에너지 음료가 치아 법랑질 침식 및 치아성장에 미치는 영향
김미경1, 전재훈1, 박현주1,2, 배찬호3, 박진성1, 배수경2*, 배문경1*
Effect of Energy Drinks on the Dental Enamel Erosion and Mouse Teeth Growth
Mi-Kyoung Kim1, Jae-Hoon Jeon1, Hyun-Joo Park1,2, Chan-Ho Bae3, Jin-Sung Park1, Soo-Kyung Bae2*, and Moon-Kyoung Bae1*
접수: 2014년 4월 1일 / 게재승인: 2014년 4월 23일
© 2014 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
Abstract: The purpose of this study was to evaluate the influence of energy drinks on the erosion of dental enamel and mouse teeth growth. Exposure of enamel surface to energy drinks stimulated the release of the calcium from enamel surface of teeth. And the surface microhardness of enamel decreased after immersion in energy drinks. Enamel demineralization effects under energy drinks were observed by scanning electron microscope. Effect of maternal energy drink intake on tooth morphology of offsprings was ana- lyzed. We concluded that the energy drinks produced a signif- icant erosion of dental enamel.
Keywords: Energy drinks, Dental enamel, Erosion, Mouse teeth
1. INTRODUCTION
최근 현대인들의 식생활이 다양해지고, 생활패턴이 서구화 됨에 따라 커피나 차, 탄산음료, 스포츠음료, 그리고 에너지 음료 등 카페인을 함유한 기호 식품의 소비가 급증하고 있다.
이 중 특히 에너지음료는 2012년 이후 직장인이나 청소년을 중심으로 그 수요가 눈에 띄게 늘어나고 있는 실정이다 [1].
특히 입시에 시달리는 중고등학생들이 졸음을 쫓기 위해 또 는 피로 회복을 위해 에너지 음료를 과다하게 음용하는 경우 가 갈수록 늘어나고 있어 이에 대해 우려하는 시각도 많아지 고 있다.
에너지 음료를 마시는 가장 큰 이유는 잠을 깨거나 피로 회 복에 도움이 될 것 같아서 마신다는 답이 압도적이었다. 그 외에도 건강에 도움이 될 것 같아서, 누군가 권해서, 힘이 나 는 것 같아서라는 응답도 적지 않았다 [2]. 하지만 역시 대부 분의 사람들이 일상생활 속에 쌓인 피로를 풀기 위한 목적으 로 에너지음료를 마시고 있음을 알 수 있었다. 고카페인 음료 의 과용에 따른 부작용에 대해서는 여러 보고들이 존재하지 만, 에너지음료를 복용하는 대부분의 사람들은 카페인음료 의 부작용에 대해 걱정을 하면서도 실제 이에 대한 정확한 인 식은 부족하다고 생각된다. 에너지음료의 부작용은 대부분 카페인의 과다 섭취로 인한 것으로 보고되고 있다. 특히 고카 페인 음료를 다량으로 섭취할 경우 불면증, 두통, 위장관 출 혈 등의 부작용을 보이며, 특히 청소년에서 오심, 구토, 심박 동수 증가, 손떨림, 수면장애 등의 증상을 보이고 지속적으로 과잉 섭취할 경우 카페인 중독으로 이어질 수도 있다는 보고 도 있었다 [3,4].
또한 대부분의 에너지 드링크는 오렌지쥬스 만큼이나 강한
1부산대학교 치의학전문대학원 구강생리학교실
1Department of Oral Physiology, School of Dentistry, Yangsan Cam- pus of Pusan National University, Yangsan 626-870, Korea
Tel: +82-51-510-8239, Fax: +82-51-510-8238 e-mail: [email protected]
2부산대학교 치의학전문대학원 치과약리학교실
2Department of Dental Pharmacology, School of Dentistry, Yangsan Campus of Pusan National University, Yangsan 626-870, Korea Tel: +82-51-510-8253, Fax: +82-51-510-8233
e-mail: [email protected]
3부산 용인고등학교
3Yongin High School, Pusan 607-112, Korea
연구논문
산성을 띄고 있어 카페인으로 인한 부작용 외에도 산으로 인 한 치아침식 등의 부작용을 일으킬 수 있을 것으로 예상되며 그 초기 연구가 진행 중이다 [5,6]. 치아침식증은 구강 내에서 미생물의 개재없이 오직 산과의 직접적인 접촉에 의해서만 일어나는 치질 손상을 말한다. 치아 침식은 산도가 높은 음료 를 자주 섭취할수록, 또는 음료의 산도보다는 음료가 함유하 고 있는 산의 종류에 의해 치아침식이 더 많이 일어난다는 다 양한 보고들이 있었다 [7,8].
이에 본 연구는 시판중인 다양한 종류의 에너지음료들의 pH를 알아보고, 이들 음료에 직접 접촉된 치아 법랑질의 탈 회정도, 표면강도 변화를 관찰하며 전자현미경을 통한 법랑 질 표면을 관찰하고자 하였다. 더불어 임신한 쥐에 에너지 음 료를 섭취시켰을 때 어미 쥐와 새끼 쥐의 치아에서 어떠한 변 화가 나타나는지도 알아보았다.
2. MATERIALS AND METHOD
2.1. 실험음료
연구대상 음료는 현재 국내 시판되고 있는 4종의 에너지음료 (핫식스, 롯데칠성음료; 레드불, 동서음료; 볼트에너지블루, 해태음료; 번인텐스; 코카콜라음료 주식회사)와 1종의 탄산 음료 (코카콜라, 코카콜라음료 주식회사)를 사용하였다.
2.2. 시편 제작
치아 절편 제작을 위해 충치나 손상이 없는 건강한 치아를 준 비하였다. 절편 제작에 필요한 치아는 양산부산대학교 치과 병원에서 제공받았다. 발치한 치아는 생리식염수에 보관되 었으며, 절편 제작을 위해 치아 표면의 연조직이나 치석을 제 거하였다. 경조직 절단기 (Struers Minitom, Cophenhagen, Den- mark)를 이용하여 치아 뿌리를 절단하고, 치아 머리 부분을 이용하여 절편을 제작하였다. 하나의 치관에서 실험군과 대 조군으로 사용될 절편을 각각 가로 세로 2 mm × 3 mm, 높이 3 mm 크기로 절단하였다. 절단한 치아 절편은 생리식염수로 세척 후 실험에 사용되었다.
2.3. 치아 탈회 성분 분석
실험 음료에 치아시편을 담그기 전과 담근 후 음료들에 녹여 져 있는 음료 내 칼슘농도를 calcium colorimetric assay kit (BioVision)를 이용하여 반응시키고 575 nm 분광광도계 (Shi- madzu, JP/UV-1650PC)에서 optical density (O.D)를 측정하였 다. 측정된 칼슘 standard O.D값을 이용하여 표준곡선을 그린 뒤 실험군 및 대조군 음료의 O.D 값을 표준곡선에 대입시켜 실험군 및 대조군 음료 내 칼슘농도를 측정하였다.
2.4. 법랑질의 표면미세경도 측정
각 에너지 음료를 처리한 절편을 미세 경도 측정기 (MVK-H1, Akashi Co. Ltd., Tokyo, Japan) 를 이용하여 치아 절편 표면의 비커스 경도값을 측정하였다. 각 절편의 표면에 10초간 200 g
의 하중으로 압착하였다. 생성된 다이아몬드 모양 홈은 100 배율의 광학현미경을 통하여 각 대각선 길이를 측정하였다.
하나의 절편당 3부위를 측정하여 평균치를 구하였다.
2.5. 주사전자현미경 (SEM)으로 법랑질 표면 관찰 치아 시편을 진공상태에서 금이온중착장치 (IB-3, Eiko Co, Japan)로 180~200 Å 두께의 백금을 코팅하고, 주사전자현미 경 (HITACHI, S3500N)을 이용하여 500배, 3000배 배율로 표 면을 촬영하였다.
2.6. 동물 실험
임신 4~6일차 암컷 ICR mouse (Orient Bio, Korea) 9마리를 공 급받아 실험에 사용하였으며, 부산대학교 양산캠퍼스 실험 동물센터의 사육조건에 따라 사육실 온도 22±3oC, 습도 55%
로 유지하고 12시간 주기로 조명을 켜고 끄는 조건에서 사육 하였다. 본 연구는 부산대학교 실험동물위원회의 승인을 얻 었으며, 규정을 준수하여 진행하였다. 사료는 특별한 제한을 두지 않고 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 수분은 임신기간 과 출산 후 모유수유기간 동안 실험군에 제공하는 에너지음 료의 양에 따라 조절되었다. 공급받은 9마리의 실험 동물군 은 3군으로 나누어 진행하였다; (1) 임신기간과 모유수유기 간 모두 물만 섭취하는 control 그룹 3마리, (2) 모유수유 기 간만 에너지음료를 섭취하는 그룹 3마리, (3) 임신기간과 모 유수유기간 모두 에너지음료를 섭취하는 그룹 3마리. 실험 에 사용된 에너지 음료는 시중에서 판매하는 핫식스를 이용 하였고, 임신기간과 모유수유기간 동안 하루에 약 50 mL씩 공급하였다. 임신기간과 모유수유기간 동안 수분만 섭취하 는 대조군은 핫식스 대신 동량의 물을 매일 공급하였다. 출 산 후 태어난 새끼들의 몸무게와 치아발생 정도는 생후 7일 부터 2~3일 간격으로 측정하였으며, 생후 12일에 micro CT 촬영을 진행하였고, 생후 15일까지 최종적으로 관찰하였다.
2.7. Micro-CT 촬영
생후 12일차 생쥐들의 치아발생 정도를 확인하기 위해 생쥐 의 두개골 부위를 10 micro급 고해상도 X선 단층촬영장치 (NFR Polaris-G90)로 촬영하였다. 촬영 관전압은 80 kVp, 관 전류는 100 µA, 1 mm 알루미늄 여과 (filtration)를 이용했고, 촬영시간은 3400 ms이었다. 23.75의 확대율로 화소 크기 (pixel size)는 11.51 µm, 역치값 (threshold value)을 150으로 고정하여 단층 촬영한 3차원 영상을 재구성하였으며, 3D- rendering software인 Lucion program을 사용하여 생쥐들의 incisor 길이를 측정하였다.
2.8. 통계처리
본 실험에 대한 실험결과는 세 번 실험하여 얻어진 평균치 및 표준편차를 나타내었고 그룹간의 통계적 차이는 Student's t- test를 이용하여 분석하였다. 대조군과 비교하여 P값이 0.01 미만일 때를 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 에너지음료가 치아시편의 탈회에 미치는 영향 준비된 치아시편을 12시간 동안 담가 두었던 용액 속에 녹아 나온 칼슘 농도를 측정하여 음료들이 치아 탈회에 미치는 영 향을 조사하였다. 핫식스, 번인텐스, 볼트에너지에서 치아로 부터 빠져 나온 가장 높은 칼슘농도가 측정되었다. 특히 치아 표면의 탈회가 많이 나타난다고 알려진 탄산음료보다 더 많 은 탈회를 일으킴을 알 수 있었다. 반면 레드불은 다른 에너 지 음료와 비슷한 산성도를 가지고 있음에도 녹아 나온 칼슘 농도는 다른 음료에 비해 훨씬 더 낮게 측정되었다 (Fig. 1).
치아 침식은 구강 내에서 미생물의 개재없이 내인성 산이나 외인성 산에 의해서 치아 법랑질이 탈회되는 현상이다 [9].
법랑질은 치관부 표면의 가장 단단한 부분으로 저작압력과 충치를 일으키는 산이나 온도 변화로부터 치아의 내부구조 를 보호하는 역할을 한다. 전신에서 가장 단단한 부분으로 굳 기 6~7o이므로 석영과 거의 비슷하다. 하지만 법랑질은 한 번 마모되거나 녹아 버리면 다시 새로 생기지 않아 영구적 손상 을 입게 되는 부위이다. 이러한 치아침식증의 원인은 접촉하 는 산의 공급처에 따라 내인성 요인과 외인성 요인으로 구분 할 수 있다. 내인성 요인으로는 구강 내로 역류한 위산이나, 구토, 위식도 역류 질환 등이 있으며, 외인성 요인으로는 환 경, 섭취하는 식품, 생활 습관, 복용약 등이 있다 [9]. 특히 이 중 치아침식의 대표적인 원인은 산성 음식 또는 음료의 섭취 에 기인한다고 할 수 있다 [10,11]. 본 실험에서도 측정된 에 너지 음료들은 약 pH 2 정도로 측정되었으며 탄산음료보다 도 더 강한 산성을 띄고 있음을 관찰하였다 (data not shown).
치아 침식은 음료의 산성 정도에 따라 다소 차이를 보였으며,
치아침식으로 탈회되어 떨어져 나간 용액 속 칼슘농도는 핫 식스에서 가장 높게 나타났으며, 산성도에서는 큰 차이를 보 이지 않는 콜라와 레드불에서는 예상과 달리 칼슘농도가 다 른 에너지 음료에 비해 현저히 낮게 나왔다. 이는 산성음료에 의한 치아 침식정도는 음료의 pH 뿐만 아니라 첨가된 산의 종류, 용액 내 칼슘과 인의 농도, 불소 함량 등에 따라서도 결 정될 수 있기 때문이라고 판단되었다 [10]. 일반적으로 산성 음료들에 있어서 칼슘, 인, 불소이온들이 녹아져 나오지만 이 농도를 높여주면 침식이 억제된다고 보고된 바 있으며, 이 이 온들의 농도가 pH 농도와 함께 침식정도에 유의한 상관성이 있었다고 보고된 바 있다 [12].
3.2. 에너지음료가 치아 법랑질 표면 경도에 미치는 영향 침식된 법랑질 표면 경도 분석에서는 핫식스에서 가장 큰 폭 으로 법랑질 경도가 약해졌으며 그 다음이 레드불, 번인텐스, 볼트에너지 순으로 치아 경도가 약해진 것으로 나타났다. 탈 회가 가장 많이 발생하는 것으로 나타난 핫식스에서 경도도 가장 많이 떨어지는 것은 예상할 수 있었으나 비슷한 정도로 탈회가 발생한 볼트에너지와 번인텐스는 상대적으로 표면 경도의 감소가 그리 크지 않았다. 반면 탈회가 많이 발생하지 않았던 레드불은 상대적으로 표면경도가 상당히 감소하는 것으로 나타났다 (Fig. 2). 침식된 치아 표면 경도 분석에서는 유리되어 나온 칼슘농도가 예상보다 낮게 나온 레드불에서 도 다른 음료와 마찬가지로 경도가 약해진 것으로 나왔는데 이는 치아의 경도를 결정짓는 데 칼슘성분 뿐만 아니라 치아 를 구성하는 다른 무기질인 나트륨, 마그네슘 인 등의 성분도 관여하는 것으로 생각되었다 [13,14].
3.3. 법랑질 표면의 주사전자현미경 관찰
주사전자현미경으로 법랑질 표면을 관찰한 결과 에너지 음 료에 의한 광범위한 법랑질 침식이 관찰되었다 (Fig. 3A, 3B).
Fig. 1. Effect of energy drinks on the release of calcium from enamel surface. Enamel blocks were immersed in indicated drinks for 12 h. Phosphate buffered saline (PBS) was used as negative con- trol. The amount of calcium loss from enamel exposed to indicated drinks was measured using a calcium colorimetric assay. *p<0.05 vs. control.
Fig. 2. Effect of energy drinks on the Vickers microhardness values in dental slabs. Dental slabs were incubated with PBS or energy drinks for 12 h. The values of Vickers microhardness of each sam- ples was measured with a microhardness tester (MVK-H1) from at least three individual experiments. *p<0.05 vs. PBS.
탄산음료의 경우 전형적인 산 침식에 의한 벌집모양의 표면 침식이 관찰되었으나 에너지음료의 경우 표면 침식의 형태 가 불규칙하게 나타났다. 번인텐스에서 표면이 가장 심하게 손상된 것으로 관찰되었다. 핫식스와 볼트에너지에서의 표
면 손실은 중간 정도의 양상을 보였다. 주사 전자 현미경 분 석에서도 대조군인 증류수에서는 치아 표면의 균열이나 손 상이 관찰되지 않았고, 에너지 음료들에서는 표면에 홈이 생 긴 것 같은 손상이 생기거나 불규칙적으로 치아 결정들이 탈 락되어 나갔거나 균열이 생기는 등의 표면 손상을 보였다.
우리 인체 중에 가장 단단하다고 하는 법랑질이 이들 음료에 담궈 둔 것만으로 표면경도가 약해지고 표면의 성분들이 녹 아 나가 이 결과에서처럼 표면손실이 초래되는 것을 본 연구 에서 확인하였다.
3.4. 에너지음료의 치아성장에 미치는 영향 분석
본 동물실험에 사용한 에너지음료로는 앞선 실험들에서 치 아 탈회 및 법랑질 표면 경도를 크게 변화시킨 핫식스를 선 택하였다. 에너지음료를 수유기간만 섭취한 실험군과 임신 과 모유수유기간 모두 핫식스를 섭취한 두 실험군의 새끼 생 쥐들 체중이 물만 섭취했던 대조군 새끼 생쥐들에 비해 다소 크게 나타났으나, 전체 새끼 생쥐들의 평균 몸무게 편차는 매우 심하게 나타났다 (Fig. 4). 핫식스를 섭취했던 두 실험군 에서는 출산 후 대부분 모유수유를 거부하여 새끼 생쥐들이 굶어 죽거나 충분한 영양을 섭취하지 못하였고, 이들의 성장 을 위해 충분한 사료를 케이지 안에 넣어 영양분을 섭취할 수 있도록 도와주었고, 그래서인지 물을 섭취했던 대조군의 새 끼 생쥐들에 비해 치아 발육에 있어서도 실험군의 하악 절치 가 대조군에 비해 약간의 차이를 나타내었으나 치아성장에 서의 눈에 띄는 큰 변화는 관찰할 수는 없었다 (Fig. 5). 또한 새끼 생쥐들의 전체 골격 발육에는 핫식스를 섭취한 실험군 과 물을 섭취한 대조군 사이에 육안상 큰 차이를 보이지 않았 다. 치아성장에 미치는 영향을 알아보기 위한 생쥐 실험에서 는 핫식스를 섭취한 쥐들이 대부분 평균 출산일보다 일찍 조 산한 것으로 나타났으며, 모유수유 거부로 새끼들이 굶어 죽 거나 충분한 영양 섭취를 하지 못하는 일이 일어났으며, 에
Fig. 3. SEM images of enamel surface. Enamel blocks were immer- sed in indicated drinks for 12 h, and then were photographed under a SEM. A, phosphate buffered saline (PBS), B, Coca cola, C, Hot 6, D, Volt energy, E, Burn intense. (A) magnification X50, (B) magni- fication X300.
Fig. 4. Effect of energy drinks on the body weight in neonatal mice.
All female mice received Hot6 and distilled water (50 mL/daily) during pregnancy period and/or breast feeding period. Changes in neonatal body weight were measured every third day. *p<0.05 vs.
control group.
너지음료 섭취한 일부 어미 쥐의 눈이 심하게 충혈되었고, 또한 핫식스를 섭취한 실험군에서 어미들과 새끼들이 매우 예민하고 난폭한 경향을 보였는데 이는 음료 내에 많이 함유 된 카페인이나 당성분에 의한 부작용으로 판단되었다. 이미 알려진 바와 같이 카페인을 과다 섭취할 경우 불면증, 신경 과민, 집중방해, 극심한 흥분, 떨림, 행동 장애 유발등의 심각 한 부작용이 나타날 수 있는데 실험군 쥐들의 이상 상태나 이상 행동들이 이 카페인의 부작용에 기인한 것으로 판단되 었다 [15,16]. 그리고 향후 조직학적, 분자생물학적 실험분석 을 통해 에너지 음료가 치아발생 및 골격 발육에 미치는 영 향을 다각도로 분석해야 할 것으로 생각된다.
4. CONCLUSION
청소년들이 자주 섭취하는 다양한 음료들이 대부분 산성을
띄고 있으며, 과다한 카페인 성분이 들어 있어 이로 인해 치 아나 성장발육에 어떤 영향을 미치는지 알아보고자 본 실험 을 시행하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
1. 치아를 담궈 두었던 용액 속에 녹아 나온 칼슘 농도측정 에서는 핫식스, 번인텐스, 볼트에너지, 레드불 순서로 대부분 의 에너지음료들에서 치아로 부터 빠져나온 칼슘농도가 높 게 측정되었다.
2. 침식된 법랑질 표면 경도 분석에서는 핫식스, 레드불, 번 인텐스, 볼트에너지 순으로 법랑질 경도가 약해진 것으로 나 타났다.
3. 주사전자현미경 소견에서 볼트에너지, 번인텐스, 핫식스 에서는 결정들의 불규칙한 배열과 심한 파열 및 균열이 관찰 되었다.
4. 에너지음료들이 치아성장에 미치는 영향을 알아보기 위 한 생쥐 실험에서는 임신중 핫식스를 섭취한 쥐들에서 높은 조산경향을 보였으나, 치아성장에서의 눈에 띄는 큰 변화는 Fig. 5. Effect of energy drinks on the tooth development in neonatal mice (A) Micro CT data shows a 3D image of mouse skull with teeth after respiratory anesthesia using isoflurane in postnatal day 12 mice. (B) The graph shows the incisor size after completion of micro CT.
*p<0.05 vs. control group.
관찰할 수는 없었다.
Acknowledgements
본 연구는 보건복지부 암정복추진연구개발사업 지원으로 이 루어진 것임 (1220080).
REFERENCES
1. Pomeranz, J. L., C. R. Munsell, and J. L. Harris (2013) Energy drinks: an emerging public health hazard for youth. J. Public Health Policy 34: 254-271.
2. Blankson, K. L., A. M. Thompson, D. M. Ahrendt, and V. Patrick (2013) Energy drinks: what teenagers (and their doctors) should know. Pediatr. Rev. 34: 55-62.
3. Pennington, N., M. Johnson, E. Delaney, and M. B. Blankenship (2010) Energy drinks: a new health hazard for adolescents. J. Sch.
Nurs. 26: 352-359.
4. Wolk, B. J., M. Ganetsky, and K. M. Babu (2012) Toxicity of energy drinks. Curr. Opin. Pediatr. 24: 243-251.
5. Ehlen, L. A., T. A. Marshall, F. Qian, J. S. Wefel, and J. J. Warren (2008) Acidic beverages increase the risk of in vitro tooth erosion.
Nutr. Res. 28: 299-303.
6. Owens, B. M. (2007) The potential effects of pH and buffering capacity on dental erosion. Gen. Dent. 55: 527-531.
7. Kim, M. A., S. S. Jeong, H. J. Youn, Y. N. Park, C. H. Choi, and et al. (2011) The erosive effect of some commercial yogurts includ-
ing different calcium contents on enamel surface. J. Korean Acad.
Oral Health 35: 266-272.
8. Lee, C. Y., S. Kim, and T. S. Jeong (2004) A study on the enamel erosion caused by orange juice. J. Korean Acad. Pediatr. Dent. 31:
617-623.
9. Youn, H. J. (2007) pH changes by Streptococcus sobriuns on some commercial drinks. J. Korean Soc. Dent. Hyg. 7: 167-176.
10. Choi, H. J., H. J. Lee, S. S. Jeong, C. H. Choi, and S. J. Hong (2012) Effect of mouthrinse with low pH on the surface micro- hardness of artificial carious enamel. J. Korean Acad. Oral Health 36: 161-166.
11. Kim, M. Y. and H. J. Lee (2008) Influence of soft drinks supple- mented calcium to enamel remineralization. J. Korean Soc. Dent.
Hyg. 8: 13-22.
12. Kim, B. R., J. H. Min, H. K. Kwon, and B. I. Kim (2013) Analy- sis of the erosive effects of children's beverages using a pH-cycling model. J. Korean Acad. Oral Health 37: 141-146.
13. Youn, H. J., S. J. Hong, S. S. Jeong, E. J. Jung, M. O. Ha, Y. N.
Park, and et al. (2011) Evaluation of dental erosion caused by some beverages on sound enamel using confocal laser scanning microscopy. J. Korean Acad. Oral Health 35: 243-250.
14. Lee, H. J., S. J. Hong, and C. H. Choi (2013) Erosive effect of hangover-curing beverages on enamel surface. J. Korean Acad.
Oral Health 37: 119-125.
15. Lee, J., W. Huh, and E. J. Choi (2013) Pattern analysis of high-caf- feine energy drink consumption and adverse effects among col- lege students in a university, Yakhak Hoeji; 572: 110-118.
16. Chang, Y. E. and H. K. Chung (2010) Survey of caffeine intake from children’s favorite foods. Korean J. Nutr. 43: 475-488.
