S기로의 전이를 조절하게 된다. 이러한 p27의 저 발현 이 몇몇 악성종양의 림프절 전이나 예후와 관계가 있다는 문헌이 발표되었다. Thomas 등(7)은 대장암에서의 전이와
p27의 저 발현과 관련을 보고했으며 Yasui 등(8)과 Kim 등 (9)은 p27의 저 발현이 위암에서의 진행성 및 침윤성과의 관계가 있다고 보고했다. Wu 등(10)은 유방암에서 p27의 저 발현이 림프절 전이 및 생존율과 관계가 있다고 보고하였 다. 갑상선암에서도 역시 림프절 전이와 p27의 발현과의 관 계가 보고되었다. Khoo 등(1)은 2002년에 125명의 갑상선 유두암 환자를 대상으로 p27의 발현과 림프절 전이의 관계 를 보고하였다. 이들은 염색의 강도로 grade를 나누었고 저 발현이 될수록 림프절 전이와의 통계적 유의성을 갖는다고 보고하였다. Karlidag 등(12)도 28명의 갑상선 유두암에서 p27에 대해 염색된 종양세포의 범위에 따라 grade를 나누었 고 저 발현될수록 림프절 전이와 관계에서 유의성을 갖는 다고 보고하였다. Khoo 등(11)은 89명의 갑상선 유두암 환 자에서 종양의 크기를 1 cm를 기준으로 나누어서 각각의 군에서 p27의 발현과 림프절 전이와의 관계를 연구하였고 두 군에서 모두 p27의 저 발현이 림프절 전이와 통계학적 유의성을 갖는다고 보고하였다. Rodolico 등(13)은 214명의 종양의 크기가 1 cm 이하인 갑상선 유두암 환자에서 p27의 저 발현은 림프절의 전이와 관련이 있다고 보고하였다. 국 내에서도 p27의 발현과 림프절 전이에 대해 보고한 문헌이 있는데 Yoo 등(16)은 여포상 선종 12예, 미세침윤성 여포암 8예, 광범위 침윤성 여포암 6예, 유두암 26예를 대상으로 p27의 발현에 대해 분석하여 종양별로 p27의 발현의 차이 는 없었고 유두암에서 림프절 전이와의 관계에서도 통계학 적 유의성을 보이지 않는다고 보고하였다. Erickson 등(17) 은 p27의 발현이 림프절 전이가 아닌 악성과 양성을 구분하 는데 통계적으로 의미가 있다는 보고를 하기도 했다. 본 연 구에서는 p27에 대한 발현을 염색된 세포의 비율에 따라 3 단계로 나누어 분류했고 대부분의 연구에서 보고한 것처럼 두 경우에서 p27의 저발현은 림프절 전이와 통계적 의의를 보였다. 임상조직학적 특징 중에 림프절 전이와 관련이 있 었던 종양의 크기 및 림프관 침범은 p27발현과는 통계적 의 의를 보이지 않았다.
미세침흡인으로 얻어진 세포에 p27의 염색을 시행한 문 헌은 찾아보기가 힘들었고 2000년에 Troncone 등(18)이 갑 상선종(goiter) 80예, 유두암 10예, 여포상 종양 10예, 총 100 명의 환자에서 미세침흡인으로 얻어진 세포에 대한 p27염 색을 시행한 보고가 1예가 있었다. 이들은 미세침흡인을 통 해 p27 발현을 평가할 수 있고, 갑상선종과 갑상선 종양에 서 p27의 염색차이가 통계적으로 의미가 있음을 보고하였 다. 본 연구에서 30명의 환자에게 갑상선 유두암 세포에 대 한 p27염색을 시행했고 이 중 p27발현 양성이 9명(30.0%), 음성이 21명(70.0%)에서 관찰되어 p27발현과 림프절 전이 와의 관계는 통계적 의의를 보였다(P=0.02).
미세침흡인을 시행 받은 환자 30명에서 염색된 조직슬라 이드와 세포슬라이드 결과를 비교하였고 조직슬라이드의 결과를 기준으로 했을 때 세포슬라이드 결과의 민감도는
72.7%, 특이도는 94.7%였으며, 양성 예측률과 음성 예측률 은 각각 88.9%, 81.0%였다. 다소 수치들이 낮게 나온 것은 환자의 수가 적기 때문으로 생각된다.
저자들은 본 연구에서의 제한점을 대상 환자수가 적은 것과 세포슬라이드에 대한 염색의 경험부족이라고 생각한 다. 향후 더 많은 환자를 대상으로 실험이 이뤄져야 하며, 실험방법에 있어서도 지속적 연구를 통해 세포슬라이드에 대한 면역염색의 정확성을 높인다면 보다 좋은 결과를 가 져올 수 있을 것이라고 생각한다.
결론적으로, 세포에서 염색 결과와 조직에서 염색 결과 가 큰 차이를 보이지 않고 각각의 결과가 림프절 전이와의 관계에서 통계적 의의를 보였기에, 미세침흡인으로 얻은 갑상선 유두암 세포에 p27에 대한 면역조직화학적 염색을 하는 것이 수술 전 림프절 전이를 예측하는데 도움이 될 수 있을 것으로 생각한다.
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