백서에서 렌티바이러스를 이용한 제9 혈액응고인자 유전자요법

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접수일：2008년 3월 28일, 승인일：2008년 4월 21일

책임저자：김 승 택 371-711 충북 청주시 흥덕구 개신동 62번지 충북대학교 의과대학 내과학교실 TEL: 043) 269-6354, FAX: 043) 273-3252, E-mail: [email protected] 이 논문은 2006년도 충북대학교 학술연구지원사업의 기성회 연구비 지원에 의하여 연구되었음.

백서에서 렌티바이러스를 이용한 제9 혈액응고인자 유전자요법

김승택^1,3ㆍ오태근^1,3ㆍ전현정²ㆍ김옥희³ㆍ이상미³

충북대학교 의과대학 내과학교실¹, 충북대학교병원², 충북대학교 의학연구소³

= Abstract =

Gene Therapy in Rats with a Lentiviral Vector Containing the Human Coagulation Factor IX Gene

Seung Taik Kim^1,3, Taekeun Oh^1,3, Hyun Jeong Jeon², Ok Hee Kim³, Sang Mee Lee³

Department of Internal Medicine, College of Medicine, Chungbuk National University¹, Chungbuk National University Hospital², Chungbuk National University Medical Research Center³, Cheongju, Korea

Background: Hemophilia B is an inheritable X-linked bleeding disorder that occurs as a consequence of genetic alterations within the factor IX (IX) gene. In the present study, pseudotyped HIV-I-derived lentiviral vectors expressing human IX (lentivirus-IX) were assessed for the ability to produce an active human IX in the animals transduced with lentivirus-IX.

Methods: The IX concentrations and activated partial thromboplastin times (aPTT) were measured from the supernatants of HeLa cells that were transduced with lentivirus-IX. In an animal study, we injected 1μg of lentivirus-IX into the hind limbs of Sparague-Dawley (SD) rats. The IX concentrations were measured from the plasma of the vehicle injected rats and the plasma of the lentivirus-IX injected rats for 8 weeks.

Results: The in vitro expression of human IX was detected in a dose-dependent manner following the transduction of lentivirus-IX into the HeLa cells (control: 10±3 vs. 100 ng of lentivirus-IX: 1486±50 ng/mL, P＜0.05). The aPTT also showed the tendency of dose-dependent decrease (control: 83.9±0.5 vs. 50 ng of lentivirus-IX: 80.1± 0.8 sec), but this was not statistically significant. In the animal experiment, the plasma IX concentration from the lentivirus-IX transduced rats (n=3) was significantly increased compared to the vehicle-injected rats (n=4) (5.9±3.9 vs. 46.4±20.6 ng/mL) at post-injection 1 week.

Conclusion: This study demonstrated that in vivo delivery of lentiviral vectors expressing human IX to the muscle cells has the potential to be a therapeutic modality for hemophilia B. (Korean J Blood Transfus 2008;19:1-8)

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Key words: Lentivirus, Human factor IX, Gene therapy

서 론

B형 혈우병(Christmas disease)은 제 9 혈액응고 인자(IX)의 선천적 결핍에 의하여 출혈경향을 보 이는 질환으로 인구 100,000명당 1인 정도의 빈 도로 발생한다.¹⁾ 이 질환의 치료에는 신선동결혈 장, 프로트롬빈 복합체가 쓰이는데, 다른 혈액수 혈과 마찬가지로 간염 바이러스, 사람면역결핍바 이러스 감염에의 노출잠재성이 내재되어 있을 뿐 만 아니라, 수혈된 혈장분획 속에 존재하는 활성 화된 혈액응고인자에 의한 혈전증의 위험성이 있 다.²⁾ 현재 단세포항체기법을 이용한 순수 IX 제 제가 나오고 있으나 가격이 비싸다는 단점이 있 다.

유전자요법은 DNA 재조합 방법을 이용하여 새로운 유전자를 직접 또는 간접적인 방법을 이 용하여 세포에 이입하여 그 세포의 생물학적 특 성을 교정하거나, 또는 질병의 치료에 필요한 단 백질을 생산하게하여 치료효과를 가지는 방법이 다.³⁾ 이러한 유전자요법의 특징을 살려 IX를 생 체 내에서 지속적으로 생성하게 할 수 있다면 수 혈부작용의 우려나 경제적인 부담에서 벗어나 IX 부족에 의한 혈우병을 치료할 수 있을 것이다.

더욱이 IX 결핍인 경우 심한 출혈경향을 교정하 기 위해서 혈중 IX의 농도를 정상인의 농도까지 높여 줄 필요가 없기 때문에 유전자요법의 성공 가능성이 더욱 높아질 수 있다.

렌티바이러스는 역전사바이러스의 일종이나, 다른 역전사바이러스와는 달리 성장이 멈춘 세포 나 분화가 끝난 세포도 감염시킬 수 있어 대상세 포를 다양화 할 수 있을 뿐만 아니라, 직접 생체 내 세포에 유전자를 이입시킬 수 있다는 장점이 있다. 특히 요즈음 개발된 3세대 렌티바이러스 매개체는 사람면역결핍바이러스가 생성될 확률 이 없어 일반실험실에서도 조작이 가능할 정도로

안전성이 입증되어 있다.⁴⁾

이에 본 연구자는 우선 IX를 포함하는 재조합 렌티바이러스를 만들어 생체 외에서 배양된 대상 세포에 감염시켜 IX의 생성분비가 가능한지 검 토하고, 이어 이를 실험동물의 근육에 주입하는 생체 내 유전자요법모델이 가능한지 여부를 검토 하기로 하였다.

대상 및 방법

1. 세포배양

본 실험에 사용된 293T 세포와 HeLa 세포는 10% 불활성화 우태혈청, 0.3 g/L glutamine, 1 mM/L sodium pyruvate, 100 units/mL penicillin, 100 units/mL streptomycin이 포함된 Dulbelco's modified Eagle's medium (Gibco-BRL, Grand Island, USA)을 이용하여 5% CO2, 37^oC에 조정되 어 있는 CO2 배양기에서 배양하였다.

2. 재조합 플라스미드 제작

IX cDNA를 함유한 재조합 플라스미드는 기본 플라스미드인 pRRL-cPPT-EF1α-X-PRE-SIN으로 부터 제작되었다. 기본 플라스미드의 명칭은 배 열 유전자 순으로 명명된 것으로 pRRL: HIV Rev response element, cPPT: HIV-1 central polypurine tract, EF1α: elongation factor 1 alpha promoter, X:

multi-cloning site, PRE: human hepatitis virus posttrans-criptional regulatory element, SIN: self inactivating을 약칭한 것이다. IX 유전자가 들어있 는 플라스미드인 pBSK-IX는 Dr. Frank Park (Milwakee University, USA)에게서, 293T 세포주 와 HeLa 세포주는 이찬희교수(충북대학교 자연 대학)로부터 기증받은 것을 사용하였다.

우선, 표준적인 분자생물학적 방법을 이용하여

pRRL-cPPT-EF1a-IX-PRE-SIN을 제작하였다.⁵⁾ 즉, IX 유전자가 들어있는 pBSK-IX 플라스미드를 EcoRⅠ과 XhoⅠ 제한효소로 소화시킨 다음 아가 로오즈 겔에 전기영동하여 원하는 크기의 띠만을 추출함으로써, IX 유전자를 pBSK-IX 플라스미드 로부터 분리하였다. 이를 multi-cloning site를 EcoR

Ⅰ과 XhoⅠ 제한효소로 소화시킨 pRRL-cPPT-EF1 α-X-PRE-SIN 플라스미드에 T4 DNA 결합효소를 이용하여 삽입을 시도한 후, 섭씨16^oC에서 하룻밤 배양한 다음, DH5α 균주에 전환시켰다. Ampicillin (Sigma Chemical Company, St. Louis, USA)이 0.8 mg/mL로 함유된 SOB 우무판에 이 균주를 분주하 여 섭씨 37^oC에서 하룻밤 배양한 후, 형성된 집락 중 12개를 무작위로 선정하여 IX가 정방향으로 삽입된 균주를 찾아낸 다음 대량배양하고, 이어 Quiagen Plasmid Mega Kit (Quiagen GmbH, Hilden, Germany) 를 이용하여 pRRL-cPPT-EF1α-IX-PRE- SIN 플라 스미드를 대량 추출하였다.

3. 재조합 렌티바이러스 생성

위에서 제작한 pRRL-cPPT-EF1α-IX-PRE-SIN 를 사용하여 다음의 방법에 따라 재조합 렌티바 이러스를 생산하였다. 즉 pRRL-cPPT-EF1α-IX- PRE-SIN 23μg, pMDL-g/p-RRE 꾸리기 플라스미 드 15μg, pRSV-REV 플라스미드 11.5μg과 pMK- VSV-G 외피플라스미드 8μg를 1×TE (1 x TE: 10 mM Tris［pH 8.0], 1 mM EDTA)와 혼합하여 400 μL로 만든 후 동일한 부피의 페놀/클로로폼/이소 아밀알코올(25：24：1)로 처리하고 40μL의 3 M 아세트산나트륨(pH 5.2)과 1 mL의 100% 알코올 을 넣어 얼음에서 15분간 방치하였다. 이 후 원심 분리로 DNA를 침전시켜 상청액을 제거하고 건조 시킨 후 0.5 mL 0.1×TE에 녹여 4^oC에서 하룻밤 두 었다. 다음 날 위의 DNA에 0.4 mL의 0.1×TE와 0.1 mL의 2.5 M CaCl2를 넣어 혼합한 후, 2×HBS

(280 mM NaCl, 100 mM HEPES［pH 7.12］, 1.5 mM Na2HPO4)에 방울방울 떨어뜨려 현탁액을 만 들고, 이 용액 전체를 배양 중인 293T 세포의 상 청액에 첨가하였다. 16시간이 지난 후 10 mM sodium butyrate가 들어있는 배양액으로 갈아주고 8시간이 지난 후 다시 배양액을 교체한 다음 16 시간 후에 배양액을 수거하였다. 수거한 배양액 을 0.22μm 필터로 여과한 후 초고속원심분리기 로 4^oC에서 2시간 동안 20,000 G로 원심분리하였 다. 바이러스침전물을 1×TBS로 녹인 후 다시 30,000 G에서 2시간 원심분리하였다. 이렇게 얻 은 최종 바이러스침전물은 1 mL의 HBS에 녹인 후 4^oC에 보관하였다가 실험에 사용하였다.

4. 바이러스 역가 측정

바이러스 역가는 상청액에서의 바이러스 p24 단백질을 HIV-1 p24 ELISA Kit (PerkinElmer Life Science, Boston, USA)를 사용하여 효소면역측정 법으로 측정하였다.

5. 대상세포에서의 IX 분비

1×10⁵ HeLa 세포를 6-well plate에 분주하고 앞 서 제작한 재조합 렌티바이러스를 p24단백질농 도 0 ng, 2 ng, 5 ng, 25 ng, 50 ng, 100 ng 별로 각각 투여하였다(개체수=5). 하룻밤 배양한 후 배 양액을 교환하고 이후 72시간 동안 추가배양한 후에 상청액을 수거하여 IX 농도를 Human Factor IX ELISA Kit (Affinity Biologicals, Ontario, Canada) 를 사용하여 효소면역측정법으로 측정하였다.

6. 혈액응고활성도의 측정

1×10⁵ HeLa 세포를 6-well plate에 분주하고 앞 서 제작한 재조합 렌티바이러스를 p24단백질농 도 0 ng, 5 ng, 25 ng, 50 ng 별로 각각 투여하였다 (개체수=5). 하룻밤 배양한 후 배양액을 교환하고

Fig. 1. Factor IX concentrations in the supernatants of cultured HeLa cells infected with lentiviral vector containing human factor IX gene. Five samples were measured for a given amount of p24. ANOVA test was used to compare the difference among groups.

*P＜0.05.

이후 72시간 동안 추가 배양한 후에 상청액을 수 거하였다. 이 상청액에서의 부분트롬보플라스틴 시간은 Dade Actin Activated Cephaloplastin Re- agent Kit (Dade Berhing Inc. New Yark, USA)를 이용하여 CA-1500 (TOA Medical Electronics Co.

Ltd. Kobe, Japan)으로 측정하였다.

7. 동물실험

실험동물로는 5주령 된 Sparague-Dawley (SD) 백서를 구입하여 2주정도 동물실에서 적응시킨 후 실험에 이용하였다. p24단백질 1μg의 재조합 바이러스를 백서의 대퇴부 근육에 주사하였다 (개체수=3). 대조군(개체수=4)에는 동일한 부피 의 식염수를 주입하였다. 이후 8주까지 1주 간격 으로 꼬리정맥으로부터 혈액 400μL를 채취하여 20% 구연산나트륨 10μL가 들어있는 튜브에 넣 은 후 혈장을 분리하였다. 이 혈장은 −80^oC 냉동 고에 보관하였다가 위와 동일한 방법으로 IX 농 도를 측정하였다.

8. 통계학적 분석

본문에 기재된 모든 수치는 평균±표준편차로 기술하였고, HeLa 세포에서의 p24단백질 농도별 IX의 분비능과 부분트롬보플라스틴시간의 통계 학적 비교는 ANOVA test로, 사후검정은 Duncan test를 이용하였으며, 실험동물에서 대조군과 재 조합 렌티바이러스 치료군 간의 혈중 IX 농도는 Mann-Whitney U-test로 분석하여 P 값이 0.05 미 만인 경우 통계적으로 유의하다고 판정하였다.

결 과

1. 대상세포에서의 IX 분비능

재조합 렌티바이러스를 p24단백질 농도별로 2

ng, 5 ng, 25 ng, 50 ng, 100 ng를 각각 투여한 결과, 대조군의 10±3 ng/mL과 비교하여, p24 단백질 2 ng 투여군에서는 186±26 ng/mL, 5 ng 투여군에서 는 554±110 ng/mL, 10 ng 투여군에서는 921±77 ng/mL, 50 ng 투여군에서는 1,262±73 ng/mL, 100 ng 투여군에서는 1,486±50 ng/mL의 농도를 보여 투여한 바이러스의 양에 따라 IX의 생성이 용량 의존적으로 증가함을 관찰할 수 있었다(P＜0.05) (Fig. 1).

2. 혈액응고활성도의 측정

다음으로 바이러스로부터 유전자가 이입되어 생산분비된 IX의 생물학적 활성도를 측정한 결 과, 대조군의 83.9±0.5초에 비하여 p24단백질 5 ng 투여군에서는 83.6±0.3초, 25 ng 투여군에서는 82.0±0.9초, 50 ng 투여군에서는 80.1±0.8초로 부 분트롬보플라스틴시간이 감소하는 경향을 보였 으나 통계학적으로 유의하지는 않았다(Fig. 2).

Fig. 2. Activated partial thromboplastin time (aPTT) in the supernatants of cultured HeLa cells infected with lentiviral vector containing human factor IX gene. Five samples were measured for a given amount of p24. Tendency to decrease of aPTT according to p24 antigen amount was not statisti- cally significant among groups by ANOVA test.

Fig. 3. Human factor IX concentration in rat plasma at 1 week after intramuscular injection of lentiviral vectors containing human factor IX gene. Mann- Whitney U-test was used to test the difference between group. *P＜0.05.

3. 동물실험

5주령된 SD백서를 이용하여 p24단백질농도 1 μg의 재조합 렌티바이러스를 대퇴부 근육에 주 사한 후, 8주까지 1주 간격으로 꼬리정맥에서 혈 액을 채취하여 혈장 내의 IX 농도를 측정한 결과 재조합 렌티바이러스를 주사한 백서에서 1주 후 에 IX 농도가 46.4±20.6 ng/mL로 대조군의 5.9±3.9 ng/mL에 비하여 유의하게 상승함을 관찰할 수 있 었다(P＜0.05) (Fig. 3). 하지만 2주 후부터는 대조 군에 비하여 IX의 혈중농도가 증가함을 관찰할 수 없었다.

고 찰

본 연구는 IX 유전자를 함유하는 렌티바이러 스 플라스미드를 제작하고, 이렇게 제작된 렌티 바이러스 플라스미드로부터 재조합 렌티바이러

스를 생성한 후, 대상세포인 HeLa 세포에 감염시 켜 생체 외에서 IX이 생성됨을 확인하고, 이어 동 물에게 이 재조합 바이러스를 근육에 주사하여 혈장 내 IX이 증가함을 관찰한 연구이다. 역전사 바이러스 매개체의 장점에 더하여 이 렌티바이러 스 매개체는 세포분열을 하고 있지 않는 상태의 세포에도 유전자를 이입시킬 수 있어, 세포를 체 외에서 배양하면서 유전자를 이입시킨 후 이 세 포를 체내에 이식하여야 하는 번거로움 없이 직 접 체내에서 치료유전자를 원하는 대상세포에 이 입시킬 수 있다는 장점을 가진다. 더욱이 이 바이 러스를 기본으로 하여 만든 매개체는 개량을 거 듭한 결과 안전성이 입증되고 있다.

본 연구자는 녹색현광단백질 유전자, 베타-갈 락토시다제 유전자, 또는 적혈구생성인자 유전자 를 함유한 재조합 렌티바이러스를 대상세포에 감 염시키면, 해당 단백질이 대상세포에서 발현될 뿐 아니라 세포 외로도 분비될 수 있음을 증명하 였다.^5,6) IX 유전자를 이용한 본 실험에서도 마찬 가지로 IX 유전자를 함유하는 재조합 렌티바이 러스로 HeLa 세포를 감염시키면 HeLa 세포로부

터 IX가 만들어지고 세포 외로 분비됨을 증명할 수 있었다.

그러나 이 재조합 렌티바이러스를 백서의 대퇴 근에 주사하고 이 백서로부터 IX의 농도변화를 관찰한 동물실험에서는 이전의 결과와 상반된 결 과를 얻었다. 즉, 녹색현광단백질 유전자를 함유 하는 재조합 렌티바이러스의 대퇴근 주사 시에 10주 후까지도 근육세포에서 녹색형광을 관찰할 수 있었고,⁵⁾ 적혈구생성인자 유전자를 함유하는 재조합 렌티바이러스 실험에서는 분비된 적혈구 생성인자에 의하여 혈색소 값이 38주에서도 상승 하는 것을 관찰할 수 있었으나,⁶⁾ 이번 실험에서 는 IX의 혈중 농도의 상승이 1주 후에만 관찰되 었을 뿐 2주 이상 지속되지 않았다. 이러한 결과 는 백서에 주입한 재조합 렌티바이러스의 바이러 스 역가와 연관이 있을 것으로 생각된다. 본 동물 실험에 사용하였던 1μg의 p24단백질농도는 바 이러스 역가로 약 10⁷개에 불과하다.⁵⁾ 이는 본 연 구자의 이전 실험에 사용된 약 10¹⁰개에 비하여 월등히 적은 수이다. 따라서 이번 연구에서는 감 염된 근육세포가 적어 분비되는 IX의 농도도 일 시적인 증가만 보였을 것으로 추정된다.

현재까지 혈우병에 대한 유전자요법은 여러 연 구자를 통하여 시도되어 왔다. 아데노바이러스를 매개체로 이용하여 실험동물에서 제 8혈액응고 인자의 혈중농도가 상승함을 보고한 연구가 있으 나, 그 효과기간이 짧았고, 한번 이 매개체에 노 출되면 아데노바이러스에 대한 중화항체가 생성 되기 때문에 반복적으로 주사할 수 없어 장기적 인 치료효과를 가질 수 없다는 단점이 있다.⁷⁾ 아 데노바이러스의존바이러스를 매개체로 이용하 여 생쥐 또는 개를 실험대상으로 한 연구에서는 장기간에 걸쳐 혈중 IX의 상승을 보고하였다.^8,9) 이번 실험에서 이용한 렌티바이러스 매개체를 이 용한 연구에서도 장기간에 걸쳐 출혈경향의 개선

을 가져왔다는 연구도 있다.^10,11)

이러한 결과를 얻기 위하여 사용된 바이러스 역 가는 아데노바이러스의존바이러스인 경우 10^12-13 개에 달하였다. 렌티바이러스의 경우에도 P24단 백질 8μg에 해당하는 바이러스를 주입한 경우에 는 IX의 상승을 관찰할 수 없었고 36μg의 경우부 터 효과를 나타내었다고 보고하고 있다.¹¹⁾ 그러나 실제 실험에서 30μg 정도의 바이러스 역가를 얻 기 위하여는 재조합 플라스미드가 대량으로 필요 할 뿐만 아니라, 약 10 L 정도의 세포배양 상청액 을 얻어 원심분리하여야 한다는 문제점이 있다.

이 경우에도 개에게서 IX 농도가 정상의 1∼2%

로만 유지되었지만, 이 수준으로도 출혈경향의 감소를 관찰할 수 있었다고 보고하고 있다.

혈우병의 유전자치료에는 IX의 혈중 농도를 높이는 문제 이외에도 또 다른 장벽이 존재한다.

즉, 선천적으로 존재하지 않았던 IX의 생성에 대 하여 항원-항체 반응이 일어나고 이에 따라 유전 자요법에 의하여 상승된 IX에 대한 중화항체가 출연할 수 있다.¹²⁾ 위의 아데노바이러스의존바이 러스 또는 렌티바이러스를 이용한 실험에서도 결 국에는 IX에 대한 중화항체의 출현으로 인하여 그 효과가 떨어짐을 보고하고 있다.

결론적으로, 본 연구에서는 렌티바이러스를 매 개체로 이용하여 실험동물에게 근육주사방법을 통하여 IX 유전자를 이입할 때 IX의 일시적인 상 승을 관찰할 수 있었다. 그러나 렌티바이러스를 이용한 IX 유전자치료는 바이러스 역가를 높일 수 있는 간편한 방법의 개발이 필요하며, 궁극적 으로는 사람의 경우 중화항체의 발생여부를 검증 하여야 효과적인 치료방법으로서 가치를 인정받 을 수 있을 것이다.

요 약

배경: B형 혈우병은 제 9혈액응고인자의 유전 자 이상에 의해 발생하는 출혈성 질환이다. 본 연 구에서는 사람 제 9혈액응고인자(IX) 유전자를 함유한 재조합 렌티바이러스를 제작하여 실험동 물에서 효과적으로 IX가 생성되는지를 보고자 하였다.

방법: IX 유전자를 함유한 재조합 렌티바이러 스를 제작하여 HeLa 세포에 감염시키고, 상청액 에서의 IX의 농도 및 부분트롬보플라스틴시간을 측정하였다. 동물실험으로는 5주령 된 Sprague- Dawley를 대상으로, p24단백질 1μg양의 재조합 렌티바이러스를 대퇴부 근육에 주사한 후, 정기 적으로 8주까지 채혈하여 분리된 혈장에서 IX 농 도를 측정하였다.

결과: HeLa 세포에 재조합 렌티바이러스를 감 염시키고 상청액에서 IX 농도를 측정한 결과, 대 조군의 10±3 ng/mL으로부터 p24단백질 100 ng군 에서의 1,486±50 ng/mL까지 p24단백질 용량의 증 가에 따라 IX 농도가 증가하였다(P＜0.05). 부분 트롬보플라스틴시간도 대조군의 83.9±0.5초로부 터 p24단백질 50 ng 투여군에서 80.1±0.8초로 p24 단백질 투여량을 증가시킴에 따라 감소하는 경향 을 보였으나 통계학적으로는 유의하지 않았다.

동물실험에서는 p24단백질 1μg의 재조합 렌티 바이러스를 근육주사 후 채취한 혈장 IX 농도가 투여 1주 후에서는 대조군의 5.9±3.9 ng/mL에 비 하여 46.4±20.6 ng/mL로 유의하게 증가하였다(P

＜0.05).

결론: 재조합 렌티바이러스를 근육세포에 주사 한 생체 내 유전자요법이 백서에서 IX가 생성됨 을 관찰할 수 있어, 앞으로 B형 혈우병의 치료방 법으로서의 가능성을 보여주었다.

참고문헌

1. Ljung R, Petrini P, Tengborn L, Sjörin E.

Haemophilia B mutations in Sweden: a popu- lation-based study of mutational hetero- geneity. Br J Haematol 2001;113:81-6

2. Han KS, Park MH, Kim SI. Transfusion medicine. 3rd ed. Seoul: Korea Medical Book Publisher, 2006:145

3. High KA. Gene transfer as an approach to treating hemophilia. Circ Res 2001;88:137-44 4. Naldini L, Blömer U, Gallay P, Ory D,

Mulligan R, Gage FH, et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondi- viding cells by a lentiviral vector. Science 1996;

272:263-7

5. Oh TK, Li MZ, Kim ST. Gene therapy for diabetes mellitus in rats by intramuscular injection of lentivirus containing insulin gene.

Diabetes Res Clin Pract 2006;71:233-40 6. Oh TK, Quan GH, Park F, Kim ST. Correction

of anemia in uremic rats by intramuscular injection of lentivirus carrying an erythro- poietin gene. Am J Nephrol 2006;26:326-34 7. Bristol JA, Gallo-Penn A, Andrews J,

Idamakanti N, Kaleko M, Connelly S. Adeno- virus-mediated factor VIII gene expression results in attenuated anti-factor VIII-specific immunity in hemophilia a mice compared with factor VIII protein infusion. Human Gene Ther 2001;12:1651-61

8. Chao H, Samulski R, Bellinger D, Monahan P, Nichols T, Walsh C. Persistent expression of canine factor IX in hemophilia B canines. Gene Ther 1999;6:1695-704

9. Herzog RW, Yang EY, Couto LB, Hagstrom JN, Elwell D, Fields PA, et al. Long-term correction of canine hemophilia B by gene

transfer of blood coagulation factor IX mediated by adeno-associated viral vector.

Nat Med 1999;5:56-63

10. Wang L, Takabe K, Bidlingmaier SM, Ill CR, Verma IM. Sustained correction of bleeding disorder in hemophilia B mice by gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:3906- 10

11. Park F, Ohashi K, Kay MA. Therapeutic levels

of human factor VIII and IX using HIV-1 based lentiviral vectors in mouse liver. Blood 2000;96:1173-6

12. Zhang TP, Jin DY, Wardrop RM 3rd, Gui T, Maile R, Frelinger JA, et al. Transgene expression levels and kinetics determine risk of humoral immune response modeled in factor IX knockout and missense mutant mice.

Gene Ther 2007;14:429-40