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서 론
신체 내 조직 또는 장기가 정상적인 상태를 유지하기 위해서는 산소 및 영양분의 공급과 노폐물의 배출이 이루
갑상선 자극호르몬이 갑상선암세포의 VEGF, 신생혈관 형성, 성장, 침윤 및 전이에 미치는 영향
아주대학교 의과대학 외과학교실, 1내분비내과학교실
소의영․박희붕․김혜진․김현만1
Effects of TSH on the Production of VEGF, Angiogenesis, Growth, Invasion and Metasta- sis in Thyroid Cancer Cells
Euy Young Soh, M.D., Hee Boong Park, M.D., Hye Jin Kim, M.D. and Hyun Man Kim, M.D.1
Purpose: Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a vascular endothelial cell specific mitogen and a major re- gulator of angiogenesis. VEGF secretion is activated in some thyroid cancers and that VEGF secretion is stimulated by TSH. So we postulated that TSH may promote growth and invasion in some thyroid cancers by stimulating VEGF secre- tion and angiogenesis.
Methods and Results: We investigated the TSH effect for the VEGF secretion, endothelial cell proliferation and inva- sion in vitro with the primary cultured normal thyroid cell (NT-1) and thyroid cancer cell line (TPC-1). And to evaluate the relationship between TSH and VEGF, angiogenesis and tumor growth in vivo, we xenografted human dermal matrix inoculated with thyroid cells into nude mice or directly in- jected subcutaneously. For the study, mice were made hypo- thyroid (Group 1) by antithyroid hormone p.o, hyperthyroid (Group 2) by L-thyroxine injection and euthyroid (Group 3).
One week after the treatment, significant difference were noted in T3, T4 and TSH level between each group, but the VEGF level showed significant difference in group 1 only compared with group 2 and 3. NT-1 or TPC-1 were seeded in the upper chamber of Transwell and HUVEC were cul- tured in lower chamber, and added different concentration of TSH. NT-1 and TPC-1 secreted VEGF under basal condi- tion, but the level were similar. TPC-1 cells secreted signifi- cantly more VEGF than NT-1 after TSH (1, 10, 100 mIU/dl)
stimulation, which were also parallel with the concentration of TSH. In low concentration of TSH (0, 1 mIU/dl), there were no difference of HUVEC proliferation between NT-1 and TPC 1. In high concentration of TSH (10, 100 mIU/dl), however, TPC-1 enhanced HUVEC proliferation than NT-1 significantly (p＜0.05). Similar findings were noted in thyroid cell invasion. Invasion was higher in TPC-1 than in NT-1 in high concentration of TSH (10, 100 mIU/dl). In vivo study using the dermal matrix showed that number of blood vessels ingrowth were higher in Group 1 (25/HPF) than Group 2 (16/HPF) or Group 3 (17/HPF). But there was no difference between Group 2 and Group 3. Level of TSH and VEGF were also increased significantly in Group 1 compared with in Group 2 and Group 3. The size of tumor did not showed significant difference between each group during observation. The tumor from Group 1 (6.2 gm) were larger compared with Group 2 (5.1 gm) or Group 3 (5.6 gm), but this difference was not significant statistically (p＞0.05). The number of blood vessels in tumor were also more increased in Group 1 and were commonly located in the peripheral portion of tumor.
Conclusion: We conclude that thyroid cancer cell line secrete the VEGF and TSH secretion is more enhanced by the stimulation of TSH. And increased VEGF promote the vascular endothelial cell proliferation, invasion and angio- genesis in thyroid cancer. (Korean J Endocrine Surg 2001;
1:51-60)
Key Words: Thyroid stimulating hormone (TSH), Angiogene- sis, Vascular endothelial growth factor (VEGF), Thyroid cancer, Dermal matrix
중심 단어: 갑상선자극호르몬, 신생혈관형성, 혈관 내피
성장인자, 갑상선암
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Departments of Surgery and 1Endocrinology, Ajou Univer- sity School of Medicine, Suwon, Korea
책임저자：소의영, 경기도 수원시 팔달구 원천동 5번지 ꂕ 442-721, 아주대학교 의과대학 외과학교실 Tel: 031-219-5202, Fax: 031-219-5755
E-mail: [email protected]
본 연구는 1998년도 한국과학재단핵심전문연구비의 지원을 받아 이루어진 것임.
게재승인일：2001년 4월 2일
어져야 하며 이를 위해서는 신생혈관형성(angiogenesis)이 필요하다. 신생혈관형성은 배형성, 신체의 성장, 장기의 재생과 같이 정상적인 생리 과정뿐만 아니라 피부 질환에 서 종양의 형성까지 병적인 과정 등에도 다양하게 관여되 고 있다.(1-3) 종양의 크기가 12 mm인 in situ carcinoma는 주로 확산에 의하여 항상성을 유지한다. 반면 종양이 그 이상의 크기로 자라기 위해서나 원격전이를 일으키기 위 해서는 종양 내로 새로운 혈관이 형성되어야한다.(2) 이와 같이 신생혈관형성이 종양의 성장과 진행에 중요함이 알 려짐에 따라 이것이 암의 치료 및 예후의 측정에 이용되 고 있는데 유방암, 흑색종, 자궁경부암 등에서 신생혈관형 성의 정도가 병의 진행정도 및 예후를 예측하고, 혈관종 의 치료로 angiostatin과 같은 antioangiogenic agent가 이용 되고 있다.(4-7)
신생혈관형성을 유도 또는 억제시키는 많은 인자들이 규명되고 있는 데 이중 vascular endothelial growth factor (VEGF), 일명 vascular permeability factor (VPF)는 혈관내 피세포에만 특이적으로 작용하는 mitogen이고 암세포주에 서 분비된다는 특성으로 최근 많은 관심과 연구가 진행되 고 있다.(8-10) VEGF는 34∼42 kDa의 당단백질로서 세포 막 수용체(flt-1, KDR)에 작용하여 phospholipase C system 을 활성화시켜 혈관내피세포를 증식시키고, 미세혈관의 투과성을 증가시켜 혈장 단백을 배출시키고 섬유소를 침 착시켜 새로운 혈관이 형성되는 것을 돕는다.(11-14) 또한 hypoxia, β-FGF, TGF-α and β, mutant ras oncogene 등이 VEGF의 형성에 직접, 간접적으로 관여한다고 알려져 있 다.(15-17) Kim등(18)은 anti-VEGF antibody로 처리 시 mice 에 이식한 종양의 성장이 억제됨을 관찰하였다.
갑상선암 특히 여포성갑상선암은 혈관이 풍부한 종양 으로 이를 통하여 쉽게 암세포의 침윤 및 원격전이를 일 으킨다. 따라서 갑상선암의 성장 및 진행에 VEGF가 중요 한 역할을 할 것으로 사료되나 아직 갑상선암을 대상으로 한 신생혈관형성의 연구는 드문 상태이다. Peter등(19)은 rat goiter 발생 시 angiogenesis, FGF-2, TGF-β1이 증가하고 thrombospondin-1이 감소함을 보고한 바 있으며, Vieglietto 등(20)은 사람 갑상선암 세포 중에서 VEGF가 증가하는 것을 보고하였었다. 따라서 본 연구자는 갑상선암이 성장 과 전이를 하기 위해서는 신생혈관형성이 필요하고 이에 는 갑상선 세포에서 분비되는 VEGF가 중요한 역할을 할 것이라는 가정하에 실험을 진행하였었다. 그 결과 갑상선 암 세포주들에서 VEGF mRNA가 발현되고 시험관 배양 시 VEGF가 분비됨을 관찰한 바 있다.(21)
갑상선암의 성장 및 진행에 갑상선 자극호르몬(TSH)이 중요한 역할을 하다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서 갑상 선암 수술 후 TSH를 억제시킴으로서 재발률을 줄이고 생 존율을 증가시킬 수 있음이 보고되어 TSH 억제요법을 수 술 후 보조요법으로 많은 환자에서 시행하고 있으나 아직
정확한 기전과 전향적 무작위 연구가 되어 있지 않아 그 사용에 이견들이 있다.(22) 본 연구자는 갑상선 세포주들 을 TSH로 처리한 후 VEGF의 변화를 관찰하였으며 그 결 과 정상 세포에서는 VEGF의 증가가 없었으나 갑상선암 세포주에서는 VEGF의 분비가 의의있게 증가됨을 관찰하 여 보고한 바 있다.(23) 이러한 실험 결과들을 바탕으로 갑상선암의 진행에 있어 TSH가 VEGF의 분비를 증가시키 고 이차적으로 신생혈관형성을 활성화시켜 갑상선암의 성장, 침윤 및 전이 등에 관여하고 있다고 가정을 하였다.
이러한 가정을 입증하기 위하여 in vitro, in vivo assay를 통해 배양중인 갑상선암 세포주 및 갑상선 기능을 증가 또는 저하시킴으로서 TSH 변화를 유도한 nude mice를 이 용하여 실험을 하고자 한다.
방 법 1) Cell lines and tissue preparation
실험을 위하여 갑상선암 세포주 중 TSH 자극에 의의있 게 VEGF의 증가를 보였던 TPC-1을 이용하였다.(23) TPC- 1 (Nobuo Satoh, Japan 제공)은 유두상 갑상선암에서 유래 하였으며 mean doubling time이 34시간이며 H5 medium에 서도 빠른 증식을 한다. 정상 갑상선세포(이하 NT-1이라 함)는 수술실에서 얻은 갑상선 정상 조직을 일차배양을 하여 사용하였다. 세포 배양에 필요한 조직은 수술 중 1 gm (1 cm3) 정도의 조직을 얻어 실온 상태의 Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM)가 들어있는 멸균된 배양 유리관에 넣은 후 30분 내에 일차배양을 시행하였다.
방법을 간단히 기술하면 3 ml PBS buffer를 넣은 petri dish에 갑상선조직을 옮기고 1 mm3의 크기로 잘게 자른 다. 자른 조직과 PBS를 15 ml sterile polyethylene tube로 옮 기고 2,000 rpm에서 5분간 원심 분리 후 상층액을 버린다.
남아있는 pellet을 10 ml PBS로 분탕 후에 2,000 rpm에서 5 분간 다시 원심분리하고 상층액을 버린다. 10 ml collage- nase solution으로 현탁 후에 magnetic stir bar가 있는 sterile erlenmeyer flask로 옮긴 후 37oC water bath에 stir/incubation 한다. 다음에 15 ml polyethylene tube로 옮긴 후 2,000 rpm 에서 10분간 원심 분리한다. 상층액을 제거하고 pellet을 10 ml starting media로 분탕한다. Culture flask로 옮긴 후 배양기 내에서 24∼48시간 배양한다. 배양액은 10% FBS (Life Technologies, Inc. Maryland, USA), TSH 10 mIU/dl (Sigma, St. Louis, USA), insulin 10μg/dl (Sigma), penicillin 50 mg/dl (Life Technologies), streptomycin 50μmole/dl (Life technologies), fungizone 250μg/dl을 포함하는 DME/F-12 (Sigma)를 사용하였다. 갑상선세포들은 일반적인 배양 조 건인 5% CO2, 95% humidity, 37oC 배양기내에서 배양하고, 80∼90%의 confluency에 이르면 계대배양 시키거나 DMSO 처리 후 액화질소에 보관하였다. Human umbilical venous
cell (HUVEC, ATCC, VA, USA)은 human endothelial-SFM basal growth medium (Life Technologies)을 배양액으로 사 용하였다. 배양액에 포함된 FBS은 signaling pathway를 증 가 혹은 감소시킬수 있기 때문에 실험 시작 24시간 동안 갑상선 세포들을 H5 media (insulin 10μg/dl, human trans- ferrin 5μg/dl, somatostatin 10 ng/dl, glycyl-L-histidyl-L-lisine acetate 2 ng/dl, hydrocortisone 0.36 ng/dl를 포함하는 DME/
F-12에서 배양하였다.
2) Animal
실험을 위하여 3∼4주된 NCR-nu athymic nude mice (Simonsen Labs, Gilroy, USA)를 이용하였으며 다음과 같이 세군으로 나누어 갑상선 기능을 변화 시켰으며 각 군당 5 마리를 사용하였다.(19,23,24) 갑상선 기능저하(1군)를 유 도하기 위하여 0.15% 5-propyl-2-thiouracil (PTU, Sigma)가 포함된 음식물과 0.01% (w/v) methylmethimazole (MMI)이 포함된 물을 먹였으며, 갑상선 기능 항진(2군)을 유도하기 위하여 L-thyroxine (10μg/10 gm body weight)이 용해된 0.1 N NaOH를 0.9% 생리식염수에 혼합하여 매일 복강내 주사하였다. 3군은 정상 갑상선 기능을 유지시키기 위하 여 정상적인 사료를 사용하였다. 마취제(Ketamine：Xyla- zine=1：1, 0.01 cc/10 gm body weight)를 복강 내 주사하였 으며, 사망의 유도는 폐쇄된 상자 내에서 ether를 다량 흡 입시켜 시행하였다. 혈액 채취는 사망 전에는 꼬리 정맥 을 이용하였고, 사망 후에는 cardiac puncture 또는 복강내 정맥에서 하며 혈청을 분리하여 -20oC에 보관하였다.
nude mice에서 갑상선 기능이 변화되는 시기를 알기 위하 여 갑상선 기능항진 및 기능저하를 유발 전, 유발 후 1주 와 2주에 혈청 T3, T4, TSH를 radioimmunoassay를 이용하 여 측정하였다. 동시에 혈청내 VEGF를 측정하여 TSH의 변화가 nude mice에서 VEGF의 변화를 일으키는지 확인하 였다.
3) Thyroid cancer cell xenograft
갑상선 기능에 따른 갑상선암의 신생혈관 형성, 침윤, 성장을 관찰하기 위하여 갑상선암 세포주를 nude mice의 subdermal space에 직접 주사하였으며 신생혈관 형성 및 침윤에 미치는 영향을 알기 위하여 human dermal matrix model을 만들어 사용하였다. Human dermal matrix는 수술 시 얻은 피부(split thickness human skin)를 penicillin이 포함 된 phosphate buffer saline (PBS)에 넣어 -20oC에서 1시간 얼린후 37oC의 water bath에서 1시간 녹이는 과정을 반복 하여 표피를 dermis에서 제거하였다. 15 ml disposable polypropylene test tube를 상단 2 cm 부위에서 잘라 well을 만들고 여기에 1.2 cm2의 크기로 자른 dermal matrix를 dermal-epidermal junction 부위를 위로하여 위치시킨다. 갑 상선암 세포(5×105/cm2)를 dermal matrix위에 분주 후 갑
상선 세포의 배양조건에서 배양시켜 갑상선 암세포가 dermal matrix 표면에 부착하여 단층이 형성되도록 한다.
배양 5일 후 dermal matrix를 배양된 세포가 안에 위치하 게 반으로 접고 주위를 6-0 nylon으로 봉합하여 pocket을 만든 후 nude mice의 등쪽 subdermis에 이식하였다. 이식 2 주 후에 사망시킨 후 dermal matrix를 꺼내 10% buffered formalin에 24시간 고정시키고 2 mm 넓이로 길게 절단하 여 paraffin slide를 만들어 보관하였다.
4) Proliferation assay
HUVEC 증식을 알기 위하여 2개의 세포를 동시에 배양 하였으며 이를 위해 0.2μm pore size nucleopore poly- carbonate membrane이 부착된 6.5 mm transwell (Costar, Cambridge, USA)을 사용하였다.(26) Transwell의 상층에는 NT-1 또는 TPC-1 (n=200,000/100μl H5 media)를, 하층에는 HUVEC (n=100,000/600μL H5)을 각각 분주한 후 3일과 5 일 후에 상층액은 원심분리한 후 VEGF 측정을 위해 -70oC 에 보관하였다. HUVEC의 수는 CellTiter 96 AQueous One Solution (Promega)를 이용하여 측정하였다. 상층액은 TSH (1, 10, 100 mIU/ml)를 첨가한 군과 첨가하지 않은 H5
media를 사용하여 TSH자극에 의한 VEGF 분비 및 혈관내 피세포 증식의 상관관계를 관찰하였다. TSH가 직접적으 로 HUVEC의 VEGF 분비 및 내피세포 증식에 영향을 미 치지 않는다는 것을 증명하기 위하여 96 well에서 HUVEC 을 TSH가 포함된 배양액과 포함되지 않은 배양액에서 자 라게 한후 위와 같은 방법으로 측정하였다.
5) Invasion assay
8μm pore size nucleopore polycarbonate membrane이 있 는 6.5 mm Transwell (Costar)을 사용하였다. 침윤은 mem- brane에 Matrigel (Matrigel：serum free medium=1：10)을 도포한 후 세포가 이를 통과하는 수로서 평가하였다. 상 층에 NT-1, TPC-1 (n=200,000/100μL H5)를, 하층에는 600 μL H5만 넣은 후 3일과 5일 후에 상층액은 VEGF측정을 위해 -70oC에 보관하고, 하층의 세포수는 CellTiter 96 AQueous One Solution를 이용하여 측정하였다. 상층액은 TSH (1, 10, 100 mIU/ml)를 첨가한 군과 첨가하지 않은 H5
media를 사용하여 TSH자극에 의한 VEGF 분비 및 침윤의 상관 관계를 관찰하였다.
6) In vivo assay for thyroid cancer angiogenesis and growth
TSH변화에 따른 VEGF 양이 갑상선암의 신생혈관형성 및 침윤과 상관관계가 있는지를 알기 위하여 갑상선암 세 포주가 배양된 human dermal matrix를 nude mice에 xeno- graft하였으며 이식 2주 후에 dermal matrix를 제거하였다.
이식 전과 이식 후 2주의 혈청 T3, T4, TSH 및 VEGF의
양을 측정하여 상관관계를 알아보았고, 신생혈관형성의 평가를 위하여 dermal matrix내로 nude mice에서 자라들어 온 혈관 수를 평가하였으며 이를 위하여 immunohisto- chemical staining (H&E stain)을 시행하였다. TSH 변화에 따른 VEGF 양이 갑상선암의 성장과 상관 관계가 있는지 를 알기 위하여 배양된 갑상선암 세포주(1×106/0.2 ml DMEM)를 갑상선 기능을 변화시킨 nude mice의 피하에 주사하였다. 갑상선암의 성장에 미치는 영향을 보기 위하 여 종양의 크기를 1주에 2회 주기적으로 측정하며 대상군 중 사망하는 쥐가 있는 경우와 이식 4주 후에는 실험쥐 전부를 사망시켜 종양의 무게와 크기를 측정하였다. 전이 에 미치는 영향을 보기 위하여 부검을 시행하여 타 장기 에 전이 유무 및 전이된 병소 부위의 수와 전체적인 부피 를 측정하였다. Nude mice에서 자란 갑상선암의 조직 표 본을 만들어 신생혈관형성(H&E stain)의 정도를 관찰하였 으며, 이식 전과 이식 후 TSH와 VEGF를 측정하여 성장 및 전이의 정도와 상관 관계를 비교하였다. 신생혈관을 보기 위한 조직표본의 염색은 H&E 염색을 하였으며 dermal matrix 또는 종양 조직 내에 적혈구를 포함한 혈관 을 신생혈관으로 간주하고 그 수를 측정하였다.
7) Enzyme linked immunosorbent assay
VEGF를 측정하기 위하여 Quantikine human VEGF im- munoassay kit (R&D system, Minneapolis, USA)을 이용하였 다. Assay diluent 50μl를 각 well에 분주 후 VEGF standard 와 보관된 sample 200μl를 각 well에 옮겼다. 실온에서 2 시간 방치 후 wash buffer 400μl로 3회 세척한 후 VEGF conjugate 200μl를 각 well에 분주하였다. 실온에서 2시간 방치 후 3회 세척한 후 200μl의 substrate solution을 각 well에 분주하고 실온에서 20분간 방치 후 stop buffer 50 μl를 각well에 분주 후 450 nm에서 OD값을 측정하였다.
Cell proliferation assay를 위해 CellTiter 96 AQoues One Solution (Promega, Medison, USA)를 사용하였다. 배양액을 포함하는 culture well에 시약을 배양액의 1/5 첨가 후 37oC CO2 배양기에서 1∼4시간 배양하고 490 nm에서 OD값을 측정하였다.
8) Statistical method
결과의 유의성을 검증하기 위하여 Student's t test를 사 용하였으며 p＜0.05 이하를 의의있는 것으로 평가하였다.
결 과 1) Proliferation assay
배양 3일 후에 측정한 VEGF의 수치는 TSH 농도에 관 계없이 NT-1에서는 차이를 보이지 않으나 TPC-1에서는 TSH가 증가할수록 VEGF의 농도도 의의있게 증가됨을 관
찰할수 있었다(p＜0.01). 배양 5일 후에는 NT-1과 TPC-1 둘다 VEGF 수치의 의의있는 증가가 있었다. NT-1과 TPC-1간의 VEGF 수치의 차이는 배양기간에 관계없이 TSH 0 mIU/ml에서는 차이가 없었으나 TSH 1, 10, 100 mIU/dl에서는 의의있는 차이를 보였고 특히 TSH 농도가 증가할수록 그 차이는 증가하였다(p＜0.01)(Table 1). 갑상 선 세포가 포함되지 않은 control 군에서는 TSH 농도 및 배양기간에 관계없이 VEGF 치는 차이가 없었다. 이상의 소견은 TSH가 갑상선 세포에서 VEGF의 생성과 관계있으 며 정상갑상선 세포인 NT-1에 비하여 유두상 갑상선암에 서 유래한 TPC-1에서 의의있게 VEGF 생성을 증가시킴을 보여주고 있다.
배양 3일 후에 측정한 HUVEC 수치는 TSH의 농도에 관 계없이 NT-1과 TPC-1 각각 차이를 보이지 않았으며(p＞
0.05) 배양 후 5일째에도 같은 결과를 보였다. NT-1과 TPC-1 간의 HUVEC 수치의 차이는 배양기간에 관계없이 TSH 0 mIU/ml과 1 mIU/ml에서는 차이가 없었으나 TSH 10 mIU/m과 l00 mIU/ml에서는 의의있는 차이를 보였다(p
＜0.05). 또한 TSH 0 mIU/ml와 TSH 1 mIU/ml에서는 배양 3일과 5일 사이에 HUVEC 증식에 차이를 보이지 않으나 TSH 10 mIU/ml과 TSH 100 mIU/ml에서는 배양기간이 길 수록 HUVEC의 증식이 의의있게 증가함을 관찰할 수 있 었다(p＜0.05)(Table 2). 따라서 TSH 10 mIU/ml과 TSH 100 mIU/ml에서는 배양기간이 길수록 의의있게 HUVEC 증식 이 증가하며, NT-1에 비하여 TPC-1에서 의의있게 HUVEC 증식을 증가시킴을 알 수 있었다. 그러나 갑상선세포가 없는 대조군에서는 TSH의 농도에 관계없이 HUVEC의 증
Table 1. Effect of TSH on VEGF secretion in thyroid cells ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ
Cell lines
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
NT-1 TPC-1 Control
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ TSH level (mIU/ml)
3 days after culture
0 7.3±0.2 NS 7.1±0.1 7.7±.76 1 8.1±0.4 p＜0.01 10.6±0.4 8.6±0.5 10 9.0±0.6 p＜0.01 25.0±1.8 7.9±0.1 100 10.8±0.6 p＜0.01 34.3±0.7 6.3±0.3 5 days after culture
0 7.0±0.8 NS 6.8±0.1 8.3±0.1 1 10.8±0.0 p＜0.01 13.0±0.1 10.1±0.3 10 16.5±1.3 p＜0.01 37.3±0.9 9.0±0.3 100 23.5±0.8 p＜0.01 49.5±1.5 9.0±0.2 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Values are Mean±SD (ng/dl); NT-1 = normal thyroid cell; TPC-1
= papillary thyroid cancer; Control = cultured without thyroid cell;
NS = not significant.
식이 없었다
2) Invasion assay
TSH의 농도에 따른 VEGF변화는 Table 1과 비슷한 결과 를 보였다. 배양 3일 후 측정한 침윤의 수치는 TSH 0 mIU/ml와 TSH 1 mIU/m 에서는 NT-1과 TPC-1 간에 차이 가 없었으나, TSH 10 mIU/m과 l00 mIU/ml에서는 두세포 사이에 의의있는 차이를 보였다(p＜0.05). TSH 농도에 따 른 각 세포주의 침윤은 차이가 없었으나 배양 5일 후는 TPC-1의 경우 TSH 100 mIU/ml이 TSH 0 mIU/ml에 비하여 의의있는 차이를 보여주고 있었다. 같은 농도의 TSH 자극 을 한 경우 배양기간이 길수록 NT-1 및 TPC-1 둘다 침윤 이 증가하였다(p＜0.05)(Table 3). 따라서 배양기간이 길고
TSH의 농도가 높을수록 침윤은 증가하며 NT-1에 비하여 TPC-1이 의의있게 침윤이 증가함을 관찰할 수 있었다.
3) Thyroid function and VEGF level in mice treated with thyroid hormone
제1군의 경우 혈청 T3, T4는 갑상선저하 유도 1주 및 2 주후에 의의있게 감소하였고 TSH는 의의있게 증가하였으 며(p＜0.05), 2군의 경우는 1주와 2주 후 T3, T4는 의의있 게증가 TSH는 의의있게 감소하였다(p＜0.05). 정상갑상선 기능을 유도한 3군의 경우는 T3, T4, TSH 모두 기간에 따 른 차이는 없었다(p＞0.05). 갑상선 호르몬 처치 후 7일과 14일의 T3, T4, TSH는 각군간에 차이가 있었다(p＜0.05).
VEGF 수치는 1군의 경우 갑상선 기능 변화를 유도한 1주 후부터는 2군과 3군에 비하여 의의있게 증가하였으나 2군
Table 4. T3, T4, TSH and VEGF level in mice treated with thyroid hormone
ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ
Group 1 Group 2 Group 3
Days ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
0 7 14 0 7 14 0 7 14
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ T3 74.4±5.0 57.0±6.0 44.3±3.5 68.0±5.6 123.6±5.0 231.7±21.1 68.0±3.0 70.0±6.0 71.3±5.9 T4 4.2±0.1 1.4±0.1 0.9±1.6 4.2±0.0 6.3±0.1 9.0±0.1 4.1±0.2 4.3±0.17 3.9±0.6 TSH 0.84±0.05 2.53±0.17 4.70±0.61 0.81±0.06 0.11±0.02 0.1±0 0.76±0.09 0.72±0.04 0.74±0.04 VEGF 1.19±0.02 3.33±0.94 4.17±0.55 1.50±0.06 1.17±0.15 1.22±0.11 1.41±0.33 1.16±0.11 1.03±0.16 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Values are mean±SD. T3 = ng/dl; T4 = μg/dl; TSH = ng/dl; VEGF = ng/dl.
p＜0.05 Group 1, vs Group 2 or Group 3 on day 7 and 14.
Group 1 = hypothyroid mice; Group 2 = hyperthyroid mice; Group 3 = euthyroid mice.
Table 2. Effect of TSH and VEGF on the proliferation of HUVEC ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ
HUVEC
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
NT-1 TPC-1 Control
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ TSH level (mIU/ml)
3 days after culture
0 1.22±0.14 NS 1.41±0.23 1.2±0.2 1 1.30±0.07 NS 1.45±0.05 1.3±0.1 10 1.41±0.03 p＜0.01 1.63±0.02 1.2±0.2 100 1.14±0.04 p＜0.01 1.65±0.00 1.2±0.1 5 days culture
0 1.51±0.10 NS 1.54±0.14 1.3±0.1 1 1556±0.03 NS 1.72±0.10 1.2±0.1 10 1.65±0.02 p＜0.05 1.70±0.00 1.2±0.1 100 1.59±0.04 p＜0.01 1.85±0.04 14±0.1 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Values are Mean±SD. NT-1 = normal thyroid cell; TPC-1 = papillary thyroid cancer; Control = cultured without thyroid cell;
NS = not significant.
Table 3. Cancer cell invasion vs, TSH concentration ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ
Cell lines
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NT-1 TPC-1
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ TSH level (mIU/ml)
3 days after culture
0 31.87±1.67 NS 35.32±2.78
1 31.94±1.14 NS 35.85±0.80
10 31.58±2.08 p＜0.01 38.74±2.40
100 34.16±0.95 p＜0.01 41.45±2.88
5 days culture
0 41.16±0.98 NS 43.74±2.07
1 43.14±0.98 NS 43.9 ±3.10
10 41.82±1.84 p＜0.05 45.35±2.24
100 43.47±2.20 p＜0.01 48.47±1.55
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Values are Mean±SD. NS = not significant; NT-1 = normal thyroid cell; TPC-1 = papillary thyroid cancer.
과 3군 사이에는 차이가 없었다(Table 4).
4) Angiogenic effect of TSH in dermal matrix
Mice에 이식한 dermal matrix에서 새로운 혈관의 형성은 전층에서 관찰되었다. H&E 염색상 적혈구가 혈관내에 있 는 것을 신생혈관으로 간주하였으며 임으로 가장 혈관의 밀도가 높은 곳을 5군데 선정하여 그 수를 측정하였다. 1 군의 평균 혈관의 수는 25.0±4.63개/HPF (mean±SD)로 2 군 16.2개/HPF과 3군 17.2개/HPF에 비하여 의의있게 신생 혈관의 수가 증가되어 있었다(p＜0.05). 2군과 3군간에는 의의있는 차이를 보이지 않았다. 2주째 VEGF는 1군이 5.35±1.98 ng/dl로 2군 및 3군에 비하여 의의있는 차이를 보이고 있었다(Table 5)(Fig. 1).
5) Tumor growth effects of TSH in nude mice
실험 기간 동안 mice의 몸무게는 의의있는 차이는 보이 지 않았다. 각군에 이식한 종양은 기간이 지남에 따라 점 차 크기가 증가하였으나 세군간에 의의있는 크기의 차이 는 없었다. 이식 4주째 쥐를 사망시킨 후 종양의 무게를
측정하였으며 1군(6.24±87 gm)이 2군(5.1±0.91 gm) 및 3군 (5.58±0.93 gm)에 비하여 무게가 컸으나 세군간에 의의있 는 차이는 보이지 않았다(p＜0.05)(Fig. 2). 그러나 VEGF 치 는 1군이 2군 및 3군에 비하여 의의있게 증가되어 있었다.
모든 실험쥐에서 복강내 장기의 전이 유무를 조사하였으나 전이는 없었다. 종양 조직을 H&E 염색 후 종양내의 혈관을 관찰하였으며 1군이 2군 및 3군에 비하여 종양의 표면에 신 생혈관의 수가 증가되어있음을 관찰할 수 있었다(Fig. 3).
Fig. 1. H&E staining of human dermal matrix in hypothyroid (A), hyperthyroid (B) and euthyrooid (C) rat. Arrows denote staining of new blood vessels with RBC (×100).
A
B C
Table 5. Effects of thyroid function on angiogenesis and VEGF level in nude mice
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Group 1 Group 2 Group 3
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Vessel density 25.0±4.63* 16.2±3.4 17.2±2.6
VEGF 5.35±1.98* 1.1±0.23 1.5±0.56
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Values are mean±SD. Vessel density: No. of blood vessel/HPF.
VEGF: ng/dl.
* = p＜0.05 between Group 1 and Group 2 or Group 3.
고 찰
악성종양에서 갑상선암이 차지하는 비율은 1∼2%에 불
과하나 내분비암 중에서는 가장 발생 빈도가 높다. 갑상 선암은 오랫동안 indolent 상태를 유지하거나 천천히 자라 서 좋은 경과를 보이기도하나 때로는 급격히 성장하고 주 위의 주요 장기에 침윤 및 원격전이를 일으키는 등 다양한 Fig. 3. H&E staining of tumor in hypothyroid (A), hyperthyroid (B) and euthyrooid (C) rat. Arrows denote staining of new blood vessels
with RBC (×100).
A
B C
Fig. 2. Tumor mass in nude mice injected with TPC-1, A: 2 weeks after xenograft, B: 4 weeks after xenograft. Hypothyroid mice (upper), hyperthyroid mice (middle) and euthyrooid mice (lower).
A B
특성을 가지고 있다.(22) 갑상선암의 발생과정에는 여러가 지 유전적 변화들과 여러가지 성장인자들이 관여하는 것 으로 알려져 있으며 이러한 성장인자들은 신생혈관 형성 을 증가시켜 종양의 성장을 촉진시킨다.(27-29) b-FGF, TGF-β, PIGF, PDGF, TNF-α 등 여러 성장인자들이 신생 혈관 형성을 증가시켜 종양의 성장을 유발시키는데 이중 VEGF가 대표적으로 많이 알려져 있다.(30) Sato등(31)이 처음으로 정상 및 그레이브스병의 갑상선조직에서 VEGF m-RNA가 발현됨을 보고하였고, Viglietto등(20)은 갑상선 암 세포주의 악성도와 비례하여 VEGF의 분비가 증가함 을 보고한바있다. 저자는 갑상선암 세포주가 정상갑상선 세포에 비하여 VEGF m-RNA의 발현, VEGF의 형성 및 분 비가 증가되어 있고,(21) VEGF에 대한 단세포군 항체를 이용하여 VEGF의 작용을 억제시킨 결과 신생혈관의 형 성 및 종양의 성장을 억제시킴을 관찰한 바 있다.(29) 또 한 갑상선 종양에서 면역조직화학염색법을 이용하여 미 세혈관 수와 VEGF 및 그 수용체의 발현 강도를 조사한 결과 갑상선 양성종양보다 갑상선암에서, 분화갑상선암보 다 미분화 갑상선암에서 미세혈관 수와 VEGF 및 그 수용 체의 발현 강도가 의의있게 증가되어 있음을 보고하였 다.(32)
TSH는 갑상선 여포세포를 자극하여 증식을 일으키기 때문에 갑상선암의 성장 및 재발에 중요하나 이에 대한 정확한 기전은 아직 알려져 있지 않다. 따라서 저자는 갑 상선암의 성장 및 재발에 중요한 TSH가 VEGF와 서로 상 관 관계가 있을 것으로 가정을 하여 본 연구를 통해 입증 하고자 하였다. 실험 결과 TSH의 자극이 없는 경우는 NT-1과 TPC-1 사이에 VEGF 형성에는 차이가 없었으나 TSH의 자극이 있는 경우에는 의의있는 차이를 보였고 농 도가 증가할수록 그 차이가 증가하여 TSH가 갑상선 세포 에서 VEGF의 형성과 관계가 있으며 정상보다는 갑상선 암에서 의의있게 VEGF의 생성을 증가시킴을 알 수 있었 다. 이와 같은 결과는 갑상선암세포인 FTC-1, XTC-1, MTC- 1을 이용한 Soh등(23)의 실험과 동일한 결과를 보여주고 있다. VEGF는 내피세포에만 특이적으로 작용하여 증식 및 신생혈관의 형성에 관여한다.(21) 저자는 각각 다른 TSH 농도 하에서 transwell을 사용하여 갑상선세포와 혈관 내피세포인 HUVEC을 배양한 결과 TSH 10 mIU/ml와 100 mIU/ml에서 TPC-1이 NT-1에 비하여 HUVEC 증식이 의의 있게 증가됨을 관찰할 수 있었다. 이러한 소견은 TSH가 HUVEC 증식에 영향을 미치며 이는 TSH에 의해 형성된 VEGF가 관계 있음을 보여주고 있다. VEGF가 암의 침윤 과 관계있다는 보고는 없으나 Segal등(28)은 갑상선종양의 피막침윤부위를 조사한 결과 피막 침윤이 없는 부위에 비 하여 미세혈관의 수가 증가되어 있음을 관찰한바있다. 이 는 갑상선암이 신생혈관의 형성이 이루어진 후 침윤이 일 어나는 것인지 또는 침윤 후에 미세혈관이 형성되는 것인
지는 명확치 않으나 암의 침윤, 미세혈관형성 및 혈관성 장인자 간에 서로 연관성이 있음을 시사하고 있다. Ma- trigel을 이용한 본 실험에서 TSH의 농도가 증가할수록 갑 상선암 세포의 침윤이 정상세포에 비하여 의의있게 증가 된 결과는 TSH가 갑상선 세포의 침윤에 간접적으로 영향 을 미치며 이는 TSH에 의해 증가된 VEGF가 관계있고 갑 상선암이 정상갑상선에 비하여 TSH의 영향을 더 받음을 보여주고 있다. 그러나 임상적으로 주위조직으로 침윤을 일으키지 않는 정상갑상선 세포에서 유래한 NT-1이 ma- trigel을 통과하여 침윤을 일으킨 본 실험 결과는 설명하기 어려우며 추후 더 연구되어야할 과제이다. In vivo assay를 위해 갑상선 기능의 변화를 유도한 실험 동물은 유도 1주 후부터 차이를 볼 수 있었다. 실험 1주 및 2주에 측정한 T3, T4, TSH는 1군이 2군 및 3군에 비하여 의의있게 TSH 가 증가하였고 T3, T4는 감소되어있었다. 이와함께 혈청 VEGF의 수치도 1군이 2군 및 3군에 비하여 의의있게 증 가되어 있어 실험동물을 이용한 신생혈관형성 및 종양의 성장을 보기 위한 실험 모형으로 이용이 가능하였다, 그 러나 갑상선 기능이 항진된 경우에는 정상 기능의 mice에 비하여 TSH 및 VEGF 수치가 의의있게 감소하지 않아 갑 상선 기능항진에 따른 효과는 볼 수 없었다. Gerling등(32) 은 in vivo에서 암의 침윤을 관찰하기 위한 human dermal matrix model을 처음 사용하였다. 이를 이용하여 nude mice 에서 갑상선 기능을 변화시켜 VEGF를 증가 또는 감소 시 킨 후 dermal matrix내에 신생혈관 형성을 관찰하였다. 1군 의 평균 혈관수가 2군 및 3군에 비하여 의의있게 증가함 을 관찰하여 TSH의 증가로 인한 VEGF의 상승이 신생혈 관 형성을 촉진함을 실험동물에서 입증할 수 있었다. 저 자는 dermal matrix를 사용하여 rhVEGF가 실험동물에서 신생혈관을 형성하며 rhVEGF의 농도에 비례하여 증가됨 을 관찰한바 있다.(29) 따라서 상기 결과는 갑상선 기능저 하가 유도된 mice에서 TSH가 증가하고 이로 인해 VEGF 가 증가하여 신생혈관의 형성을 촉진시킴을 확인할 수 있 었다. 그러나 이식한 종양세포의 성장은 4주간의 관찰기 간 중에도 각 군간에 차이를 볼 수가 없었는데 이는 본 실 험의 각 군간의 VEGF 차이로는 4주간의 기간동안 TPC-1 의 성장 속도에 영향을 줄 정도로 효과가 적었던 것으로 사료되며 좀더 장기적인 이식후의 관찰 기간이 요할 것으 로 사료되었다.
분화 갑상선암중 유두상 갑상선암은 발견 당시 이미 40
∼80%에서 미세 임파절 전이, 5%에서 원격 전이가 있으 며, 여포성갑상선암은 각각 10% 및 13∼30%에서 미세 전 이가 있음이 보고되고 있어 수술 후 보조요법으로 방사요 오드 치료와 TSH 억제요법을 시행하고 있다.(22) 이중 방 사요오드 치료가 효과적으로 사용되고 있으나 갑상선암 의 90% 이상을 차지하는 유두상 갑상선암과 여포성 갑상 선암의 30%, 이외 갑상선 수질암, Hurthle cell carcinoma
및 미분화암은 방사요오드를 흡수하지 않기 때문에 사용 할 수 없다.(22) TSH는 갑상선 여포세포를 자극하여 증식 을 일으키기 때문에, TSH분비를 억제시킴으로서 갑상선 암 수술 후 재발률을 줄이고 생존율을 증가시킬 수 있음 이 보고되고 있다. 이에 따라 많은 수술 환자에게 TSH 억 제요법을 시행하고 있으나 아직 TSH 사용에 대한 정확한 기전은 알려져 있지 않고 그 사용에 있어서도 이견이 있 다. 본 실험 결과 갑상선암의 성장에는 갑상선암세포에서 분비되는 VEGF가 중요한 역할을 담당하며 혈청 TSH가 이에 영향을 미친다는 것을 입증할 수 있어 갑상선암에서 TSH를 억제시키기 위해 갑상선호르몬을 사용하는데 대한 이론적인 근거를 제시할 수 있었다. 이에 따라 갑상선암 의 치료 시 TSH 억제요법에 대한 중요성이 더욱 강조될 수 있을 것이다. 또한 기존 치료 방법으로는 치료가 불가 능한 환자들에게 신생혈관의 형성을 억제하는 치료를 적 용시킬 수 있을 것으로 사료된다.
결 론
TSH는 NT-1과 TPC-1에서 TSH의 농도에 비례하여 의의 있게 VEGF의 생성을 증가시키며(NT-1은 배양 5일째에) 이는 NT-1에 비하여 TPC-1에서 의의있게 증가됨을 알수 있었다. 그러나 TSH의 자극이 없는 경우는 두 세포주 모 두 배양 기간에 따른 VEGF수치는 차이를 보이지 않았으 며 세포주간에도 차이가 없었다. HUVEC의 증식은 TSH 10 mIU/ml과 TSH 100 mIU/ml시 NT-1에 비하여 TPC-1에 서 의의있게 증가하였으며 배양기간이 길수록 의의있게 차이가 있었다. NT-1과 TPC-1 각각에서 TSH의 농도에 따 른 세포 침윤의 차이는 볼 수 없었다. 그러나 배양기간이 길수록 각각 침윤의 정도는 증가하였으며, 세포간의 차이는 TPC-1이 NT-1에 비하여 의의있게 침윤의 정도가 높았다.
실험쥐의 T3, T4, TSH의 변화는 3개군 모두에서 의의있 는 변화를 보였다. VEGF는 갑상선 호르몬 처치 후 1군은 2군 3군에 비하여 의의있는 증가가 있었으나, 2군과 3군 사이에는 차이가 없었다.
1군의 신생 혈관의 수는 25.0±4.63개/HPF (mean±SD) 로 2군 16.2개/HPF, 3군 17.2개/HPF에 비하여 의의있게 신 생 혈관의 수가 증가하였으나(p＜0.05), 2군과 3군간에는 의의있는 차이를 보이지 않았다. 2주째 VEGF는 1군이 5.35±1.98 ng/dl로 2군(1.1±0.23 ng/dl) 및 3군(1.5±0.56 ng/dl)에 비하여 의의있는 차이를 보이고 있었다.
이식 후 4주에 측정한 종양의 무게는 1군(6.240±8.7 gm)이 2군(5.1±0.91 gm) 및 3군(5.58±0.93 gm)에 비하여 많았으나 통계적으로 의의있는 차이는 없었다. 종양조직 내의 신생혈관은 1군에서 많이 관찰되었으나 역시 3군간 에 유의한 차이는 없었다.
이상의 결과 TSH는 in vitro 상 VEGF의 형성 및 혈관내
피세포의 증식과 침윤을 증가시키며, 실험동물에서 갑상 선 기능 저하의 유도로 증가된 TSH는 VEGF 형성, 신생혈 관의 형성과 관계 있었다.
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