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J. Mushrooms 2016 June, 14(2): 64-69 http://dx.doi.org/10.14480/JM.2016.14.2. 64 Print ISSN 1738-0294, Online ISSN 2288-8853
© The Korean Society of Mushroom Science
*Corresponding author E-mail : [email protected]
Tel : +82-55-254-1354, Fax : +82-55-254-1319 Received May 17, 2016
Revised June 27, 2016 Accepted June 30, 2016
큰느타리버섯 단핵균주 간 교잡에 의한 저장우수형 품종
“단비5호” 육성 및 특성
이영한 · 김야엘 · 석수원 · 정정민 · 류재산 · 허재영 · 김희대 · 최용조 · 김민근*
경상남도농업기술원 친환경연구과
Mband characterization of a cultivar “DanBi 5Ho”
with a long shelf life
Young-Han Lee, Ya-El Kim, Su-Won Seuk, Jeong-Min Jeong, Jae-San Ryu, Jae-Young Heo, Hee-Dae Kim, Yong-Jo Choe, and Min-Keun Kim*
Division of Environment-friendly Research, Gyeong sang nam-do Agricultural Research and Extension Services, Jinju 52733, Republic of Korea
ABSTRACT: Pleurotus eryngii is one of the most widely cultivated and important edible mushrooms. However, the shelf life of the
fruiting body is short, which . To solve this problem, a new cultivar, DanBi 5Ho, of Pleurotus eryngii was developed by mono- mono crossing between monokaryotic strains derived from KNR2598 and KNR2610. The optimum temperature formycelial growth was 25 and that forfruiting body development was 15–16. The quality did not change after a period of 40.0 d at 4. This result was significantly different compared to that ofthe control strain Knneuari 2 Ho. Analysis of genetic characteristics of the new hybrid strain DanBi 5Ho revealeda different profile thanthat of the parental and control strains when random amplification of polymorphic DNA (RAPD) primers we used. The results obtained from this study show that DanBi 5Ho is a new hybrid strain, characterized by improved storability after harvesting.
KEYWORDS:
DanBi 5Ho, Mushroom, New cultivar, Pleurotus eryngii, Shelf-life
서 론
큰느타리버섯(Pleurotus eryngii)은 분류학적으로 담자균 아문(Basidiomycotina), 주름버섯목(Agaricales), 느타리버 섯과(Pleurotaceae), 느타리버섯속(Pleurotus)에 속하는 사물 기생균(Zadrazil, 1974)으로 주로 아열대 지방이나 수목이
없는 초원지대, 남유럽, 중앙아시아 및 북아프리카 등에 널 리 분포하며 “King oyster mushroom” 이라고도 불린다.
Rajarathnam and Bano (1987)에 의하면 큰느타리버섯 인공 재배에 관한 연구는 1958년 Kalmar에 의해 최초로 시도된 것으로 보고되어 있으며, 국내의 경우 1997년부터 보고되 기 시작 하였다(Kim et al, 1997a 1997b). 많은 연구자들 에 의해 큰느타리버섯의 혈당 및 혈중 콜레스테롤 저하기 능(강 등, 2001), 대장암 세포 증식 억제 및 세포 사멸효과 (Hwang et al, 2003), angiotensin converting enzyme 저해 활성 효과(Kang et al, 2003) 및 항산화 활성(Hui et al, 2002) 등이 보고되어 있다. 1990년대 후반 시험재배를 통 해 버섯농가에 보급 된 후 경남, 경북, 전남지역을 중심으 로 그 재배면적과 생산량은 급격히 증가 하였다. 2014년 기준 47,914톤이 생산되어 전체버섯 생산량의 26.2%를 차 지할 정도로 대중적인 식용버섯으로 자리를 잡았으며, 이 들 중 4,116톤이 네덜란드, 미국, 캐나다, 호주, 일본 등으 로 수출되고 있어 주요 버섯 수출품목으로 인식되고 있다 (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, 2015). 그
러나 큰느타리버섯의 경우 장기간 소요되는 수송과정 및 현지 유통과정에서 변질되는 경우가 있어 해외수출에 문 제점으로 지적되고 있다. 따라서 큰느타리버섯에 대한 저 온 저장성이 우수한 품종육성이나 재배기술 개발이 필요 한 실정이다. 버섯의 육종은 단핵균사간의 교잡, 원형질체 융합, 유전자 삽입에 의한 형질전환 등 다양한 방법에 의해 이루어지고 있다. Chakraborty and Sikdar (2008) 등은 Pleurotus florida 와 Volvariella volvacea간의 원형질 융합 을 통해 온도내성형의 느타리류를 육성하였다. 또한 유전 자 조작을 이용한 육종방법으로 Agrobacterium tumefaciens 를 이용한 형절전환 (Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)이나 제한효소를 이용한 외부유전자 도입 (Restriction enzyme-mediated integration)을 통해 새로운 품종을 만들고자 하는 연구들이 진행되어 왔으나 상업적으 로 이용 가능한 품종을 개발하는데 있어서는 한계점이 있 다(Chen et al, 2000; Mikosch et al, 2001). 이러한 이유로 대부분의 식용버섯 품종육성은 단핵균사 간의 교잡을 통한 방법들이 전형적으로 이용되고 있다. 2016년 기준 큰느타 리버섯의 경우 단핵균사 또는 이핵균사와 단핵균사간의 교 잡방법들을 이용하여 국내기관에서 단비 등 15점, 해외 종 자업체에서 1점이 품종보호 출원되었으며, 이들 중 국내기 관에서 출원 신청된 8점이 품종보호등록 완료 되었다 (Korea Seed and Variety Service, 2016). 이러한 큰느타리 버섯 품종 수는 52점이 등록되어 있는 느타리버섯이나 18 점이 등록되어 있는 팽이버섯에 비하면 많이 부족하며 품 종 다양성 측면에 있어서도 보다 많은 형질의 큰느타리버 섯 신품종육성 및 등록이 필요한 실정이다(Korea Seed and Variety Service, 2016). 본 연구에서는 장기간 소요되는 해 외 수출에 적합한 고품질의 저온 저장성이 우수한 큰느타 리버섯 신품종을 “단비5호”의 육성 및 주요 특성에 관한 내용을 보고하고자 한다.
재료 및 방법
시험균주 및 배양
품종 육성을 위한 모본으로 사용된 균주는 KNR2598 및 KNR2610으로 경상남도농업기술원 버섯연구실에 수집 보 관 중인 균주를 이용 하였으며, 대조품종으로는 큰느타리 버섯 3호를 사용하였다. 균주배양, 포자 분리, 계대 및 단포 자간 교잡은 Rape 등(1972)에 의해 사용된 MCM배지 (Mushroom Complete Medium; Dextrose 20 g, MgSO4
·7H2O 0.5 g, KH2PO4 0.46 g, K2HPO4 1.0 g, Yeast extract 2 g, Peptone 2 g, Agar 18g/L)를 이용 하여 25oC에서 배양 하였다.
단핵균주 분리 및 교잡계통 육성
담자포자 분리는 자실체 갓 부위를 멸균 샤레에 12~14시 간 정도 거치하여 채취하였다. 낙하된 포자는 멸균수를 이
용하여 회수 한 뒤 -70oC의 저온냉동고에 저장하고 필요시 순차적 희석법을 통해 버섯 완전배지(MCM)에서 도말하여 25℃에서 배양하였다. 3~5일 후 발아된 포자는 버섯완전배 지에 하나씩 분리하여 25oC에서 약 7일정도 배양시킨 다음 현미경을 이용하여 꺽쇠연결체가 형성되지 않은 것만을 선발하여 교잡균주 육성을 위한 단핵균주로 사용하였다.
단핵균주 간 교잡은 버섯완전배지에 약 10~15 mm 간격 을 두고 접종한 뒤 25oC에서 약 7일정도 배양 하였다. 단 핵균주 간 접합이 확인 되면 광학현미경을 이용하여 꺽쇠 연결체 형성유무를 확인을 통해 꺽쇠연결체가 형성된 것 만을 교잡계통으로 선발하여 품종육성을 위한 특성검증 에 이용하였다.
균사대치배양 및 DNA 다형성 분석
선발계통과 대조품종간의 구별성을 확인하기 위하여 대 치배양 및 RAPD(Random Amplification of Polymorphic DNA) 분석을 통해 유전적 다형성 검증을 실시하였다. 대 치배양은 MCM 배지위에 선발계통과 대조품종을 50 mm 간격을 두고 미리 배양된 균사를 (5*5 mm) 접종하여 25°C 에서 14일간 배양하면서 버섯균사 간에 대치선 형성유무를 확인하였다. 유전적 다형성 검증은 Raeder과Broda(1985) 가 사용한 곰팡이로부터의 genome DNA 추출방법을 이 용하여 교잡계통의 genome DNA를 추출 하였다. 모본 및 교잡계통에 대한 RAPD분석은 #8005 primer (5'- GAAACGGGTG-3')를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응조건은 95oC 5분간 반응 시킨 뒤 94oC 1분, 37oC 1분, 72oC 2분간 45cycle 반응 시키고 72oC 10분간 연장반응 후 완료하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.2% agarose gel에 전기 영동 한 후 EtBr 용액으로 염색하여 UV transilluminator에 서 DNA 증폭 밴드를 확인 하였다.
교잡계통 선발 및 자실체 특성 분석
교잡계통의 배양 및 생육특성 검증을 위한 배지는 포플 러나무톱밥, 밀기울, 미강 및 건비지를 61:20:16:3(%, w/w) 수준으로 혼합하고 배지수분을 65% 내외로 조정한 뒤 121oC에서 90분간 고압 살균하였다. 살균이 완료된 것은 냉각실에서 상온까지 냉각시킨 뒤 배양이 완료된 MCM 평 판배지 균사체를 약 1.0 cm 크기로 잘라 접종하여 24oC 내 외에서 35일간 배양하였다. 배양이 완료된 배지는 균긁기 후 발이실로 옮겨 실내온도 15±1oC, 상대습도 95-98%, 이 산화탄소농도 1,000±100 ppm의 조건에서 버섯 발이를 유 도 하였으며, 발이 이후에는 적정 생육조건인 실내온도 15±1oC, 상대습도 80-90%, 이산화탄소농도 700±100 ppm 에서 수확기까지 관리 하였다. 균긁기 뒤 원기형성 이후 어 린 갓이 형성된 기간을 발이 소요일수로 하였으며, 균긁기 이후 자실체 수확이 될 때까지의 기간을 생육소요 일수로 나타내었다. 한편, 자실체 특성으로 발이개체수를 기준으로 원기형성이후 발이수준을 초발이도, 솎음 작업이전까지의
발이수준을 후발이도로 나타내었다. 버섯의 발이도는 버섯 의 발이개체 수에 따라 발이 수준을 수치화 하였으며 850 cc (Ø60 mm) 플라스틱 병 기준으로 전체 발이 개체수 가 0~25개 인 것을 1, 25~50개인 것을 2, 50~75개 인 것을 3, 75~100개 이상인 것을 4로 표시하였다. 품질의 경우 대 길이, 대두께, 갓직경, 개체무게 및 형태를 기준으로 9점법 으로 측정하였으며 품질이 우수할수록 높은 숫자로 표기하 였다. 그 외에 자실체 수량 및 특성은 농촌진흥청 표준조사 법에 준하여 조사하였다.
자실체의 저장성 및 경도 조사
선발계통에 대한 저장성은 polyethylene terephthalate 재 질의 사각트레이 (190 mm×150 mm×58 mm) 에 자실체를 넣은 뒤 4oC에 두고 자실체의 갓과 대표면의 색깔 변화를 조사하였다. 한편 최종 저장기간의 결정은 자실체 표면에 서 갈변증상을 동반한 수축 또는 변형증상을 보이는 시점 으로 하였다. 경도측정은 경도계를 이용하여 자실체의 대 표면을 대상으로 상부, 중부, 하부로 나누어서 5 mm aluminum cylindrical probe를 이용하여 측정하였다.
통계분석
버섯의 생육결과에 대한 특성분석은 SAS 프로그램 9.1.3 버전을 사용하였다. 육성품종 및 대조품종 간의 생 육특성 분석은 3반복 시험결과를 이용하였으며 5% 수준 에서 Tukey’s studentized range test를 통해 비교 검토하였다.
결과 및 고찰
육성과정
경상남도농업기술원에 보관중인 큰느타리버섯 균주 약 100여 계통에 대해 자실체 특성검증을 실시하였다. 이들 계 통에서 고품질의 저온 저장성이 우수한 품종 육성을 위해 품질이 우수한 KNR2598계통과 경도가 우수한 KNR2610 계통을 선발하였다. 선발계통으로부터 단핵균주를 분리하 였으며 이들 중 20개씩을 대상으로 서로 교잡하여 꺽쇠연 결체가 형성된 129개의 교잡체를 확보하였다. 교잡체에 대 한 특성검증은 앞서 언급된 방법으로 이루어 졌으며 품질 이 우수하면서 저장성이 우수한 특성을 보이는 7계통을 1 차적으로 선발하였다. 1차 선발 계통에 대한 재시험 과정을 통해 품종으로서 가치가 있는 3계통을 확보하고 최종적으 로 농가 실증시험을 통해 가장 우수한 특성을 나타내는 KNR2598-17×KNR2610-12 교잡계통을 고품질의 저장성이 우수 계통으로 선발하여 “단비5호”라 명명하였다.
DNA 다형성 분석
신품종 “단비5호”와 대조품종간의 DNA 다형성 및 구별 성을 확인하고자 RAPD를 수행한 결과 두 품종간에 뚜렷 히 구별되는 밴드양상을 보였다(Fig. 1). 이러한 결과는 신
품종 “단비5호”와 현재 농가에서 재배되고 있는 품종간의 구별 방법으로 활용될 수 있을 것으로 기대되며 품종 혼입 및 불법 사용에 따른 피해를 예방 할 수 있는 방법으로서 가치가 있을 것으로 기대된다.
균사배양 및 자실체 특성
버섯완전배지(MCM)에서 각각 다른 온도별로 균사를 배 양한 결과 25oC에서 균사생장이 가장 우수한 특성을 나타 내었다(Table 1). 대조품종과의 대치배양결과 뚜렷하게 구 분되는 대치선이 형성되는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 2).
큰느타리버섯 “단비5호”의 톱밥배지 접종 후 배양적정 온 도는 25oC 내외이며 버섯의 원기형성 및 생육적정 온도는 15~16oC 내외로 대조품종과 큰 차이가 없었다. 버섯의 발 생은 개체형으로 형성되었으며, 대하부가 상부에 비해 두 터운 특성이 있고 갓 색은 중간수준의 갈색을 보였다(Fig.
3). 버섯 배지에 접종 한 후 25oC에서 35일간 배양과정에서 배양소요일수를 확인 한 결과 단비5호의 경우 33.8±1.2일 로 대조품종 33.8±0.9일과 차이를 보이지 않았다. 균긁기 이후 발이소요일수를 포함한 수확소요 일수는 솎음기준으 로 대조품종의 경우 15.7~17.7일이었으며 “단비5호” 의 경 우 15.2~16.0일로 약 0.5~1.7일정도 빠른 특성을 보였다 Fig. 1. RAPD profiles of hybrid strain and other strains using primer uiniversal primer #8005. The arrows indicate the difference fragments. S/M, molecular size marker (100bp plus ladder); A, KNR2598-17; B, KNR2610-12; C, new hybrid strian DanBi 5Ho; D, Knneutari 2Ho.
(Table 2). 자실체 특성의 경우 신품종 “단비5호”가 대조품 종에 비해 대길이, 대두께, 개체무게 등에서 차이를 보였지 만 경도의 경우 상부와 중부에서는 단비5호가 높은 값을 나타내었고 하부의 경우 대조품종에 비해 낮은 값을 나타 내었다. 한편 4oC에서의 저장성 조사결과 “단비5호”의 경 우 56.0~60.0일로 20.0일 이후 버섯의 대와 갓 표면에서 갈 변이 시작되는 대조품종에 비해 24.6~30.6일 이상 더 저장 성이 우수한 것으로 확인 되었다(Table 3 & Fig. 4). Kim et al. (2013)의 보고에 의하면 버섯의 경도와 저장성 간의 상관관계 분석결과 중부의 경도는 저장성에 있어 정의 상 관관계가 있으며, 하부의 경도는 저장성에 있어 역의 상관 관계가 있다고 보고하였다. “단비5호”의 경우에 Kim et al.
Table 1. Mycelial growth of new cultivar “Dan Bi 5Ho” on the different temperature
Cultivar Mycelial growth (mm/7days) 15
oC 20
oC 25
oC 30
oC DanBi 5Ho 18.7±0.5
a36.2±1.6 48.0±2.9 38.3±3.3
Knneutari
2Ho 13.8±0.6 21.5±0.7 47.2±1.2 41.8±1.5
a
Value represent mean ± S.D of three experiments
Fig. 2. Determination of antagonism between the new hybrid strain DanBi 5Ho (A) and Knneutari 2Ho (B).
Table. 3. Characteristics of fruit body of new cultivar “Dan Bi 5Ho” cultivated by bottle cultivation
Cultivar Stipe length (mm)
Stipe diameter (mm)
Pileus diameter (mm)
Individual weight
(g)
Quality
a(1-9)
Hardness (g/5mmØ)
Storage period (days)
upper middle bottom
DanBi 5Ho 121.5±7.4
b33.3±1.8 60.8±6.4 90.4±16.9 6.0±0.8 440.0±44.0 488.3±19.1 830.2±171.2 58.0±2.0a Knneutari
2Ho 126.5±16.0 36.8±0.6 51.0±5.5 99.4±16.3 6.3±0.3 426.0±72.8 457.3±86.0 1146.0±190.4 28.0±2.6b
a
High quality 9 ← ~ → 1 low quality;
bValue represent means ± S.D of three experiments
*
Values within a column followed by the same letter are not significantly different at α = 0.05 by Tukey’ studentized range test.
Fig. 3. Morphology of primordia formation (A & D) and fruiting body using culling cultivation(B & E) and free cultivation (C
& F) of new cultivar DanBi 5Ho(upper) and Knneutari 2Ho(lower).
Table. 2. Requiring period for mycelial growth and fruit body development of “Dan Bi 5Ho” in the bottle cultivation
Cultivar Mycelial growth (days)
Days to primordia formation
Days to harvest DanBi 5Ho 33.8±1.2
a6.8±0.4 15.6±0.4 Knneutari 2Ho 33.8±0.9 7.3±0.8 16.7±1.0
a
Value represent mean ± S.D of three experiments
(2013) 의 보고내용과 일치하는 경향을 보여주었다. 이러한 결과는 저장성이 우수한 큰느타리버섯의 품종 선 발 및 육 성에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.
적 요
큰느타리버섯 품종 육성을 위해 품질이 우수한 특성을 지니는 큰느타리버섯 KNR2598과 경도가 우수한 특성을 지니는 큰느타리버섯 KNR2610 모본으로부터 단핵균주를 분리 한 뒤 단포자간 교잡을 통해 고품질의 저온 저장성이 우수한 신품종 “단비5호”를 육성하였다. 신품종의 균사 생 육 적정온도는 25oC이며 자실체 발생 적정 온도는 15~
16oC 이었다. 솎음 재배에서 발이소요일수를 포함한 수확 소요일수는 대조품종인 큰느타리버섯 2호에 비해 0.5~1.7 일 정도 빠른 특성을 보였다. 갓 색깔은 중간수준의 갈색이 며 대 색깔은 흰색을 나타내었다. 갓모양은 우산형으로 850cc 플라스틱 병재배에서 한 개체의 평균무게는 90.4
±16.9 g이었다. “단비5호”와 대조품종간의 RAPD 분석결과 서로 다른 DNA 밴드양상을 보여 주었으며 대치배양을 통 해 두품종간에 대치선을 확인 하였다. “단비5호”의 경우 4oC에서의 저장성이 대조품종 대비 24.6~30.6일 이상 길게 유지되는 특성이 있어 수출적합형 품종으로 가치가 있을 것으로 기대된다.
감사의 말씀
본 연구는 농촌진흥청 공동연구사업 연구지원(Project No. PJ0102232016)에 의해서 이루어진 것이며 연구비지원 에 감사드립니다.
참고문헌
Kang TS, Kang MS, Sung JM, Kang AS, Shon HR, Lee SY. 2001.
Effect of Pleurotus eryngii on the blood glucose and
cholesterol in diabetic rats. Kor. J. Mycol. 29:86-90.
Kang TS, Jeong HS, Lee ML, Park HJ, Jo TS, Ji ST, Sin MG. 2003.
Mycelial growth using the natural product and angiotensin converting enzyme inhibition activity of Pleurotus eryngii.
Kor. J. Mycol. 31:175-180.
Korea Seed and Variety Service. 2016. Trend in variety protection applications. pp. 78-79. Korea Seed and Variety Service.
Korea.
Kim HK, Cheong JC, Chang HY, Kim GP, Cha DY, Moon BJ.
1997a. The artificial cultivation of Pleuortus eryngii (I) - investigation of mycelial growth conditions. Kor. J. Mycol.
25:305-310.
Kim HK, Cheong JC, Seok SJ, Kim GP, Cha DY, Moon BJ. 1997b.
The artificial cultivation of Pleuortus eryngii (II) - investigation of mycelial growth conditions. Kor. J. Mycol.
25:311-319.
Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs. 2015. 2014 An actual output for special crop. pp. 60-63. Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Korea.
Hwang YJ, Nam HK, Chang MJ, Noh GW, Kim SH. 2003. Effect of Lentinus edodes and Pleurotus eryngii Extracts on Proliferation and Apoptosis in Human Colon Cancer Cell Lines. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 32:217-222.
Chakraborty U, Sikdar SR. 2008. Production and characterization of somatic hybrids raised through protoplast fusion between edible mushroom strains Volvariellavolvacea and Pleurotusflorida. World J Microbiol Biotechnol. 24:1451-1492.
Chen X, Stone M, Schlagnhaufer C, Peter Romaine C. 2000. A fruiting body tissue method for efficient AgrobacteriummedidatedtransformationofAgaricusbisporus.
Appl Environ Microbiol. 66:4510-4513.
Hui YF, Den ES, Chi TH. 2002. Antioxidant and free radical scavanging activities of edible mushrooms. J Food Lipids.
9:35-46.
Kim MK, Ryu JS, Lee YH Kim HR. 2013. Breeding of a long shelf-life strain for commercial cutivation by mono-mono crossing in Pleurotus eryngii. Sci Hortic. 162:265-270.
Mikosch TS, Lavrijssen B, Sonnenberg AS Griensven LJ. 2001.
Transformation of the cultivated mushroom Agaricusisporus (Lange) usingT-DNAfromAgrobacteriumtumefaciens. Curr Genet. 39:35-39.
Raeder U Broda P. 1985. Rapid preparation of DNA from
Fig. 4. Fruiting body after storage of new cultivar DanBi 5Ho(upper) and Knneutari 2Ho(lower) at 4oC for 10 (A & E), 20 (B &F), 30 (C & G), and 40 (D & H) days.
