Developing species-specific quantitative real-time polymerase chain reaction primers for detecting Lautropia mirabilis

Introduction Introduction

Lautropia mirabilis는 사람의 혀 후방 타액으로부터 분리되어 새 로운 종으로 확립된 것으로, 그람 음성이면서 통성 혐기성(호기성 상 태에서 더 잘 자람)인 구형 세균이다[1]. 이들은 3–9개의 편모를 가지 고 있고, 원형 운동(circular movement)을 하는 특성을 갖는 세균 종 (species)으로 보고되었다[1]. 현재까지 Lautropia 속(genus)에는 L.

mirabilis와 사람의 치면세균막에서 분리된 Lautropia dentalis 두 종 만이 있는 것으로 보고되었다[2].

치주질환의 분자 역학 조사에 의하면, L. mirabilis는 성인과 소아의 치주질환에 이환된 치아보다는 건강한 치아의 치은연하치면세균막에서 검출빈도가 더 높은 것으로 보고되었다[3-6]. 또한, 클로로헥시딘을 가 글 용액으로 사용했을 때, 치은염의 감소와 더불어 L. mirabilis의 검출 빈도도 증가하는 것으로 보고되었다[7]. 이러한 연구 결과들에 의하면,

L. mirabilis는 치주질환에 이환된 치아보다는 건강한 치아의 치은연하 치면세균막에 우세하게 존재함을 알 수 있었다. 하지만, L. mirabilis는 낭포성 섬유염 환자의 가래(sputum) [8], 복막 투석 관련 복막염(peri- toneal dialysis-associated peritonitis) 병소[9]에서 분리된 연구 결 과에 의하며, 구강이 아닌 다른 장기에서는 병원성 세균으로 작용한다 는 것을 알 수 있었다.

앞에서 소개한 치주질환 분자 역학 연구에서는 16S ribosomal RNA gene (16S rDNA) 기반 마이크로어레이 기법이나 차세대 핵산염기서 열결정법을 이용하여 얻은 결과들이다[3-7]. 이러한 방법들은 많은 세 균 종을 대상으로 정성적 및 정량적으로 검출할 수 있다는 장점은 있지 만, 신속성과 정확도는 실시간중효효소연쇄반응법(quantitative real- time polymerase chain reaction, qPCR)보다는 떨어지는 단점이 있 다. qPCR 법을 시행하기 위해서는 세균 종-특이 PCR 프라이머 쌍 개 발이 필수적이다. 현재까지 L. mirabilis를 종-특이적으로 검출할 수 있

Int J Oral Biol 46:140-145, 2021

pISSN: 1226-7155 • eISSN: 2287-6618 https://doi.org/10.11620/IJOB.2021.46.3.140

Developing species-specific quantitative real-time polymerase chain reaction primers for detecting Lautropia mirabilis

Soon-Nang Park ^1,2 and Joong-Ki Kook ^1,2 *

1 Korean Collection for Oral Microbiology, College of Dentistry, Chosun University, Gwangju 61452, Republic of Korea

2 Department of Oral Biochemistry, College of Dentistry, Chosun University, Gwangju 61452, Republic of Korea

This study aimed to develop Lautropia mirabilis-specific quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) primers based on the sequence of DNA-directed RNA polymerase subunit beta gene. The PrimerSelect program was used in designing of the qPCR primers, RTLam-F4 and RTLam-R3. The specificity of the qPCR primers were performed by conventional PCR with 37 strains of 37 oral bacterial species, including L. mirabilis. The sensitivity of the primers was determined by qPCR with the serial dilution of purified genomic DNA of L. mirabilis KCOM 3484, ranged from 4 ng to 4 fg. The data showed that the qPCR primers could detect only L. mirabilis strains and as little as 40 fg of genome DNA of L. mirabilis KCOM 3484. These results indicate that this qPCR primer pair (RTLam-F4/

RTLam-R3) may be useful for species-specific detection of L. mirabilis in epidemiological studies of oral bacterial infectious diseases such as periodontal disease.

Keywords: Lautropia mirabilis, 16S rDNA, Quantitative real-time polymerase chain reaction primers

Received August 26, 2021; Revised September 8, 2021; Accepted September 8, 2021

*Correspondence to: Joong-Ki Kook, E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2628-2870 Copyright © The Korean Academy of Oral Biology

CC

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by- nc/4.0/), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Original Article IJOB

는 qPCR 프라이머 쌍은 개발되지 않았다. 그러므로 본 연구는 치주질 환과 같은 구강 세균 감염성 질환과 L. mirabilis와의 분자 역학 연구 에 사용하기 위해, 세균 종간 상동정이 잘 보존된 부분과 상이한 부분 이 잘 알려진 RNA 중합효소 소단위 베타 유전자(DNA-directed RNA polymerase subunit beta gene, rpoB) [10] 핵산염기서열을 바탕으 로 L. mirabilis 종-특이 qPCR 프라이머 쌍을 개발하기 위하여 시행되 었다.

Materials and Methods Materials and Methods

1. 세균 및 세균 배양

L. mirabilis 종-특이 qPCR 프라이머 쌍을 개발하기 위해 사용된 균 주들은 Table 1과 같다. 이 균주들은 한국구강미생물자원은행(Korean Collection for Oral Microbiology, Gwangju, Korea), CCUG (Cul- ture Collection, University of Göteborg, Göteborg, Sweden), 한 국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cul- tures, Biological Resource Center, Daejeon, Korea) 또는 ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 얻 거나 구입하여 사용하였다.

Neisseria mucosa 및 Streptococcus spp. 균주들은 brain heart infusion (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 배지를 이용하여 5% CO

₂

를 공급한 37℃ 배양기에서 배양하였다.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans 균주는 tryptic soy broth (TSB, Difco Laboratories)에 0.6% yeast extract, 5%

horse serum, 75 μg/mL bacitracin 및 5 μg/mL vancomycin (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 첨가한 배지[11]에서 배양하였다.

Treponema denticola 균주는 ATCC에서 권장하는 1494 modified NOS medium (https://www.atcc.org/~/media)을, Tannerella forsythia 균주는 TSB에 5 μg/mL hemin, 10 μg/mL N-acetyl muramic acid, 5% sheep blood를 첨가한 배지에서 배양하였다.

그 외 균주들은 TSB에 0.5% yeast extract, 0.5 mg/mL cysteine HCl-H

₂

O, 5 μg/mL hemin 및 1 μg/mL vitamin K

1

이 첨가된 배지 를 이용하여 배양하였다. 이들 균주는 혼합가스(85% N

₂

, 10% CO

₂

, 5% H

₂

)가 공급되는 37℃ 혐기성 세균배양기(BACTRONEZ, Sheldon Manufacturing Inc., Cornelius, OR, USA)에서 배양하였다.

2. qPCR 프라이머 설계

L. mirabilis를 종-특이적으로 검출하기 위한 qPCR 프라이머 쌍 은 L. mirabilis NCTC 12852

^T

의 rpoB (GenBank accession no.

LR134378 중 902,665..902,689 nts)와 Lautropia dentalis KCOM 2505

^T

의 rpoB (GenBank accession no. NZ_RRUE01000002 중 206,735..210,850 nts) 핵산염기서열을 바탕으로 PrimerSelect 프 로그램(DNASTAR Inc., Madison, WI, USA)을 이용하여 설계하였다.

설계된 qPCR 전방 프라이머(RTLam-F4) 염기서열은 5′-GCC GGC

CAT CTT GTC ACC A-3′였으며, 후방 프라이머(RTLam-R3) 염기 서열은 5′-CTA CCT GAA GGA TCT GGA CCG CTA C-3′였다. 이 들 RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍은 Bioneer 사(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 제작하였으며, 이들에 의해 예상되는 PCR 산물 크 기는 244 bp였다.

Table 1. The bacterial strains used in this study

Species Strains

Lautropia mirabilis KCOM 3484

Lautropia dentalis KCOM 2505 ^T

Actinomyces meyeri CCUG 21024 ^T

Aggregatibacter actinomycetemcomitans ATCC 33384 ^T

Atopobium rimae KCTC 5749 ^T

Campylobacter rectus ATCC 33238 ^T

Capnocytophaga gingivalis ATCC 33624 ^T

Capnocytophaga ochracea KCTC 5787 ^T

Cutibacterium acnes KCTC 3314 ^T

Enterococcus faecalis KCTC 3206 ^T

Fusobacterium hwasookii KCOM 1249 ^T

Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 ^T

Fusobacterium periodonticum ATCC 33693 ^T

Fusobacterium simiae CCUG 16798 ^T

Leptotrichia buccalis CCUG 34316 ^T

Neisseria mucosa ATCC 19696 ^T

Neisseria. subflava ATCC 49275 ^T

Porphyromonas asaccharolytica KCTC 5471 ^T Porphyromonas endodontalis ATCC 35406 ^T Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 ^T

Prevotella intermedia ATCC 25611 ^T

Prevotella nigrescens ATCC 33563 ^T

Pseduopropionibacterium propionicum KCTC 5342 ^T

Schaalia georgiae CCUG 32935 ^T

Schaalia odontolyticus CCUG 20536 ^T

Streptococcus anginosus ATCC 700231 ^T

Streptococcus gordonii CCUG 33482 ^T

Streptococcus mitis KCTC 3556 ^T

Streptococcus mutans ATCC 25175 ^T

Streptococcus oralis CCUG 13229 ^T

Streptococcus parasanguinis CCUG 30417 ^T Streptococcus pneumoniae CCUG 28588 ^T

Streptococcus sanguinis CCUG 17826 ^T

Streptococcus sobrinus ATCC 33478 ^T

Tannerella forsythia ATCC 43037 ^T

Treponema denticola KCOM 3500

Prevotella dentalis ATCC 49559 ^T

3. 세균 지놈 DNA 추출

본 연구에서 PCR 및 qPCR의 주형으로 사용될 균주들의 지놈 DNA 는 CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) 방법에 따라 추출하 였다[12]. 세균 지놈 DNAs의 농도와 순도(purity)는 자외선 비색정량 기(Epoch

^TM

Microplate Spectrophotometer, BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 260과 280 nm 파장에서 흡광 도를 측정하여 조사하였다.

4. 온도 구배(gradient) PCR 및 qPCR 프라이머 쌍의 종-특이성 검증

앞에서 설계된 L. mirabilis 종-특이 qPCR 프라이머 쌍(RTLam- F4/RTLam-R3)의 최적 결합 온도(annealing temperature)를 정하 기 위하여 L. mirabilis KCOM 3484와 Lautropia dentalis KCOM 2505

^T

의 지놈 DNA를 주형으로 사용하여, 온도 구배 PCR를 수행하 였다. PCR은 Bioneer 사(Korea)의 AccuPower

^®

PCR PreMix와 MyGenie

^TM

96 Gradient Thermal Block을 사용하여[11] 수행하였 으며, 이때 1 pmole/μL씩의 RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머들

과 세균 지놈 DNA 4 ng을 PCR 반응 용액에 첨가하여 반응시켰다. 이 때 PCR 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 10분간 전변성 처리하였고, 95℃에서 20초간 변성, 58℃, 60℃, 62℃, 64℃, 66℃, 68℃, 70℃

또는 72℃에서 20초간 결합, 72℃에서 20초간 중합과정을 30회 시행 하였으며, 72℃에서 10분간 최종 중합과정을 시행하였다. 증폭된 PCR 산물은 GoodView

^TM

Nucleic Acid Stain (SBS Genetech Co., Bei- jing, China)로 염색한 후, UV transilluminator를 이용하여 관찰하였 다.

앞에서 설계된 L. mirabilis 종-특이 qPCR 프라이머 쌍(RTLam- F4/RTLam-R3)의 종-특이성은 L. mirabilis KCOM 3484와 구강 세 균 36종의 표준균주 지놈 DNAs를 주형으로 이용하여 PCR 법으로 조 사하였다. 이때 PCR 조건은 결합과 중합과정을 72℃에서 20초간 시행 한 것을 제외하고는 온도 구배 PCR 조건과 같았다.

5. qPCR을 이용한 민감도(검출 한계) 조사

L. mirabilis-특이 qPCR 프라이머 쌍(RTLam-F4/RTLam-R3)의 민감도는 qPCR 법으로 측정하였다. qPCR은 TOPreal

^TM

qPCR 2X PreMix (Enzynomics, Daejeon, Korea)와 Exicycler

^TM

96 Real-

0.5 0.1

0.5 0.1

S 1 2 3 4 5 6 7 8 S 1 2 3 4 5 6 7 8

A B

Fig. 1. Gradient polymerase chain reaction (PCR) of the Lautropia mirabilis-specific PCR primers, RTLm-F4/RTLm-R3, with 4 ng of L. mirabilis KCOM 3484 (A) and Lautropia dentalis KCOM 2505 ^T (B) genomic DNA. Lanes: S, size marker (100 bp ladder); 1, 58℃; 2, 60℃; 3, 62℃; 4, 64℃; 5, 66℃; 6, 68℃; 7, 70℃;

8, 72℃.

0.3 0.2

0.3 0.2

S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38

Fig. 2. Specificity test of the Lautropia mirabilis-specific polymerase chain reaction (PCR) primers, RTLm-F4/RTLm-R3, with 4 ng of each bacterial genomic DNA. The PCR reaction products were electrophoresed on 1.5% agarose gels. Lanes: S, size marker (100 bp ladder); 1, Lautropia mirabilis KCOM 3484;

2, negative control (deionized distilled water) 3, Lautropia dentalis KCOM 2505 ^T ; 4, Actinomyces meyeri CCUG 21024 ^T ; 5, Aggregatibacter actinomycetem- comitans ATCC 33384 ^T ; 6, Atopobium rimae KCTC 5749 ^T ; 7, Campylobacter rectus ATCC 33238 ^T ; 8, Capnocytophaga gingivalis ATCC 33624 ^T ; 9, Capnocy- tophaga ochracea KCTC 5787 ^T ; 10, Cutibacterium acnes KCTC 3314 ^T ; 11, Enterococcus faecalis KCTC 3206 ^T ; 12, Fusobacterium hwasookii KCOM 1249 ^T ; 13, Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 ^T ; 14, Fusobacterium periodonticum ATCC 33693 ^T ; 15, Fusobacterium simiae CCUG 16798 ^T ; 16, Leptotrichia buccalis CCUG 34316 ^T ; 17, Neisseria mucosa ATCC 19696 ^T ; 18, Neisseria subflava ATCC 49275 ^T ; 19, Porphyromonas asaccharolytica KCTC 5471 ^T ; 20, Porphyromonas endodontalis ATCC 35406 ^T ; 21, Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 ^T ; 22, Prevotella intermedia ATCC 25611 ^T ; 23, Prevotella nigrescens ATCC 33563 ^T ; 24, Pseduopropionibacterium propionicum KCTC 5342 ^T ; 25, Schaalia georgiae CCUG 32935 ^T ; 26, Schaalia odontolyticus CCUG 20536 ^T ; 27, Streptococcus anginosus ATCC 700231 ^T ; 28, Streptococcus gordonii CCUG 33482 ^T ; 29, Streptococcus mitis KCTC 3556 ^T ; 30, Streptococcus mutans ATCC 25175 ^T ; 31, Streptococcus oralis CCUG 13229 ^T ; 32, Streptococcus parasanguinis CCUG 30417 ^T ; 33, Streptococcus pneumoniae CCUG 28588 ^T ; 34, Strep- tococcus sanguinis CCUG 17826 ^T ; 35, Streptococcus sobrinus ATCC 33478 ^T ; 36, Tannerella forsythia ATCC 43037 ^T ; 37, Treponema denticola KCOM 3500;

38, Prevotella dentalis ATCC 49559 ^T .

Time Quantitative Thermal Block (Bioneer)을 이용[11]하여 실시 하였다. qPCR 반응을 위해, 60 pmoles의 RTLam-F4와 RTLam- R3 프라이머, 4 ng에서 4 fg까지 10배씩 희석된 L. mirabilis KCOM 3484 지놈 DNA를 각각의 qPCR 2X PreMix가 들어 있는 PCR tube 에 넣고, 최종 반응물이 50 μL가 되도록 diethyl pyrocarbonate- treated water를 첨가하였다. qPCR은 95℃에서 2분간 전변성 처리한 후, 95℃에서 10초간 변성, 72℃에서 20초간 결합 및 중합과정을 40 회 반복하여 수행하였다. 그 후 65–94℃에서 1℃씩 1초간 반응시켜 형 광도를 측정한 melting curve를 얻어, 비정상적인 qPCR 증폭물 유무 를 확인하였다.

Results Results

설계된 L. mirabilis 종-특이 qPCR 프라이머 쌍(RTLam-F4/

RTLam-R3)의 최적 결합 온도를 정하기 위한 온도 구배 PCR을 시행 한 결과, 사용된 모든 온도 범위(58–72℃)에서 L. mirabilis KCOM

3484 지놈 DNA를 주형으로부터 예상되었던 244 bp 크기의 PCR 산 물이 증폭되었다(Fig. 1). 반면 대조군으로 사용된 L. dentalis KCOM 2505

^T

의 지놈 DNA를 주형으로 온도 구배 PCR을 한 경우는 모든 온 도 범위에서 PCR 산물이 증폭되지 않았다(Fig. 1). 이러한 결과를 바탕 으로 가장 엄격한(stringency) 조건에 해당하는 72℃를 일반 PCR 및 qPCR의 최종 결합 온도로 정하였다.

RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍의 L. mirabilis 종-특이성을 검증하기 위해, L. mirabilis와 가장 유전학적으로 가까운 종인 L. den- talis를 포함한 37종의 균주 지놈 DNAs를 주형으로 일반 PCR을 시행 하였다. 그 결과 RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍은 L. mirabilis KCOM 3484 지놈 DNA를 주형으로 한 경우에서만 PCR 산물(244 bp)이 증폭되었고, 나머지 36개 구강 균주들의 지놈 DNAs를 주형으로 한 경우에서는 PCR 산물이 생성되지 않았다(Fig. 2).

L. mirabilis 종-특이 qPCR 프라이머 쌍(RTLam-F4/RTLam- R3)의 민감도(검출 한계)를 측정하기 위해 L. mirabilis KCOM 3484 의 지놈 DNA를 이용하여 qPCR을 수행하였다. 그 결과 RTLam-F4/

RTLam-R3 프라이머 쌍은 L. mirabilis KCOM 3484 지놈 DNA 4 ng부터 40 fg까지 검출할 수 있었다(Table 2, Fig. 3).

RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍에 의한 L. mirabilis KCOM 3484 지놈 DNA 상의 표적 유전자인 rpoB 이외의 영역을 주형으로 하 는 비특이적 PCR 산물이 증폭되었는지를 알아보기 위하여 melting curve 분석을 시행하였다. 그 결과, melting curve가 단일한 패턴을 보였으며, 온도 변화에 따른 형광 감도의 또 다른 peak가 보이지 않았 다(Fig. 3C). 이러한 결과로 RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍에 대한 표적 유전자인 rpoB를 주형으로 한 PCR 산물만이 증폭되었음을 알 수 있었다.

Discussion Discussion

본 연구에서 설계된 RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍은 일반 PCR에 의해, L. mirabilis를 종-특이적으로 검출할 수 있음이 확인되

Table 2. Determination of cycle threshold (C T ) value for a dilution

series of genomic DNA of Lautropia mirabilis KCOM 3484 Genomic DNA amount Cell number corresponding

to DNA amount C T value

4 ng 1.15 × 10 ⁶ 15.83

400 pg 1.15 × 10 ⁵ 19.41

40 pg 1.15 × 10 ⁴ 23.67

4 pg 1.15 × 10 ³ 27.74

400 fg 1.15 × 10 ² 32.76

40 fg 1.15 × 10 ¹ 35.80

4 fg 1.15 × 10 ⁰ ND

0 0 ND

C _T values above 35 was considered “not detected” in this study.

ND, not detected.

15 10 ⁷ 10 ⁶ 10 ⁵ 10 ⁴ 10 ³ 10 ² 10 ¹ Copy number of genome 1

Cycle threshold (C ) _T 35

20 25 30 10

20 K

10 K

0

Fluorescence intensity

Cycle

40

20 30 60

40 K 30 K 20 K 10 K Fluorescence intensity 0

Temperature ( C) 90 80

70

A B C

Fig. 3. Sensitivity test of the Lautropia mirabilis-specific quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) primers, RTLm-F4/RTLm-R3. Standard curve (A), amplification plot (B), and melting curve (C) were obtained by qPCR using the RTLm-F4/RTLm-R3 primers from 10-fold serial dilutions of L. mira- bilis KCOM 3484 genomic DNA ranging from 4 ng to 4 fg. In the standard curve, the regression equation for the standard curve was: Y = –0.2421X + 9.7628.

The R ² value was 0.9959.

었다(Fig. 2). 또한, 미국 국립보건원에서 제공하는 Blastn 프로그램 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 이용하여 RTLam- R3 프라이머 핵산염기서열(25개 뉴클레오타이드로 구성)의 상동성 검사를 시행한 결과, 25개 염기서열과 100% 일치하는 유전자는 L.

mirabilis NCTC 12852

^T

균주의 rpoB 이외는 없었다. 25개 염기서열 중, 20개가 연속적으로 100% 일치하는 해양 미생물 균주(Alcanivorax sp. isolate HT1; GenBank accession no. CP080267)가 있었지만, RTLam-R3 프라이머 핵산염기서열의 3’-말단에서 연속적으로 존재하 는 2개의 뉴클레오타이드와는 상동성이 없었다(데이터는 제시 안 함).

반면에 19개 뉴클레오타이드로 구성된 RTLam-F4 프라이머의 핵산염 기서열과 상동성이 100%인 균주는 100개 이상이 존재하였다(데이터 는 제시 안 함). 이는 RTLam-F4 프라이머 핵산염기서열은 rpoB의 상 동성이 잘 보존된 영역에 속하는 것을 시사한다. 두 개의 PCR 프라이 머가 표적 유전자의 핵산염기서열과 상동성이 높을수록, 표적 유전자 가 증폭될 수 있는 특성을 갖는다. 그러므로, Blastn 프로그램을 이용한 RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍의 핵산염기서열 상동성 조사에 의해서도, 이들 프라이머 쌍은 L. mirabilis 종-특이성이 있음을 재확인 할 수 있었다.

RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍의 민감도 조사 결과에 의하 면, L. mirabilis KCOM 3484 지놈 DNA를 40 fg까지 검출할 수 있음 을 알 수 있었다(Table 2, Fig. 3). 아직 L. mirabilis KCOM 3484 지 놈 DNA 핵산염기서열이 결정되지 않았다. 만약 L. mirabilis NCTC 12852

^T

와 L. mirabilis KCOM 3484 지놈 핵산염기서열 크기가 같다 고 가정하면, RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍에 의해, L. mi- rabilis KCOM 3484 몇 마리까지 검출할 수 있는지를 계산할 수 있 다. 지놈 핵산염기서열이 완전히 해독된 L. mirabilis 표준균주(NCTC 12852

^T

) 지놈 크기가 약 3.17 Mb이고(GenBank accession no. NZ_

LR134378), rpoB가 1 copy 존재한다는 것을 고려하면, RTLam-F4/

RTLam-R3 프라이머 쌍은 약 11.5마리의 L. mirabilis KCOM 3484 를 검출할 수 있음을 알 수 있었다(Table 2). 이는 세균 1마리의 지놈 DNA 질량을 몰(mole) 개념으로 계산한 결과이다. 즉, 세균의 1몰은 6.02 × 10

²³

개이고, 뉴클레오타이드 1 bp의 평균 분자량이 660 gm 이므로, 지놈 크기가 약 3.17 Mbp인 L. mirabilis NCTC 12852

^T

의 세 균 1몰 지놈 DNA 질량은 ‘(3.17 × 10

⁶

) × 660 gm’이라 할 수 있어, 세균 1마리 지놈 DNA 질량은 ‘[(3.17 × 10

⁶

) × 660 gm] ÷ 6.02 × 10

²³

’, 즉, ‘3.45 fg’이다. RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍이 L.

mirabilis KCOM 3484 균주 40 fg의 지놈 DNA까지 검출할 수 있으므

로, 약 11.5 (40 fg/3.45 fg) 마리의 L. mirabilis KCOM 3484 균주를 검출할 수 있다고 계산할 수 있다.

본 연구에서 PrimerSelect 프로그램을 이용하여 RTLam-F4/

RTLam-R3 프라이머 쌍을 설계할 때, 최적 결합 온도(optimal an- nealing temperature)는 60.5℃로 제시되었다. 하지만, 실제적인 결 합 온도는 온도 구배 PCR을 시행하여 결정할 것을 제안한 보고가 있 었다[13]. 본 연구에서 RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍의 최종 결합 온도를 결정하기 위해, L. mirabilis KCOM 3484 지놈 DNA와 L. mirabilis 종과 분류학적 측면에서 가장 가깝고, rpoB 핵산염기서 열 상동성이 가장 높은 L. dentalis KCOM 2505

^T

의 지놈 DNA를 이 용하여 온도 구배 PCR을 시행하였다. 그 결과, 모든 온도 영역에서 음 성 대조군 격인 L. dentalis KCOM 2505

^T

지놈 DNA를 주형으로 이 용할 경우에서는 PCR 산물이 증폭되지 않았다. 반면에 L. mirabilis KCOM 3484 지놈 DNA를 주형으로 온도 구배 PCR을 시행한 결과, 58–66℃ 사이에서 증폭된 PCR 산물 밴드의 밝기와 크기는 비슷하였 고, 68–72℃에서 증폭된 PCR 산물의 밝기는 연하였고, 크기는 약간 작았기 때문에, 66℃를 최종 결합 온도로 정할 수 있었지만(Fig. 1), 본 연구에서 사용된 L. mirabilis KCOM 3484의 rpoB 핵산염기서열이 결 정되지 않았고, 실험에 이용된 L. mirabilis 균주가 하나(KCOM 3484) 라는 점 등을 고려하여, RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍의 종-특 이성을 높이기 위해 가장 혹독한 조건인 72℃를 최종 결합 온도로 결정 하였다.

이상의 결과를 종합하면, RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍은 L.

mirabilis에 대한 종-특이성 및 민감도가 뛰어나고, 향후 L. mirabilis와 구강 세균 감염성 질환과의 분자 역학 연구에 이용될 수 있을 것으로 생 각한다.

Acknowledgements Acknowledgements

이 논문은 2020학년도 조선대학교 학술연구비의 지원을 받아 연구되 었음.

Conflicts of Interest Conflicts of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

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