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Improving Effects on Rats with Chronic Acid Reflux Esophagitis Treated of Coptidis Rhizoma Extract

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Academic year: 2021

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(1)

黃連 추출물의 만성 역류성 식도염 유발 흰쥐에 대한 개선 효과

김수현1#, 노성수1#, 이진아1, 신미래1, 이아름2, 구진숙3, 박해진4*

1 : 대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실, 2 : 호산대학교 뷰티디자인학과

3 : 안동대학교 자연과학대학 생약자원학과, 4 : 대구한의대학교 의과학대학 한방식품조리영양학부

Improving Effects on Rats with Chronic Acid Reflux Esophagitis Treated of Coptidis Rhizoma Extract

Soo Hyun Kim

1#

, Seong-Soo Roh

1#

, Jin A Lee

1

, Mi-Rae Shin

1

, Ah Reum Lee

2

, Jin Suk Koo

3

, Hae-Jin Park

4*

1 : Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, Republic of Korea 2 : Department of Beauty Design, Hosan University, Republic of Korea

3 : Department of Bioresource Science, Andong National University, Republic of Korea 4 : Faculty of Herbal Cuisine and Nutrition, Daegu Haany University, Republic of Korea

ABSTRACT

Objective : Chronic acid reflux esophagitis (CARE), one of gastroesophageal reflux disease (GERD) is increasing worldwide. Coptidis rhizoma extract (CRE) is a traditional herb that cures a variety of diseases. This study was conducted to evaluate the protective effect of CR on rats with chronic acid reflux esophagitis.

Methods : The antioxidant activities were evaluated through radical scavenging assays using 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) (ABTS) radical scavenging assays. CARE was surgically induced in 5-week-old male SD rats by ligating the border between forestomach and glandular portion with a 2-0 silk tie and covering the duodenum using 18-Fr Nélaton catheter. To evaluate the esophageal protective effect of CRE, rats were divided into 3 groups: Nor (normal rats), Veh (chronic acid reflux esophagitis induced rats), CR (chronic acid reflux esophagitis induced rats treated with CRE 200 ㎎/㎏ body weight).

Results : The administration of CRE significantly prevented the mucosal injury of the esophagus tissue and histological findings improved the esophageal lesion. It has been shown that inflammation is prevented by the increase of antioxidant-related factors (Nrf-2, HO-1, SOD, catalase, and GPx-1/2) through the antioxidant pathway of esophageal tissue. The administration of CRE reduced the increase of serum peroxynitrite (ONOO

-

) and markedly reduced the protein expression of inflammatory mediator such as NF-

Bp65, p-I

B

, iNOS, and IL-6.

Conclusions : Overall, these results suggest that CRE administration confirmed the protective effect of esophageal mucosa, suggesting that it is a potential treatment for chronic acid reflux esophagitis.

1)

Key words : Chronic acid reflux esophagitis, coptidis rhizoma, anti-oxidant, anti-inflammation

*Corresponding author : Hae-Jin Park, Department of Food Science and Nutrition, Daegu Haany University, 136, Sincheondong- ro, Suseong-gu, Daegu, Republic of Korea.

·Tel : +82-53-770-2332 ·Fax : +82-53-770-2335 ·E-mail : hjpark@dhu.ac.kr

#First author : Soo Hyun Kim, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, 136, Sincheondong-ro, Suseong-gu, Daegu, 42158, Republic of Korea.

·Tel : +82-53-770-2258 ·Fax : +82-53-768-6340 ·E-mail : hyunsk0513@gmail.com ·Received : 17 December 2018 ·Revised : 10 January 2019 ·Accepted : 25 January 2019

(2)

Ⅰ. 서 론

위식도 역류질환 (Gastroesophageal reflux disease: GERD) 은 최근 우리나라에서 빠르게 증가하는 추세이며, 2000년대 초반 3.5%에서 2013년도에는 7.6%로 높은 증가율을 나타냈 다

1)

. 역류성 식도염 (reflux esophagitis: RE)은 가슴쓰림, 구토, 목이물감, 만성기침, 소화불량 등 다양한 증상을 나타 내는 질환이고 일반적으로 비만, 과도한 음주, 흡연, 스트레 스 등 다양한 요인으로 인하여 발생한다고 알려져 있으며

2, 3)

, 또한 하부식도 괄약근의 기능저하로 인해 위 내용물들이 식도 로 역류하여 식도점막을 손상시켜 발병되어 지고 식도의 출 혈, 부종 및 괴사 등 형태학적 변화를 나타낸다

4, 5)

.

역류성 식도염의 치료제로는 위산의 낮은 ㏗를 조절해 식 도의 영향을 최소화하는 제산제 (antacid)와 위 장관 운동 촉 진제 (prokinetics)가 보편적으로 사용되어 왔으며

6, 7)

, 이후 기존 약물보다 산 분비를 억제하는 효과가 뛰어난 H

2

수용체 길항제 (histamine type 2 receptor antagonist)와 위산 분 비 억제제 (proton pump inhibitors)가 많이 사용되어 지고

있다

8, 9)

. 그러나 이들은 장기간 복용시 다양한 부작용들이 발

생된다고 보고되어져 있고

10)

, 또한 약물 복용을 중단하였을 경우 50% 이상의 높은 재발률을 나타낸다

11)

.

역류성 식도염의 식도점막 손상은 산의 역류로 인해 발생 되어 진다고 알려져 있으나, 그러나 최근 연구 결과에 따르면 산화적 스트레스로 인해 발생하는 것으로 밝혀졌고

12)

, 항산화 제 및 자유라디칼 소거제 투여로 인해 산화적 스트레스에 의 한 점막 손상을 감소시킨다고 보고 되어져 있다

13)

. 이에 따라 비교적 부작용이 적은 천연물에서 유래된 천연 항산화 소재에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

黃連 (Coptidis Rhizoma)은 미나리아재비과 (Ranuncu- laceae)의 여러해살이 초본식물의 뿌리를 제거한 뿌리줄기로 서, 특유의 냄새가 약간 있고 맛은 매우 쓰고 오래 남으며 성 질은 차다

14)

. 黃連의 구성성분으로는 berberine, coptisine, jateorrhizine, palmatine, worenine, columbaimne 등이 있으며, 주요성분인 berberin은 뛰어난 항균작용, 지혈작용, 항산화 및 항염증 효과 등 다양한 약리작용이 보고되어져 있

15-18)

. 한의학에서 黃連은 습 (濕)을 제거하고 화 (火)를 풀

며 해독하는 특징을 가지고 있고 心, 胃, 脾, 肝, 膽, 大腸經에 작용을 하며 嘔吐呑酸, 濕熱痞滿, 血熱吐衄, 黃疸, 高熱神昏 등의 치료에 활용된다고 알려져 있습니다

19)

.

따라서 본 연구에서는 黃連 추출물 (CRE)의 만성 역류성 식도염에 대한 약효를 평가하기 위하여

in virto

항산화 활성 을 측정하였고

in vivo

만성 역류성 식도염을 유발한 동물 모 델에서 항산화 및 항염증 기전에 대한 연구를 진행하여 유의 한 치료 효과를 얻었기에 이를 보고하고자 하는 바이다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 시료 제조

본 실험에 사용된 黃連은 휴먼허브 (영천, 한국)에서 구입

한 것을 생약규격집에 맞춰 관능검사하여 약전규격에 적합한 것만을 정선하여 사용하였다. 黃連 200 g에 증류수 2,000 ㎖ 을 가하여 DW-790 열탕 추출기 (대웅바이오, 충북, 한국)에 서 2시간 추출 하였다. 그 추출액을 여과하여 감압 증류장치 로 농축하고 그것을 다시 동결 건조기를 이용하여 완전 건조 한 분말을 (CRE 23.66 g, 11.83%) 얻었으며 실험에 사용하 기 직전까지 냉동 (-80℃)보관 하였다.

2. 실험동물

5주령 웅성 SD 흰쥐 (오리엔트, 서울, 한국)를 구입하여 물 과 고형사료 (조단백질 22.1% 이상, 조지방 8.0% 이하, 조섬 유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 0.6% 이상, 인 0.4%

이상, 삼양사, 항생제 무첨가, 삼양사, 경산, 한국)를 충분히 공급하며 1주간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였 다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22 ± 2℃, 습도 50 ± 5%, 명암주기는 12시간 주기로 조절 하였다. 실험은 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토 및 효율적인 관리를 위하여 대구한의대학교 동물실험윤리 위원 회 (Institutional Animal Care and Use Committee : IACUC)의 승인 (DHU2018-079)을 얻어 시행하였으며 동물 관리 규정을 준수하였다.

3. 시약

본 실험에 사용된 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 7 mM 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6- sulphonic acid) (ABTS), sodium hydroxide, potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Nitrocellulose membranes는 Amersham GE Healthcare (Little. Chalfont, UK)에서 구입하였고, nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf-2), heme oxygenase-1 (HO-1), super oxide dismutase (SOD), catalase, glutathione peroxidase-1/2 (GPx-1/2), nuclear factor-kappa B p65 (NF-

Bp65), inhibitor of nuclear factor kappa B alpha (I

B

), phosphorylation-inhibitor of nuclear factor kappa B alpha (p-I

B

), inducible nitric oxide synthase (iNOS), interleukin-6 (IL-6), histone,

-actin과 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였으며, Protease inhibitor mixture, DMSO, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka.

Japan)에서 구입하였다. 또한 2', 7'Dichlorofluorescein

diacetate (DCF-DA)와 Dihydrorhodamine 123는 Molecular

Probes (Eugene, OR, USA)에서 enhanced chemiluminescence

(ECL) western blotting detection reagents는 GE

Healthcare로 부터 구입하여 사용하였다. 단백질 정량을 위

한 BCA protein assay kit는 Thermo Scientific (Rockford,

IL, USA)에서 구입하였다.

(3)

4.

In vitro

항산화 활성

1) DPPH 자유 라디칼 소거 활성 측정

항산화 활성을 측정하는 방법으로 Blosis

20)

에 의한 DPPH free radical 소거법을 사용하였다. DPPH 라디칼 소거 활성 은 시료 중에 포함된 항산화 물질의 양을 측정하는데 사용되 는 대표적인 실험법이다. 일정농도의 시료 100 ㎕과 60

M DPPH 용액을 100 ㎕넣고 혼합한 후, 암소상태의 실온에서 30분간 반응시켰다. 이 반응액을 UV spectrophotometer (Infinite M200, Tecan, Salzburg, Austria)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 사용하여 측정하여 산출하였다. 시료 를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 50% 감소시키는데, 필 요한 시료의 양을 IC

50

값으로 나타내었다.

2) ABTS 자유 라디칼 소거 활성 측정

黃連 추출물의 항산화 효능을 비교 평가하기 위하여 ABTS 라디칼 소거활성을 측정하였다. 7 mM ABTS와 2.45 mM Potassium persulfate를 증류수에 녹인 다음 12시간 동안 차광하여 반응시킨 후, 이 반응액을 415 nm에서 ethanol을 이용하여 흡광도 0.70 ± 0.02로 보정하였다. ABTS 용액 95

㎕에 시료 5 ㎕를 첨가하고 15분 동안 반응시킨 후 415 nm 에서 흡광도를 측정하였다

21)

. 각 시료 추출물의 유리 라디칼 소거 활성은 시료를 첨가하지 않은 대조군과 시료첨가군의 흡 광도를 1/2로 억제하는 IC

50

값으로 나타내었다.

5. 만성 역류성 식도염 유발 동물실험

수술 24시간 전부터 절식한 후, Zoletile mixture (Vibrac, France)을 25 mg/kg 복강주사하여 마취하였다. 마취한 뒤, 2 cm 정도 개복을 하고, 위 대만부위를 실크실로 묶고, 인접 한 날문부위를 18-Fr Nelaton 카테터로 묶은 후 복막과 피 부를 봉합하였다

22)

. 감염을 예방하기 위하여 Gentamicin sulfate (항생제)와 Dexamethasone (항염증제)를 3일간 피 하주사 하였다. 수술 후 24시간 지나고 물을 공급하였고 48 시간 지나고 나서 사료를 공급하였다. 1주일간의 회복기간을 거친 후 실험은 아무런 처치를 하지 않는 정상군 (Normal rats; Nor), 만성 역류성 식도염을 유발 후 증류수를 투여한 대조군 (chronic acid reflux esophagitis induced rats;

Veh), 만성 역류성 식도염을 유발 후 黃連 추출물 200 ㎎/㎏

농도로 투여군 (chronic acid reflux esophagitis induced rats treated with coptidis rhizoma extract 200 ㎎/㎏

body weight; CR)으로 총 3그룹으로 분류하였으며, 모든 그 룹은 1일 1회 총 14일간 경구 투여하였다.

6. 조직학적 관찰

적출한 식도 조직을 고정한 다음, 광학 디지털 카메라 (DSCHX50V, Sony, Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하였 다. 손상된 식도점막 측정은 I-Solution lite (Innerview Co., Gyeonggido, Korea) 프로그램을 이용하여 실제 손상 부 위의 면적을 측정한 후, 식도 전체 면적과 비교하여 나타내 었다.

7. 혈청 내 산화적 스트레스 바이오 마커 측정

심장에서 채혈한 혈액을 4,000 rpm 10분 원심 분리하여 혈청을 얻었다. ONOO

-

를 측정하기위해 DHR123 buffer (rodamin buffer, 5 mM DTPA, 10 mM DHR123)와 혈청 을 혼합한 후, 37℃에서 5분간 교반하였다

23)

. 그 다음 emission wavelength of 535 nm와 excitation wavelength of 480 nm에서 측정한 값을 계산하여 나타내었다.

8. 식도 조직 western blotting

식도의 세포질을 얻기 위해 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM 염화마그네슘 (MgCl

2

), 15 mM 염화칼슘 (CaCl

2

), 1.5 M sucrose, 0.1 M DTT, protease inhibitor cocktail을 첨가한 buffer A를 넣고 조직 분쇄기 (tissue grinder) (Biospec Product, Bartlesville, OK, USA)로 분쇄한 후 10% NP-40 용액을 첨가하였다. 아 이스 위에서 20분간 정치시킨 후 12,000 rpm으로 2분간 원 심분리 하여 세포질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다.

핵을 얻기 위해 10% NP-40가 더해진 buffer A에 두 번 헹 구고 100 ㎕의 buffer C (50 mM HEPES, 50 mM 염화포타 슘 (KCl), 0.3 mM 염화소듐 (NaCl), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 10% glycerol를 첨가해 재부유시킨 뒤 10분마다 vortex을 3번 하였다. 4℃에서 12,000 rpm으 로 10분간 원심 분리한 후 핵을 포함하고 있는 상층액을 얻어

−80℃에서 각각 냉동 보관하였다. 식도 조직 내 세포질의

-actin, HO-1, SOD, catalase, GPx-1/2, I

B

, p-I

B

, iNOS, IL-6와 세포핵의 histone, Nrf-2, NF-

Bp65 단백 질 발현을 측정하기 위하여 10

g의 단백질을 8-15% SDS 폴리아크릴아미드겔을 이용하여 전기 연동 후, 아크릴아마 이드겔을 니트로셀룰로스막으로 이동시켰다. 준비된 막 (membrane)에 각각의 1차 antibody (PBS-T로 1:1000로 희석해서 사용)를 처리하여 4℃에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 6분마다 5회 세척하고, 각각 2차 항체 (PBS-T 로 1:3000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 2시간 반응시킨 후, 다시 PBS-T로 6분마다 5회 세척하였다. 그리 고 membrane을 ECL 용액에 노출시킨 후, Sensi-Q2000 Chemidoc (Lugen Sci Co., Ltd., Seoul, Korea)에 감광시 켜 단백질 발현을 확인한 후, 해당 band를 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan) 프로그램을 사용하여 정량하였다.

9. 통계분석

In vitro

항산화 활성 측정은 평균과 표준편차로,

in vivo

CARE 동물실험은 평균과 표준오차로 표시하였으며, SPSS (Version 24.0, IBM, Armonk, NY, USA)를 사용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시한 후 least-significant differences (LSD) test로 사후검증을 실 시하여 각 군의 평균 차이에 대한 통계적 유의성을 p-value

< 0.05에서 검증하였다.

(4)

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000

Nor Veh CR

Gross mucosal injury area (AU)

(A) (B) (C) (D)

***

###

Fig. 1. Chronic acid reflux esophagitis and representative image of the degree of esophageal mucosal ulcer in each group of rats.

(A) Nor; normal rat, (B) Veh; chronic acid reflux esophagitis rat, (C) CR; chronic acid reflux esophagitis rat treated with CRE 200

㎎/㎏ body weight, (D) The gross mucosal injury area in esophagus of rat. All data are expressed means ± SEM, n=6 rats per group. Significance: ###p < 0.001 vs. normal rat, ***p < 0.001 vs. chronic acid reflux esophagitis rat.

Ⅲ. 결 과

1. 항산화 활성 측정

黃連 추출물의 항산화 활성을 평가하기 위해 DPPH, ABTS 라디칼 소거능 방법을 통하여 측정하였다. 양성대조군 으로는 L-ascorbic acid을 사용하였고 각각의 측정한 결과를 IC

50

값으로 나타냈다. DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결 과 양성대조군인 L-ascorbic acid의 IC

50

값은 1.79 ± 0.02

㎍/㎖으로 높은 항산화 활성을 나타냈고 黃連 추출물은 43.03

± 0.22 ㎍/㎖으로 높은 항산화 활성을 나타냈다. ABTS 라 디칼 소거 활성을 측정한 결과 L-ascorbic acid의 IC

50

값은 3.69 ± 0.08 ㎍/㎖이고 黃連 추출물의 IC

50

값은 31.89 ± 0.71 ㎍/㎖으로 높은 항산화 활성을 나타냈다.

Sample

Radical scavenging activity (IC50) DPPH free radical

(㎍/㎖)

ABTS free radical (㎍/㎖) L-ascorbic acid 1.79 ± 0.02 3.69 ± 0.08

CRE 43.03 ± 0.22 31.89 ± 0.71

All values are mean ± SD of three replications Table 1. Anti-oxidant Effects of CRE

2. 식도점막 손상도 측정

식도점막의 손상도를 측정한 결과, 정상군에서는 식도점 막의 손상이 발견되지 않았으나, 만성 역류성 식도염을 유발 한 대조군는 하부식도 부근에서 손상이 나타났고, 정상군에 비해 손상 부위 면적이 8020.28 ± 334.37 AU으로 유의성 (

p

<0.001) 있게 증가하였다. 약물처리군인 CR 처치군은 1656.82 ± 142.06 AU으로 대조군에 비해 식도점막의 손상 이 유의성 (

p

<0.001) 있는 개선효과를 나타냈다.

3. 혈청 내 산화적 스트레스 바이오 마커 측정

혈청 내 산화적 스트레스 바이오 마커인 ONOO

-

를 측정한 결과 정상군 8506.60 ± 85.01 fluorescence/㎖에 비해 대 조군은 9455.50 ± 96.22 fluorescence/㎖으로 유의성

(

p

<0.01) 있게 증가 하였으며, 대조군에 비해 CR 처치군 7886.77 ± 395.27 fluorescence/㎖은 유의성 (

p

<0.001) 있게 감소하였다.

0 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 12,000

Nor Veh CR

O N O O

-

(f lu o re sc en ce /㎖ )

***

##

Fig. 2. Oxidative stress biomarker ONOO- in serum.

Nor; normal rat, Veh; chronic acid reflux esophagitis rat, CR;

chronic acid reflux esophagitis rat treated with CRE 200 ㎎/㎏

body weight. All data are expressed means ± SEM, n=6 rats per group. Significance: ##p < 0.01 vs. normal rat, ***p < 0.001 vs.

chronic acid reflux esophagitis rat.

4. 식도 조직의 항산화 단백질 발현

식도 조직에서 western blot을 실시하여 항산화 인자의 발

현을 측정하였다. 그 결과 항산화 전사 인자인 Nrf-2의 발현

은 정상군 1.00 ± 0.08에 비해 대조군 0.69 ± 0.06은 유의

성 (

p

<0.05) 있게 감소였으며, 대조군에 비해 약물처리군인

CR 처치군은 1.16 ± 0.12으로 유의성 (

p

<0.01) 있는 증가

를 나타냈다. 항산화 효소인 HO-1의 단백질 발현을 측정한

결과, 정상군 1.00 ± 0.07에 비해 대조군 0.77 ± 0.05은

유의성 (

p

<0.01) 있게 감소하였고 약물처리군인 CR 처치군

1.04 ± 0.05은 대조군에 비해 유의성 (

p

<0.01) 있게 증가하

였다. SOD의 단백질 발현은 정상군 1.00 ± 0.05에 비해 대

조군 0.78 ± 0.05은 유의성 (

p

<0.01) 있게 감소함을 나타냈

고, 대조군에 비해 CR 처치군 1.03 ± 0.02은 유의성 (

p

<0.01)

(5)

0.0 0.5 1.0 1.5

Nor Veh CR

(fold of N)

0.0 0.5 1.0 1.5

Nor Veh CR

(fold of N)

**

#

**

##

b-Actin HO-1 Histone

Nrf-2

(A) (B)

0.0 0.5 1.0 1.5

Nor Veh CR

(fold of N)

***

###

GPx-1/2

0.0 0.5 1.0 1.5

Nor Veh CR

(fold of N)

**

##

b-Actin SOD

b-Actin

0.0 0.5 1.0 1.5

Nor Veh CR

(fold of N)

***

###

Catalase b-Actin

(C) (D) (E)

Fig. 3. Expression of anti-oxidant enzyme in esophagus tissues.

Western blot analysis of Nrf-2, HO-1, SOD, catalase, GPx-1/2, histone, and -actin expression; (A); Nrf-2, (B);

HO-1, (C); SOD, (D); catalase, (E); GPx-1/2, Expression levels in the esophagus. Nor; normal rat, Veh; chronic acid reflux esophagitis rat, CR; chronic acid reflux esophagitis rat treated with CRE 200 ㎎/㎏ body weight. All data are expressed means ± SEM, n=6 rats per group. Significance: #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001 vs. normal rat,

**p < 0.01, ***p < 0.001 vs. chronic acid reflux esophagitis rat.

있는 증가함을 나타냈으며, catalase의 단백질 발현은 정상군 1.00 ± 0.05에 비해 대조군 0.76 ± 0.02은 유의성 (

p

<0.001) 있게 감소하였고, 약물처리군인 CR 처치군은 1.13 ± 0.04 으로 대조군에 비해 유의성 (

p

<0.001) 있게 증가하였다. 또 한, GPx-1/2의 단백질 발현량은 정상군 1.00 ± 0.07에 비 해 대조군 0.72 ± 0.04은 유의성 (

p

<0.001) 있게 감소하였 으며, 약물처리군인 CR 처치군 1.10 ± 0.03은 대조군에 비 해 유의성 (

p

<0.001) 있는 증가를 나타냈다.

5. 식도 조직의 염증성 단백질 발현

식도 조직에서 western blot을 실시하여 염증성 인자의 발 현을 측정하였다. 대표적인 염증성 전사 인자로 알려진 NF-

Bp65와 인산화된 I

B

의 발혈량 측정한 결과, NF-

Bp65 의 발현이 정상군 1.00 ± 0.13에 비해 대조군 1.73 ± 0.10 은 유의성 (

p

<0.001) 있게 증가하였으나, 대조군에 비해 약물 처리군인 CR 처치군 1.23 ± 0.07은 유의성 (

p

<0.01) 있게 감소하는 것으로 나타났다. 또한 인산화된 I

B

정상군 1.00

± 0.05에 비해 대조군 2.66 ± 0.23에서는 인산화된 I

B

의 발현이 유의성 (

p

<0.001) 있게 증가하였으나, CR 처치군

1.96 ± 0.10은 대조군에 비해 유의성 (

p

<0.01) 있게 감소하 였다.

CRE의 처리가 만성 역류성 식도염 유발 실험동물의 식도 조직 내 염증성 싸이토 카인인 iNOS, IL-6 발현을 측정한 결 과, iNOS의 경우 정상군 1.00 ± 0.05에 비해 대조군 3.16

± 0.27은 유의성 (

p

<0.001) 있게 증가하였고 CR 처치군 2.57 ± 0.04은 대조군에 비해 유의성 (

p

<0.01) 있는 감소를 나타냈다. 또한 IL-6 단백질 발현을 측정한 결과, 정상군 1.00

± 0.11에 비해 대조군 2.52 ± 0.15은 유의성 (

p

<0.001) 있 게 증가하였고 CR 처치군 2.01 ± 0.10은 대조군에 비해 유 의성 (

p

<0.01) 있게 IL-6 단백질 발현량을 감소시켰다.

Ⅳ. 고 찰

위식도 역류 질환은 위의 내용물이 식도 내로 역류하여 식 도점막을 손상시키는 질환이며 치료방법으로는 위산의 ㏗나 위장관 운동을 조절하는 치료제를 복용하는 치료방법이 있다.

하지만 이러한 치료방법은 다양한 부작용 및 하부 식도 괄약

근을 회복시키지 못해 재발되어지는 문제가 있으며, 이에 따

(6)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Nor Veh CR

(fold of N)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

Nor Veh CR

(fold of N)

(A) (B)

**

###

###

**

Histone

NF-κBp65 p-IκBα

IκBα

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

Nor Veh CR

(fold of N)

###

*

b-Actin iNOS

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

Nor Veh CR

(fold of N)

*

###

IL-6 b-Actin

(C) (D)

Fig. 4. Expression of inflammatory factors in esophagus tissues.

Western blot analysis of NF-Bp65, p-IB, iNOS, IL-6, histone, IB, and -actin expression; (A); NF-Bp65, (B); p-IB, (C); iNOS, (D); IL-6. Expression levels in the esophagus. Nor; normal rat, Veh; chronic acid reflux esophagitis rat, CR; chronic acid reflux esophagitis rat treated with CRE 200 ㎎/㎏ body weight. All data are expressed mean s ± SEM, n=6 rats per group. Significance: ###p < 0.001 vs. normal rat, *p < 0.05, **p < 0.01 vs.

chronic acid reflux esophagitis rat.

라 기존 치료제 이외의 새로운 치료방법이 필요한 실정이다

24)

. 최근, 항산화제가 역류성 식도염에 유효한 효과를 나타낸다는 것으로 보고되었으며, 이는 식도에서 발생된 과도한 자유 라 디칼로 인해 일어나는 식도 점막 손상을 항산화제가 막아줌으 로서 증상의 개선효과를 나타내는 것을 말한다

25)

.

본 연구는 만성적인 역류성 식도염의 새로운 치료제를 개 발하기 위한 연구로서 黃連 추출물의

in vitro

항산화 활성을 측정하였고

in vivo

만성 역류성 식도염 동물모델에서 黃連 추출물의 효과를 확인하기 위하여 역류성 식도염을 유발 후 2 주간 黃連 추출물을 투여하여 육안적 손상면적, 혈청 내 산화 적 스트레스 바이오 마커, 항산화 관련 인자와 염증성 관련 인자의 단백질 발현량을 측정하여 분석하였다.

In vitro

항산화 활성을 측정하기 위하여 DPPH와 ABTS free radical 소거능 측정 방법을 이용하여 측정하였는데, DPPH와 ABTS 소거능 측정 방법은 각각 라디칼과 항산화 물 질이 결합하는 정도의 차이가 있기 때문에 2가지 방법을 이용 하여 측정하였으며

26)

, 항산화 활성이 높을수록 radical 소거 활성이 증가된다고 알려져 있다

27)

. 실험결과, 黃連 추출물은 DPPH free radical 소거능 IC

50

값은 43.03 ± 0.22 ㎍/㎖,

ABTS free radical 소거능 IC

50

값은 31.89 ± 0.71 ㎍/㎖으 로 높은 라디칼 소거능을 나타내어, 黃連 추출물이 높은 항산 화 활성을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다 (Table 1).

역류성 식도염을 유발한 동물 모델에 黃連 추출물을 14일 간 투여한 후 식도점막의 보호효과에 대해 분석하였다. 식도 점막을 육안적으로 관찰한 결과, 정상군은 식도점막의 손상이 나타나지 않았으나 대조군에서는 역류성 식도염 유발로 인하 여 하부식도 부근에서 점막에 데미지를 받아 부종 및 궤양이 뚜렷하게 나타났다. 반면 약물처리군인 CR 처치군은 부종 및 궤양이 감소하였고, 손상 면적 측정한 결과 또한 CR 처치군 이 식도점막 손상이 현저히 감소됨을 나타냈다 (Fig. 1).

최근 연구에서 산화적 스트레스는 만성 역류성 식도염 모

델에서 데미지를 발생 시키는 매우 중요한 인자로 알려져 있

고, 산화적 스트레스는 세포를 손상시키고 염증을 일으켜 여

러 질환 발병 원인으로 알려져 있다

28-30)

. 혈청 내 ONOO

-

levels를 측정한 결과, 정상군에 비해 대조군은 유의성 있게

증가하였으나 이를 약물 처치군인 CR 처치군이 유의성 있게

감소시켰다. 이로 인하여 黃連 추출물은 산화적 스트레스를

감소시켜 식도점막 손상을 개선시킬 수 있다고 사료 된다

(7)

(Fig. 2).

항산화 관련 인자 세포 내의 증가된 산화적 스트레스를 조 절하며 방어기전 역할을 한다고 알려져 있다

31)

. 식도 조직을 분쇄하여 western blot을 통해 항산화 전사 인자인 Nrf-2와 항산화 효소 단백질인 HO-1, SOD, catalase, GPx-1/2의 단백질 발현량을 측정한 결과, 전체적으로 대조군은 정상군에 비해 항산화 관련 인자들이 감소하는 경향을 보였고, 반면 CR 처치군은 대조군에 비해 유의하게 높은 단백질 발현을 나 타냈다. 이로 인해 黃連 추출물은 만성 역류성 식도염 동물모 델에서 항산화 경로를 통해 보호효과가 있다고 판단되어진다 (Fig. 3).

염증 반응에서 NF-

B는 전사인자로서 세포질에서 I

B

와 결합하여 있지만 산화적 스트레스 등의 자극에 의해서 인 산화된 I

B

와 분리되어져 핵 내로 이동하여 염증성 싸이토 카인과 염증성 매개인자의 발현을 유도하고, 또한 염증 반응 을 촉진하는 역할을 한다

32-34)

. 만성 역류성 식도염 동물모델 에서 黃連 추출물의 투여가 염증성 인자 발현이 미치는 영향 을 측정하기 위하여 식도 조직을 분쇄하여 western blot을 통 해 단백질 발현량을 분석하였다. 전사인자인 NF-

Bp65와 p-I

B

는 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있게 증가하였 으나 CR 처치군은 유의성 있게 감소시켰다. 또한, 염증성 싸 이토카인인 iNOS와 IL-6의 발현 정상군에 비해 대조군은 유 의성 있게 증가하였으나 이를 약물처리군인 CR 처치군이 유 의성 있게 감소 시켰다. 黃連 추출물은 만성 역류성 식도염 동물 모델에서 식도 조직 내에서 염증 전사 인자와 염증성 싸 이토카인을 유의성 있게 억제 하였고, 이로 인해 黃連 추출물 의 투여는 식도점막의 손상을 보호 효과가 있다고 판단되어진 다 (Fig. 4).

Ⅴ. 결 론

본 논문에서는 만성적인 역류성 식도염에서 黃連 추출물의 효과를 확인하기 위해

in vitro

항산화 활성을 측정 하였고, 만성 역류성 식도염 동물모델에서 산화적 스트레스 바이오 마 커, 항산화 관련 인자 및 염증성 인자를 측정하여 분석하였고 그 결과는 다음과 같다.

1. 黃連 추출물의 항산화 활성을 측정한 결과, DPPH와 ABTS free radical 모두 뛰어난 소거능을 나타내 높은 항산화 활성을 나타냈다.

2. 黃連 추출물의 투여는 만성 역류성 식도염 동물모델에서 식도점막의 손상을 유의하게 감소시켰다.

3. 黃連 추출물의 투여는 만성 역류성 식도염 동물모델에서 산화적 스트레스 바이오 마커인 ONOO

-

level를 혈청 내 에서 유의하게 감소시켰다.

4. 黃連 추출물의 투여는 만성 역류성 식도염 동물모델에서 식도 조직 내 항산화 관련 인자인 Nrf-2, HO-1, SOD, catalase 및 GPx-1/2의 발현을 유의하게 증가시켰다.

5. 黃連 추출물의 투여는 만성 역류성 식도염 동물모델에서 식도 조직 내 염증성 인자인 NF-

Bp65, p-I

B

, iNOS 및 IL-6의 발현을 유의하게 감소시켰다.

따라서 黃連 추출물의 투여가 만성 역류성 식도염 개선에 효과가 있다고 사료된다.

감사의 글

본 연구결과는 2017년도 한국연구재단에서 시행한 중견연 구자지원사업 (NRF-2017R1A2B2006858) 지원에 의해 수 행 되었습니다.

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수치

Fig. 1. Chronic acid reflux esophagitis and representative image of the degree of esophageal mucosal ulcer in each group of rats.
Fig. 3. Expression of anti-oxidant enzyme in esophagus tissues.
Fig. 4. Expression of inflammatory factors in esophagus tissues.

참조

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