연구수당

1. 개요

□ 연구 배경

○ 2010년 6월 과학중점학교로 지정된 이래 실험실습 중심의 과학 교육을 위한 첨단 시설을 완비하여 학생들의 탐구력 향상을 위한 토대 마련 ○ 과학중점 학생들이 1, 2학년 과정에서 과학 교과의 4개 영역Ⅰ, Ⅱ 과목을

이수하여 폭넓은 과학적 지식을 배양할 수 있도록 교육과정 편성 ○ 과학중점학교로서 2013년 교사 업무 분장에 「탐구팀」을 신설하고, 「과

제 연구」시간을 활용하여 학생들의 탐구 동기 유발과 가설 설정 및 설계 능력 배양을 위한 ‘탐구보고서 강독’, ‘실험 평가’등의 프로그램을 운영하고 있음.

○ 본 연구팀은 평소 생명과학에 관심이 많아 중학교 때부터 버섯을 이용한 Bio-ethanol 생산 실험을 진행한 결과와 연구 경험을 가지고 있고, 2013년도 STEAM R&E 페스티벌에 참가하여 「Stropharia rugosoannulata_{를 이용} 폐목재로부터의 Bio-ethanol 생산과 곡물을 이용한 Bio-ethanol 과의 효율 성 비교 연구」라는 주제로 상위 30팀 안에 선발되어 2014 ISEF-K에 참가한 경험을 가지고 있음.

○ 본 연구팀의 팀원은 2014년「버섯의 종류에 따른 Cellulose의 분해 정도 비교 및 이를 이용한 Bio-ethanol 생산」이라는 주제로 서울시과학전람회 에 출품하여 수상한 실적이 있고 균류에 대한 호기심과 풍부한 지식을 가지고 있음.

○ 과학 탐구, 연구 활동을 하는 학교 환경 속에서 본 연구팀은 기존 버섯을 이용한 Bio-ethanol 생산 연구를 바탕으로 하여 좀 더 발전된 연구를 하기 위해 모였고, 이번 연구 활동에 높은 자신감과 의욕을 가지고 있음.

○ 2010년 10월 일본 나고야에서 열린 생물다양성협약 당사국총회에서 국제협 약 형태의 ‘ABS(Access to genetic resource and Benefit Sharing)국제레 짐’을 위한 의정서가 채택, 이에 따라 해외 생물유전자 확보, 이용에 대한 로열티 지불, 특허출원 제한 등 BT관련 연구 및 개발에 영향.

○ 균류 관련 연구에 있어서 실험에서 높은 성과를 낼 수 있으면서 ABS국제규 범에 영향을 받지 않는 한국자생버섯균주 선발 필요.

□ 연구 범위

○ 한국 내에 자생하는 버섯 6종을 분양받아 계통을 분류하고 분석 ○ 백색부후균(white rot fungi)에 관해 조사 및 분석

○ 목질의 구성성분을 알아보고 이를 분해하는 목질 분해효소에 대한 탐색 ○ 버섯 종류에 따른 리그닌분해효소 활성도 분석

○ 5가지 톱밥 선정 및 버섯 균주 접종, 발생하는 당의 양과 에탄올의 양 분석

○ 가장 효율이 높은 3가지 균주 선발 및 HPLC를 이용하여 에탄올의 발생량 정밀 분석

2. 연구 수행 내용

□ 이론적 배경 및 선행 연구 ○ 버섯의 생장, 생식과정 조사

균류는 진균(true fungi)과 균류 유사체(fungus-like organisms) 등 엽록 체가 없어 타급 영양을 하고, 대부분 실 모양이며, 주로 포자로 번식하는 진핵 상태의 작은 생물체를 총칭한다. 좁은 의미로는 세포벽에 키틴을 가 지고 있는 진균만을 말한다.

다양한 진균들 중 여러 면에서 사람에게 영향을 미치는 균은 담자균류 이다. 담자균류의 대부분은 부생생물로 식물의 잔해, 특히 cellulose와 리 그닌을 분해한다. 토양에 사는 전형적인 담자균류의 생활사는 담자포자가 싹이 터서 단핵의 균사체를 형성한다. 균사체는 생장하여 토양 전체에 퍼 진다. 단단한 균사덩어리는 단추를 형성하고 단추가 토양을 뚫고 올라와 토양 위로 길게 자라 모자 모양의 갓을 형성한다. 갓에는 접시 모양의 주 름이 많이 있으며 각 주름은 담자기로 덮여있다.

○ PCR 분석법과 RAPD 분석법 - PCR 분석법

PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소연쇄반응)은 DNA의 특정부위 를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA서열을 증폭시키 는 방법으로서 아주 적은 양의 DNA로도 많은 양의 DNA 합성이 가능하 므로 생물학에 있어서는 획기적인 발명이라고 할 수 있다. 이렇게 PCR을 이용하면 DNA의 특정한 부위를 1~2시간 내에 수백만배 이상 증폭시킬

수 있으며, 증폭된 DNA로 관련된 실험에 소요되는 시간과 노력을 줄일 수 있어 매우 편리하다.

PCR 반응과정은 크게 Denaturation, Annealing, Extension의 3단계로 구 분할 수 있다. 처음 첫번째 단계인 Denaturation 과정에서는 한가닥으로 결합되어있는 DNA가 두가닥으로 나뉘어지고, 그다음 Annealing 과정에서 는 나뉘어진 DNA에 상보적으로 결합할 수 있는 primer라고 불리는 짧은 염기가닥들이 붙게된다. 그후 DNA 중합효소인 Polymerase가 primer가 붙 은 위치에서부터 일정한 방향성을 가지고 DNA를 증폭시키게 된다.

균류에 존재하는 Ribosomal DNA는 3종류의 ribosome 영역(18S, 5.8S, 28S)로 구성되어 있고 각 영역사이에는 ITS(Internal Transcribed Spacer) region이라고 불리는 1차 전사시에는 존재하나 최종적으로 전사가 되지않 는 의미없는 서열들이 존재한다. 본 실험에서는 PCR 반응을 이용하여 18S rDNA와 5.8S rDNA 사이에 존재하는 ITS1 부위와 5.8S rDNA와 28S rDNA 사이에 존재하는 ITS2 부위, 그리고 가운데에 있는 5.8S rDNA 부위 까지를 증폭하였다. 이 과정에 의해 증폭되는 ribosomal DNA의 부위는 Fig. 1과 같이 18S rDNA의 일부분과 ITS1, 5.8S rDNA, ITS2의 전체, 그리고 28S rDNA의 일부분이다.

ITS1

→ ITS4 ←

18S ^ITS1 5.8S ^ITS2 28S

Fig. 1. 버섯 유전자의 rDNA 구조

- RAPD PCR

RAPD (random amplified polymorphic DNA) PCR은 일반적으로 두 생명 체가 계통 유전학적으로 얼마나 유사성이 있는가를 판별할 때 사용한다.

PCR할 때 primer가 짧을 경우 genome 상에 여러 군데 달라붙어서 여러 fragment를 만든다. 이렇게 해서 생겨난 여러 fragment를 전기영동을 사 용해서 확인하면 생명체마다 각각 독특한 band를 형성하는데 이것을 가 지고 생명체간의 유사성을 판별할 수 있다. 만약 두 생명체가 비슷한 종 일 경우에는 band의 모양이 비슷할 것이며, 그렇지 않을 경우에는 서로 많은 차이를 나타낼 것이다. 이 RAPD PCR은 방법이 비교적 간단하고 쉬 어 genome sequencing을 하기 전에 대략적인 종간의 관계를 나타내기 위 해서 많이 사용된다.

○ 논문 조사

‘느타리로부터 리그닌-셀룰로오스분해효소 생산 균주 선발 및 효소 생 산(하효철, 2012)’을 통해 리그닌-셀룰로오스를 분해하는 균은 백색부후 균이고 대표적으로 판막버섯이 있으며 최근에는 많은 백색부후균이 발견 되고 있다는 것을 알게 되었다. ‘합성배지에서 Stropharia rusosoannulata 가 생산하는 섬유소분해효소에 관한 연구(유관희 등, 1999)’를 통해 백색 부후균으로부터 발생하는 섬유소분해효소를 측정하는 방법에 대해 배울 수 있었고 버섯의 균주를 배양하는 배지의 약품 조성에 대해 알게 되어 배지 제작에 탄소원은 glucose, 질소원은 yeast extract, 무기양분은 KCl, MgSO₄, FeSO₄를 선택하게 되었다. ‘Trichoderma reesei_{를 이용한 섬유} 소 분해 효소의 생산에 있어서 혼합탄소원의 영향(남주현 등, 1998)’을 통해 셀룰로오스 분해효소는 첨가되는 포도당이 일정량 이상이 되면 감소 가 된다는 것을 알게 되었다.

□ 연구주제의 선정

○ 본 연구팀(팀명 : Bio-Logic)은 식물이 발생시키는 탄소유기물 중에는 목질 계의 cellulose가 대부분을 차지하지만 cellulose를 이용한 bio-ethanol 연구 는 다른 biomass(전분질계, 당질계 이용)에 비해 연구가 덜 진행되고 현재 기술력으로는 효율이 낮다는 것을 알게 되어 cellulose-biomass를 기반으로 한 bio-ethanol에 관심을 가짐.

○ 본 연구팀은 버섯이 나무에 자라며 cellulose를 분해하여 발생한 탄소원을 양분으로 사용하는 원리를 접목시켜 2012년부터 버섯을 참나무발효톱밥에 배양하고 효모로 발효시켜 bio-ethanol을 생산하는 연구를 진행했지만 에 탄올 발생량이 1~3%로 굉장히 낮게 나옴.

○ 버섯균사가 성장하는데 사용하는 탄소양분이 많아 산출되는 포도당과 ethanol 발생량이 적은 것으로 추측, 버섯균사를 bio-ethanol 생산에 이용하 기에는 효율성과 경제성, 기간이 너무 오래 걸려 대안이 필요.

○ 버섯의 섬유소분해효소 생성 유전자를 분석해서 플라스미드에 재조합하는 방법을 떠올리게 되었고 비슷한 연구가 있는지 조사 및 인천대학교 이태수 교수님을 방문하고 충남대학교 박희문 교수님께 이메일을 통해 자문을 구했고, 유전자 재조합 실험을 진행하기 위해서는 그보다 앞서서 버섯의 섬유소분해효소에 대한 활성도와 관련해서 기본이 되는 연구를 진행해야 한다고 생각.

○ 버섯의 종류에 따른 섬유소분해효소 활성도 측정연구에 대해 서울대학교 임영운 교수님께 이메일과 방문을 통해 자문을 구했고 「유전자원의 접근 및 이익공유(ABS: Access to genetic resources and Benefit Sharing)」로 해외에서 분양받을 수 있는 목재분해효소활성도가 높은 균사를 사용하기 보다는 한국 자생 버섯을 이용해 동정과정과 유전자를 분석해서 버섯의 종류를 확인하고 계통분류를 하는 실험이 필요하다는 것을 알게 됨.

○ 본 연구팀은 한국자생버섯균주를 직접 채집하고 아직 섬유소분해효소의 활성도 측정이 진행되지 않은 버섯균주를 분양받아 동정하고 유전자 분석 을 통해 계통수 분류를 진행한 다음, 섬유소분해효소 생성과 활성도를 확인, 공시균주보다 효율성이 높은 균주를 선발하여 미래에 균류이용연구 와 버섯유전자 재조합을 이용한 bio-ethanol 생산 연구에 도움이 되는 연구 를 진행하고자 함.

○ 그러던 중 톱밥에 버섯균사를 접종해서 bio-ethanol 생산할 때에 효모를 같이 첨가하여 배양하는 simul fermentation에 대해 이태수 교수님께서 가르쳐주셨고 새로운 6종의 버섯 균주를 분양받아 리그닌분해효소분석, 에탄올 발효 실험을 진행하기로 함.

□ 연구 방법

○ 연구 1. 버섯균주 유전자 분석을 통한 계통 분류 연구 - 6종의 버섯을 분양받아 계대 및 배양.

- 배양한 균주를 DNA sequencing하여 어떤 종류의 버섯인지 확인, 분석 및 계통분류.

○ 연구 2. 버섯의 리그닌분해효소 활성도 측정 연구

- 6가지 버섯균주를 naphthalene을 첨가한 액체배지에 배양, 리그닌분해효소 (3종류) 활성도를 UV-Visible spectrophotometer를 사용해 측정한다.

- 공시균주의 효소활성도를 측정하여 대조군으로 설정, 실험군을 대조군과 비교해 차이를 비교한다.

○ 연구 3. 목질을 이용한 당 발생량 연구

- YMG, pre-medium 순서대로 배양한 후 homogenizer를 이용해 균사 파쇄 - 2가지 목질이 첨가된 fermentation medium에 파쇄된 균사만 넣은 배지와

균사와 효모를 같이 첨가한 배지 제작

- 1, 2, 4, 6, 8, 10일째 발생하는 당의 양 분석

○ 연구 4. 목질을 이용한 에탄올 발생량 연구 - 연구 3과 같은 배지를 이용하여 진행

- 1, 2, 4, 6, 8, 10일째 발생하는 에탄올의 양 분석 - 가장 효율이 높은 균주 3종 선택

□ 연구 활동 및 과정 ○ 외부 전문가 자문

- 인천대학교 생명과학부 “버섯균주은행”에서 분양 받은 곰팡이의 일 종인 백색부후균의 실험을 위해서이들 균의 배양에 필요한 PDA와 YMG 및 pre-medium 등의 배지를 액체와 고체로 만드는법 지도.

- 분양 받은 백색부후균을 이미 조제한 PDA와 YMG 및 pre-medium 등 의 고체배지와 액체배지에서 배양하는 방법(온도, pH, 정치배양 또는 Shaking culture, Light 또는 Dark condition) 지도.

- 인천대학교 “버섯균주은행에서 분양받은 백색부후균의 이름이 정확 한지 맞는지 PCR( Polymerase Chain Reaction) 실험을 통해 분자 생 물학적으로 규명하는 방법을 지도.

- 실험에 사용하는 백색부후균이 리그닌과 셀룰로오스로 결합되어있는 여러 종류의 물질(5 종류의 톱밥, 부들, 미강 등)을 그들이 생산한 리 그닌 효소로 분해하는지에 대해 탐색방법을 분광광도계 (spectrophotometer)와 지시약을 이용해 분석하는 방법을 지도.

- 또한 공시된 백색부후균이 리그닌 분해효소에 의해 리그닌으로부터 분리된 셀룰로오스와 해미셀룰로오스를 분해하여 당화시킬 수 있는 cellulase 효소의 생산력 탐색 방법을 지시약을 이용해 지도.

- 선발된 백색부후균으로 여러 종류의 기질(5 종류의 톱밥, 부들, 미강 등)을 이용해 당화하여 yeast (Saccharomyces cerevisiae)를 이용해 에 탄올 생산이 가능한지 에탄올 발효 방법과 조건에 대한 지도.

- 백색부후균과 yeast(Saccharomyces cerevisiae)가 여러기질에서 발효를 통해 생산하는 에탄올의 양을 시간이 지남에 따라 정확하게 분석하기 위하여 HPLC(고속액체크로마토그래피)를 사용하는 방법 등을 지도.

- 에탄올발효가 종료되면 실험결과를 종합적으로 분석하는 방법 지도

○ 연구 일정

내용 시기(월)

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

주제선정 선행연구 분석 및

탐구계획 수립 외부전문가

자문 요청 자료 수집 버섯 분양 및 배양 유전자 분석 및 계통분류 실험

목재분해효소 활성도 측정 에탄올 발효실험

결과정리 결과보고서 작성

발표준비

2014 STEAM R&E 페스티벌 참가

○ 연구비 사용내역

예산계정 계획 집행예산 증감

연구장비및재료비

연구활동비

연구과제추진비

연구수당

총 계 0 0 -871

○ 연구 1. 버섯균주 유전자 분석을 통한 계통 분류 연구

실험에 사용한 버섯균주는 인천대학교 생물학과 응용미생물학연구실에 있는 "버섯균주 및 DNA은행"에서 분양 받아 사용하였으며, -80℃에 보관 중인 버섯균주를 신속하게 해동시켜 Potato Dextrose Agar (PDA) 배지에 접종하여 1주일 배양하였다. 이외에 NCBI GenBank에 rDNA의 ITS 영역의 염기서열 정보가 등록되어있는 6종의 버섯 균주의 정보를 내려 받아 본 실 험의 분석결과와 통합하여 계통도를 작성하였다. 실험에 사용한 균주의 내 용은 Table. 1.에 요약하였다.

Scientific name Local name Strain Origin Trametes pubescens 흰융털구름버섯 IUM0142 Korea (Kyonggi-do) Flammulina velutips (wild) 팽이(야생) IUM5207 Korea (Incheon)

Irpex lacteus 기계층버섯 IUM5379 Korea (Kyonggi-do)

Flammulina velutips (cultivated) 팽이(재배종) IUM2809 Korea, (Seoul) Perreniporia fraxinea 아까시재목버섯 IUM5422 Korea (Kyonggi-do)

Irpex consors 송곳니구름버섯 IUM5384 Korea (Kyouggi-do)

Table. 1. The mushroom species used in this study

- 가. 균사체 배양

분양받은 버섯균주는 Potato Dextrose Agar(PDA) 배지에 옮겨 1-2회 계 대배양하여 순수한 균사를 얻었다. 또한 배양된 균사들은 현미경상에서 담 자균 2차 균사의 특징인 꺽쇄결합(clamp connection)을 확인한 후 실험에 사용하였다.

Fig. 2. 꺽쇄결합

- 나. Total DNA 추출

순수분리된 plate상의 균사들을 5mm cork borer로 조각내어 액체배지인 Potato Dextrose Broth (PDB) 배지에 100 ㎖당 5조각씩 접종하고 120 rpm 의 회전으로 25℃에서 10일간 배양하였다. 또한 액체배양된 균사들은 동 결건조(freezing dry)하여 막자와 막자사발로 곱게 마쇄하였다. 이때 액체질 소를 사용하여 급속냉동된 상태에서 마쇄하여 샘플이 용해되는 것을 방지 하였다. 1.5 ㎖ micro tube에 마쇄된 균사 500 ㎎와 500 ㎕의 protein lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM EDTA (pH 8.0), 1% sarkosyl)를 첨가하여 강하게 섞어준 후 65℃에서 1시간 가량 반응시켰다. 반응 후에 는 500 ㎕의 P.C.I (Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol, 25 : 24 : 1)를 첨 가하여 섞어준 후 실온에서 30분 가량 정치하고 12,000rpm으로 4℃에서 10 분간 원심분리하였다. 원심분리한 후 상등액만 취하여 새로운 tube로 옮기 고 500㎕의 에탄올을 넣어 4℃에서 5분 동안 12,000 rpm으로 원심분리 하 여 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA를 제외한 나머지 용액은 제거하고 500

㎕의 70% 에탄올을 넣어 12,000 rpm, 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 응집

된 DNA를 세척하였다. 그후 tube내의 에탄올을 제거한 후 순수한 DNA pellet에 멸균수를 넣고 DNA를 녹이고, spectrophotometer를 사용하여 260

㎚와 280 ㎚에서의 흡광도를 측정하여 순도와 양을 계산하고 Total DNA 로써 실험에 사용하고 남은 DNA는 –20℃에 보관하였다.

- 다. rDNA의 ITS영역 증폭

추출된 각 DNA들의 ITS region 증폭을 위하여 White 등(1990)에 의해 보 고된 곰팡이류의 일반적으로 효모류의 곰팡이류에서 많이 사용되는 ITS region 증폭용 primer set을 이용하였으며 ITS1(forward)와 ITS4(reverse)로 Table. 2.와 같다.

Primer Direction Sequence (5'-3') Length

ITS1 forward TCC GTA GGT GAA CCT GCG C 19mer ITS4 reverse TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 20mer Table. 2. Primer design for PCR amplification of ITS region used in this study

PCR(중합효소연쇄반응)은 BIONEER사의 Taq polymerase kit을 사용하였 으며 tube 당 반응액의 부피가 20㎕가 되도록 각 첨가물의 양을 조절하였 다. 14.2 ㎕의 3차 멸균수; 2 ㎕의 10X PCR buffer (100 mM Tris-HCl, 1.5 mM MgCl2, 500 mM KCl, pH 8.3); 1.6 ㎕의 dNTPs (0.2 mM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 0.5 ㎕ (50 pmol/㎕)의 ITS1 primer; 0.5 ㎕ (50 pmol/㎕)의 ITS4 primer; 0.2 ㎕의 Taq DNA polymerase (5U/㎕, Bioneer, Korea); 1 ㎕의 DNA 희석액 (100 ㎍/㎕)을 섞어주었다. PCR반응은 96℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension 순 으로 30 cycle의 조건으로 실시하였다.

- 라. Sequencing (염기서열 결정)

PCR이 끝난후 생성된 PCR product를 염기서열을 밝혀내기 위하여 시퀀 싱 전문회사에 의뢰하였다. 본 실험의 경우 대전에 소재한 SOLGENT사에 염기서열분석을 의뢰하였으며 밝혀진 염기서열과 기타 data를 Email로 전 달받아 실험에 사용하였다. 이때 sequencing 과정에서 염기가 제대로 밝혀 지지 않은 부분의 보완을 위해 모든 sequence들을 수작업으로 보정하였 으며 밝혀진 sequence들은 유전자은행인 NCBI(National Center for Biotechnology Information) website(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 기존에

등록되어있는 버섯들의 ITS region sequence들과 상동성을 비교하여 PCR 증폭의 성공여부를 확인하였다.

- 마. DNA 염기서열 및 유연관계 분석

컴퓨터 상에서 기존에 NCBI에 등록되어있는 버섯들의 ITS region sequence들을 토대로, ITS1 primer binding site(18S rDNA partial sequence) 와 ITS1 region , 5.8S rDNA, ITS2 region, ITS4 primer binding site(28S rDNA partial sequence) 의 5부분으로 20개의 sequence들을 정리하였다. 또 한 신뢰성 있는 자료를 만들기 위하여 이미 ITS 영역의 염기서열의 분석이 끝난 6개의 균주 외에 NCBI의 GenBank로부터 ITS영역의 염기서열 정보가 등록되어 있는 맛비늘버섯 (중국), 땅비늘버섯 (캐나다) 등 6균주의 정보를 받아 총 12개의 균주를 대상으로 분석을 하였다. 그 후 정리된 sequence들 을 하나의 text file로 병합하여 염기서열 전문분석 프로그램인 Clustal X로 정렬(alignment)시켰다. 이렇게 정렬된 sequence들을 또다른 분석프로그램 인 PAUP 4.0으로 옮겨서 분석한 후 계통도를 작성하였다. 본 연구에서 사 용된 분석방법은 근린산술결합법(Neighbor-Joining method)로서 최근 유연 관계 분석에 가장 많이 사용되고 있다. 또한 이 방법에 bootstrapping을 병 행하여 1000회를 반복 분석하였다. 이렇게 얻은 결과로 1000번의 결과 중 50%이상의 유의성이 있는 결과만을 추려 한가지의 계통도로 작성하였다.

○ 연구 2. 버섯의 리그닌분해효소 활성도 측정 연구 - 가. 균주 및 배양

본 실험에 사용된 5종 6점의 균주는 PDA 배지(Potato dextrose broth 24.4g, Agar 15g, DW 1,000 ml)에서 7일간 25℃의 배양기에서 암배양하 여 균사가 배지의 70% 정도를 덮었을 때 가장자리에 있는 균사를 사용하 였다.

- 나. PDB 액체배지에 배양

배양한 균사를 200ml의 PDB 액체배지(Potato dextrose broth 24.4g, DW 1,000ml)에 cork borer를 이용해 직경 5mm의 균사체 disc 10개를 접종하여 25℃에서 shaking incubator에서 10일간 배양하였다.

Fig. 3. PDB 균사 배양

- 다. PDB + N 액체배지에서 리그닌 분해효소의 생산

나프탈렌이 첨가된 액체배지에서 공시된 백색부후균이 생성하는 리그닌 분해효소의 양을 측정하기 위해 250 ml 용량의 삼각플라스크에 1%의 naphthalene이 첨가된 PDB 액체배지(Potato dextrose broth 24.4g, DW 1,000ml) 100 ml를 살균하여 배지(PDB+N)를 제작하고, PDB 배지에서 배양 한 균사를 homogenizer를 이용해 균사를 파쇄하여 제작한 PDB+N에 파쇄 한 균사액을 25mL 첨가하고 25℃에서 10일간 배양하였다. 배양이 끝난 배 양액은 centrifuge를 이용해 배양액과 균사체를 분리하여 상등액만 추출하 였다. 추출한 배양액은 4℃의 냉장고에 보관하면서 리그닌 분해효소의 종 류와 양의 분석에 사용하였다.

- 라. Laccase의 활성 측정

Laccase의 활성은 Bourbounnais et al.(1995)의 실험방법에 따라 수행하였 다. 이 방법은 기질인 ABTS¹⁾를 5 mM의 농도에서 산화하는 것에 기초를 두고 있다. 즉, 기질을 2.4 ml의 sodium acetate buffer(0.1 M, pH 5.0)에 녹 인 후 여과한 배양액 100 ml를 첨가해 30℃에서 2분간 반응 후 420 nm에 서 흡광도를 측정하였다. 효소의 활성단위는 기질이 산화하는 양(umole)을 1 unit으로 정의하였다.

- 마. Lignin peroxidase의 활성 측정

Lignin peroxidase(LiP)의 활성 측정은 Tien과 Kirk(1983)의 실험 방법을 따랐는데 이 방법은 veratryl alcohol이 veratryl aldehyde로 산화되는 것에 기초를 두고 있다. 50 mM sodium tartrate buffer (pH 5) 2.2 ml에 2 mM의 veratryl alcohol 40 μl를 넣고 각각의 백색부후균 균사체의 배양 여과액

1) ABTS(2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid))

240 μl를 섞은 후 0.2 mM의 HO_를 20 μl 첨가하여 25℃에서 반응시킨 후 곧 바로 310 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 효소의 활성단위는 veratryl alcohol로부터 분(min)당 생성되는 veratryl aldehyde의 양(umole)을 1 unit으로 정의하였다.

- 바. Manganese peroxidase의 활성 측정

Manganese peroxidase(MnP)의 활성 측정은 Glenn과 Gold(1985)의 실험방 법을 따랐는데 이 방법은 Mn(II)가 Mn(III)로 산화되는 것에 기초를 둔 것으 로 0.1M의 sodium succinate buffer 2.5 ml에 0.01%의 phenol red와 0.1 mM 의 MnSO를 기질로 사용하는 것이다. 2.5 ml의 기질과 200μl의 배양 여과 액을 반응혼합물로 준비한 후 0.1 mM의 HO_를 첨가해 30℃에서 2분간 반응시킨 후 5 M의 NaOH 첨가해 반응을 중지시키고 610 nm에서 흡광도 의변화를 측정하였다. 효소의 활성단위는 Mn(II)로부터 분(min)당 Mn(III)로 산화되는 양(umole)을 1 unit으로 정의하였다.

○ 연구 3. 목질을 이용한 당 발생량 연구

- 가. YMG(Yeast extract Malt extract Glucose)배지 제작 및 균사 배양 균사를 생산하기 위한 고체배지를 제작하였다. 아래 Table. 3. 에 있는 약품들 을 넣고 autoclave로 살균하여 clean bench에서 petri-dish에 눈금만큼 넣어 굳혔다. 배지가 완전히 굳은 다음 PDA에서 성장한 균사를 YMG 배지에 접종하여 25℃에서 7일간 암배양하였다.

배지 조성(pH 5.8)

약품명 농도(%)

yeast extract 0.3

malt extract 0.3

glucose 1

poly peptone 0.3

Agar 1.5

Table. 3. YMG 배지 조성

- 나. pre-medium 제작 및 배양

fermentation medium에 배양하기 전에 균사를 액화시켜주기 위해 아래 Table 4와 같은 약품을 넣고 pre-medium 액체배지를 제작하여 autoclave로 살균하였 다. 살균된 배지에 YMG에서 성장한 균사를 cork borer를 이용해 직경 5mm의 균사체 disc 10개를 접종하여 25℃ shaking incubator에서 배양하였다. 10일간

배양한 후 homogenizer를 이용해 균사를 파쇄하였다.

Fig. 4. homogenizer를 이용한 균사 파쇄

배지 조성(pH 5.8)

약품명 농도(%)

yeast extract 0.3

malt extract 0.3

glucose 1

peptone 0.3

K_HPO_ 0.1

MgSO_ 0.01

Table. 4 pre-medium 조성

- 다. 톱밥 분쇄 및 fermentation medium 제작

믹서기를 이용해 5가지 종류의 톱밥(Table. 6)을 모두 분쇄하고 2가지(1mm, 0.5mm 크기)의 거름망으로 걸러 0.5mm이하의 가루만을 사용하였다. 분쇄된 가루를 carbon source로 하여 Table. 5의 조성대로 배지를 제작하여 250ml 삼각플 라스크에 100ml씩 담아서 살균하였다.

배지 조성(pH 5.8)

약품명 농도(%)

yeast extract 0.3

malt extract 0.3

carbon source(제작한 톱밥) 2

peptone 0.3

K_HPO_ 0.1

MgSO_ 0.01

Table. 5 fermentation medium 배지 조성

사용한 목질

한국이름 영어 이름 한국이름 영어 이름

포플러 Poplar sawdust 밀기울 wheat bran

참나무 Oak sawdust 쌀기울 rice bran

부들 Typha orientalis Table. 6 사용한 톱밥 종류

- 라. fermentation medium에 파쇄된 균사만 넣은 배지와 균사와 효모를 같이 배양

fermentation medium에 파쇄한 버섯 균사를 40ml 첨가하고 각 버섯마다 절반 의 배지만 효모 1g을 첨가하고 25℃ shaking incubator에서 배양하였다.

- 마. 1, 2, 4, 6, 8, 10일째 발생하는 당의 양 분석

1, 2, 4, 6, 8, 10일째마다 clean bench에서 syringe needle을 flask 마개에 가운데 에 꽂아 배양액을 5ml씩 추출하여 –20℃에 보관하여 사용하였다. 배양액을 centrifuge를 이용해 상층액만 걸러낸 다음 당 분석을 위해 tube에 1ml씩 옮겨 담고 0, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75g/L 농도의 glucose 수용액을 standard로 설정하여 tube에 1ml씩 담는다. 제조된 DNS solution을 3ml씩 첨가하여 95℃에서 5분간 반응시키고 spectrophotometer를 이용해 540nm에서 흡광도를 측정한다.

glucose 수용액의 농도와 흡광도 값을 각각 x축과 y축으로 설정하여 standard 그래프를 작성하고 추출물에서 발생한 당의 양을 계산하여 평균값을 구한다.

당 발생량 standard 그래프는 실험마다 농도별로 흡광도를 측정하여 작성하였다.

Fig. 5. fermentation medium 균사 접종 Fig. 6. 배양액추출 및 시약반응 후 흡광도 측정

○ 연구 4. 목질을 이용한 에탄올 발생량 연구 - 가. 연구 3과 같은 배지를 이용하여 진행

- 나. 1, 2, 4, 6, 8, 10일째 발생하는 에탄올의 양 분석

실험에 사용한 배양액은 실험3과 동일하며 syringe needle을 이용해 추출한 배양액 1ml와 1M 농도의 CrO 수용액 5ml를 상온에서 30분간 반응시켜 spectrophotometer를 이용해 600nm에서 흡광도를 측정한다. 알코올 정량 분석

의 경우 standard가 거의 일정하기 때문에 이미 작성된 그래프(y=0.7066x+0.0633, R^=0.9999)를 참고하였고 그래프를 이용해 발생한 에탄올의 양을 계산하여 평균 값을 구했다.

3. 연구 결과 및 시사점 □ 연구 결과

○ 연구 1. 버섯균주 유전자 분석을 통한 계통 분류 연구

Strain Name Nucleotide distribution Sequence information

A C G T G+C(%) A+T(%) ITS1 5.8S ITS2 Length(bp) IUM 0142 흰융털구름버섯

Trametes pubescns 173 139 130 187 42.8 57.2 233 159 203 629 IUM 5207 팽이버섯

Flammulina velutipes

(wild) 144 128 130 204 42.6 57.4 235 159 208 606

IUM 5379 기계층버섯

Irpex lacteus 132 118 125 208 41.7 58.3 245 158 208 583 IUM 2809 팽이버섯

Flammulina velutipes

(cultivated) 145 128 130 203 42.6 57.4 246 159 208 606

IUM 5422 아까시재목버섯

Perreniporia fraxinea 127 145 135 162 49.4 50.6 237 158 214 571 IUM 5384 송곳니구름버섯

Irpex consors 136 149 128 159 48.6 51.4 237 158 214 574 Table. 7. 염기서열 분포, 6종 버섯의 rDNA ITS1, 5.8S, ITS2의 뉴클레오티드 분석 결과

Fig. 7. ITS 염기서열 분석결과와 NCBI genebank를 통한 버섯의 계통수 분류

유전자 분석결과 rDNA의 뉴클레오티드의 염기비율은 Table. 7.과 같이 나타 났으며 같은 종의 팽이버섯은 비슷한 비율이 나타나는 것을 확인할 수 있었으며 종마다 rDNA의 길이(bp)가 다르다는 것을 확인할 수 있었다. 염기서열을 분석 하여 검색한 결과 정확한 종인지 확인하여 Fig. 7과 같이 계통수를 작성하였다.

처음 연구를 시작할 때 총 9가지의 버섯을 사용하였으나 3종의 버섯이 성장속도

가 매우 느려서 나중 실험에서는 제외되었다.

○ 연구 2. 버섯의 리그닌분해효소 활성도 측정 연구

Fig. 8. 리그닌 분해효소 활성도

- 가. Laccase의 활성

공시된 6점의 백색부후균 균사체를 나프탈렌이 1% 첨가된 액체배지에서 각각 10일 간 배양하여 여과한 배양액의 laccase(Lac)활성을 조사하였다.

가장 많은 Lac을 생산한 균은 팽이(야생), 흰융털구름버섯이었고 그 다음으 로 팽이(재배종)와 송곳니구름버섯과 기계층버섯, 아까시재목버섯 순으로 나타났다(Table 8). 팽이버섯은 Lac을 0.12 Uml−1생산하였고 가장 생산 량이 낮았던 아까시재목버섯은 0.06 Uml−1 이었다.

- 나. Lignin peroxidase의 활성

백색부후균의 lignin peroxidase(LiP) 생산량을 측정한 결과 가장 많은 LiP 를 생산한 버섯은 흰융털구름버섯이었으며 다음으로 팽이(야생), 송곳니구

Mushrooms Emzyme concentration (U/mL)

Laccase LiP MnP

흰융털구름버섯

T.pubescens ^{0.12 0.1 0.09}

F.velutipes(W)팽이버섯 ^{0.12 0.08 0.09}

기계층버섯

I.lacteus ^{0.07 0.05 0.04}

F.velutipes팽이버섯(C) 0.11 0.07 0.09

아까시재목버섯

P.fraxinea ^{0.06 0.05 0.05}

송곳니구름버섯

I.consors ^{0.11 0.08 0.04}

Table 8. 리그닌분해효소 활성도

름버섯, 팽이(재배종), 기계층버섯, 아까시재목버섯 순으로 낮아졌다 (Table. 8). LiP 효소의 생산량은 흰융털구름버섯이 0.1 Uml−1로 가장 높았으며 기계층버섯과 아까시재목버섯이 0.05 Uml−1로 가장 낮았다.

- 다. Manganese peroxidase의 활성

생산된 manganese peroxidase (MnP)의 양을 측정한 결과 가장 많은 MnP 를 생산한 균은 팽이(야생), 팽이(재배종), 흰융털구름버섯이였으며 아까시 재목, 송곳니구름버섯, 기계층버섯 순서로 낮아졌다. 팽이(W, C)와 흰융털 구름버섯은 0.09 Uml−1 이었으며 송곳니구름버섯과 기계층버섯은 0.04 Uml−1로 가장 낮았다. 따라서 본 실험을 통해 공시된 대부분의 버섯은 리 그닌을 분해하는 능력을 지닌 것으로 나타나 에탄올 발효에 필요한 리그닌 셀룰로오스의 분해가 가능한 것으로 나타났다.

○ 연구 3. 목질을 이용한 당 발생량 연구 - 가. 포플러 톱밥을 이용한 당 발생량 연구

1 2 4 6 8 10

흰융털구름버섯 0.1 0.13 0.16 0.19 0.19 0.19

팽이버섯(w) 0.09 0.18 0.19 0.23 0.23 0.23

기계층버섯 0.09 0.14 0.16 0.19 0.2 0.21

팽이버섯(c) 0.15 0.25 0.29 0.32 0.33 0.29

아까시재목버섯 0.25 0.84 0.9 0.91 0.88 0.85

송곳니구름버섯 0.21 0.25 0.34 0.34 0.31 0.32

Table. 9. Poplar에 버섯 접종 후 당 발생량 변화 (g/L)

Fig. 9. Poplar에 버섯 접종 후 당 발생량 변화

popular sawdust에 버섯만 배양하였을 때 시간이 지날수록 전체적으로 당의 양도 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 4~6일째에 가장 많은 양의 당을 확인할 수 있었고 그 이후로는 거의 비슷하다는 것을 알 수 있었다. 이것을 통해 균사가 1~4일까지는 목질을 지속적으로 분해하다가 일정 수준 이상의 당이 발생하고 나서는 목질을 분해하는 양이 감소하여 균사가 사용하는 당의 양과 목질을 분해하는 양이 균형을 이룬다고 생각할 수 있었다. 당의 발생량은 6일째 를 기준으로 아까시재목버섯, 송곳니구름버섯, 팽이버섯(c), 팽이버섯(w), 흰융

털구름버섯, 기계층버섯 순서로 많이 발생한 것을 확인할 수 있었다.

1 2 4 6 8 10

흰융털구름버섯 0.1 0.13 0.13 0.15 0.12 0.1

팽이버섯(w) 0.07 0.08 0.13 0.16 0.16 0.14

기계층버섯 0.08 0.1 0.12 0.13 0.1 0.11

팽이버섯(c) 0.14 0.22 0.25 0.22 0.17 0.17

아까시재목버섯 0.19 0.31 0.35 0.21 0.17 0.15

송곳니구름버섯 0.1 0.19 0.22 0.23 0.21 0.16

Table. 10. Poplar sawdust+Yeast에 버섯 접종 후 당 발생량 변화 (g/L)

Fig. 10. Poplar sawdust+Yeast에 버섯 접종 후 당 발생량 변화

당의 발생량은 yeast를 첨가하지 않았을 때보다 적었으며, 4~6일째까지 꾸준하 게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 6일째와 8일째를 넘기면서 당의 발생량이 감소하는 것을 확인할 수 있었고 이것을 통해 발생한 당이 yeast에 의해 ethanol로 발효된 것이라고 추측할 수 있었다. 발생한 당의 양은 4일째를 기준으로 아까시재목버섯, 팽이버섯(c), 송곳니구름버섯, 흰융털구름버섯, 팽이 버섯(w), 기계층버섯 순서로 많았다.

- 나. 참나무 톱밥을 이용한 당 발생량 연구

1 2 4 6 8 10

흰융털구름버섯 0.16 0.22 0.23 0.23 0.31 0.34

팽이버섯(w) 0.11 0.25 0.32 0.36 0.37 0.37

기계층버섯 0.16 0.23 0.28 0.3 0.32 0.32

팽이버섯(c) 0.17 0.28 0.31 0.3 0.33 0.33

아까시재목버섯 0.31 0.84 0.85 1.08 1.11 1.08

송곳니구름버섯 0.03 0.55 0.56 0.55 0.59 0.58

Table. 11. Oak sawdust에 버섯 접종 후 당 발생량 변화 (g/L)

Fig. 11. Oak sawdust에 버섯 접종 후 당 발생량 변화

당의 발생량은 2일째를 지나면서 아까시재목버섯을 제외하고는 2일당 0.02 정도로 매우 적게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 참나무 톱밥의 경우 미루나무 톱밥보다 발생한 당의 양은 많은 편이였다. 당의 발생량 순서는 4일째를 기준으 로 아까시재목버섯, 송곳니구름버섯, 팽이버섯(w), 팽이버섯(c), 기계층버섯, 흰 융털구름버섯으로 많았다.

1 2 4 6 8 10

흰융털구름버섯 0.1 0.17 0.17 0.15 0.12 0.07

팽이버섯(w) 0.1 0.19 0.16 0.12 0.08 0.1

기계층버섯 0.1 0.17 0.14 0.14 0.13 0.14

팽이버섯(c) 0.14 0.27 0.2 0.11 0.15 0.1

아까시재목버섯 0.1 0.17 0.17 0.13 0.14 0.13

송곳니구름버섯 0.07 0.16 0.1 0.06 0.05 0.07

Table. 12. Oak sawdust+Yeast에 버섯 접종 후 당 발생량 변화 (g/L)

Fig. 12. Oak sawdust+Yeast에 버섯 접종 후 당 발생량 변화

당 발생량은 2일째 가장 높았으며 시간이 지날수록 점점 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 발생한 당이 yeast에 의해 발효된 것으로 추측할 수 있었다.

당 발생량은 2일째를 기준으로 팽이버섯(c), 팽이버섯(w), 흰융털구름버섯, 기계 층버섯, 아까시재목버섯, 송곳니구름버섯 순서로 많았다.

○ 연구 4. 목질을 이용한 에탄올 발생량 연구 - 가. 포플러 톱밥을 이용한 ethanol 발생량 연구

1 2 4 6 8 10

흰융털구름버섯 0.35 0.48 0.48 0.46 0.45 0.46

팽이버섯(w) 0.3 0.4 0.38 0.36 0.36 0.34

기계층버섯 0.25 0.32 0.32 0.31 0.34 0.25

팽이버섯(c) 0.37 0.43 0.43 0.5 0.55 0.48

아까시재목버섯 0.26 0.4 0.36 0.34 0.31 0.31

송곳니구름버섯 0.22 0.42 0.54 0.52 0.55 0.47

Table. 13. Poplar sawdust에 버섯 접종 후 ethanol 발생량 변화 (%)

Fig. 13. Poplar sawdust에 버섯 접종 후 ethanol 발생량 변화

Yeast를 첨가하지 않았음에도 에탄올이 약 0.3~0.4%정도 발생하는 것을 확인 할 수 있었는데 실제로 버섯이 목질을 분해하면서 에탄올도 발생시킨다는 연구 가 있다. 에탄올의 발생량은 큰 차이가 없어서 순서를 정하지는 않았다.

1 2 4 6 8 10

흰융털구름버섯 0.4 0.59 0.82 0.9 0.75 0.64

팽이버섯(w) 0.3 0.88 1.17 0.87 0.81 0.73

기계층버섯 0.43 0.79 0.94 1.08 0.94 0.88

팽이버섯(c) 0.48 0.8 1.02 1.07 1.01 0.98

아까시재목버섯 0.32 2.18 2.43 2.36 2.29 1.95

송곳니구름버섯 0.52 0.83 1.09 1.02 0.98 0.88

Table. 14. Poplar sawdust+Yeast에 버섯 접종 후 ethanol 발생량 변화 (%)

Fig. 14. Poplar sawdust+Yeast에 버섯 접종 후 ethanol 발생량 변화

에탄올의 발생량은 4~6일째 가장 많은 양이 발생한다는 것을 확인할 수 있었 다. 6일이후로는 에탄올의 양이 거의 변화가 없거나 오히려 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 에탄올 발생량은 4일째를 기준으로 아까시재목버섯, 팽이버섯(w), 송곳니구름버섯, 팽이버섯(c), 기계층버섯, 흰융털구름버섯 순서로 많았다.

- 나. 참나무 톱밥을 이용한 ethanol 발생량 연구

1 2 4 6 8 10

흰융털구름버섯 0.23 0.49 0.51 0.54 0.57 0.57

팽이버섯(w) 0.4 0.59 0.55 0.55 0.55 0.48

기계층버섯 0.38 0.67 0.54 0.55 0.49 0.5

팽이버섯(c) 0.48 0.43 0.44 0.45 0.55 0.47

아까시재목버섯 0.38 0.53 0.54 0.48 0.5 0.51

송곳니구름버섯 0.35 0.54 0.5 0.5 0.51 0.5

Table. 15. Oak sawdust에 버섯 접종 후 ethanol 발생량 변화 (%)

Fig. 15. Oak sawdust에 버섯 접종 후 ethanol 발생량 변화

popular sawdust와 마찬가지로 yeast를 첨가하지 않았음에도 소량의 ethanol이 발생한 것을 확인할 수 있었다. 큰 차이가 없었으므로 에탄올의 발생량 순서를 정하지는 않았다.

1 2 4 6 8 10

흰융털구름버섯 0.31 0.58 0.98 1.02 0.88 0.83

팽이버섯(w) 0.49 0.71 1.03 1.05 0.97 0.88

기계층버섯 0.6 0.48 0.76 0.83 0.72 0.71

팽이버섯(c) 0.64 0.86 0.88 0.95 0.96 0.84

아까시재목버섯 0.93 2.18 2.35 2.43 2.25 2.11

송곳니구름버섯 0.97 1.86 1.96 2.13 2.07 1.99

Table. 16. Oak sawdust+Yeast에 버섯 접종 후 ethanol 발생량 변화

Fig. 16. Oak sawdust+Yeast에 버섯 접종 후 ethanol 발생량 변화

popular sawdust와 마찬가지로 4~6일째 가장 많은 양의 에탄올이 발생하는 것을 확인할 수 있었고 6일째 이후로는 약간 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

에탄올 발생량 순서는 6일째를 기준으로 아까시재목버섯, 송곳니구름버섯, 팽이 버섯(w), 흰융털구름버섯, 팽이버섯(c), 기계층버섯이였다.

□ 결론 및 시사점

○ 현재 Oak sawdust와 Poplar sawdust에 6종의 버섯을 접종하여 당 발생량 과 yeast첨가시 에탄올 발생량의 측정도 완료. 또한 Rice bran과 Wheat bran에서 흰융털구름버섯, 아까시재목버섯, 팽이버섯(C), 기계층버섯을 이용한 당과 에탄올 발생량 실험도 완료되었으나 나머지 두 종의 버섯이 진행중이기에 보고서에 담지는 않았음. 현재까지 진행된 실험결과로는 아까시재목버섯이 가장 많은 양의 당이 발생하는 것을 확인. 실험 중 가장

인상적인 것은 다른 버섯 균사를 배양한 것은 2배 혹은 3배를 희석하면 묽어진 상태에서 측정을 할 수 있었는데 아까시재목버섯은 4배를 희석하여 흡광도를 측정하려해보아도 빛의 투과율이 0.1% 이하여서 흡광도 최고값 이 나오기에 그 이상의 배수로 희석을 해야 측정이 가능.

○ 버섯을 이용한 Bio-ethanol 은 폐목재 등을 신재생에너지로 만들어 내는 것으로, 화석연료 사용에 따른 환경오염 문제와 사탕수수 등을 이용한 Bio-ethanol이 수반하는 식량자원 감축 및 고비용 문제에서 벗어 날 수 있는 친환경적이고 경제성 있는 연구가 될 것으로 보임.

○ 목재분해효소 활성도가 높은 한국 자생 버섯 균주를 선별함으로써 국내 균류관련 연구에 필요한 ABS제도에 제한되지 않는 버섯 균주의 공급과 선별연구에 많은 영향을 미칠 것으로 보임.

○ 연구 과정을 통해 참여 학생들의 자기 주도적 학습능력 및 문제해결력이 향상되었고, 자신감을 심어줄 수 있어 과학인재 육성의 밑거름이 될 것이라 고 생각됨.

○ 지도 교사는 전문가와의 대화와 협의 과정을 통하여 해당교과의 전문성 신장은 물론, 관련 학문에도 관심을 가질 수 있는 기회를 갖게 되었으며, 이 팀에 참여하는 학생뿐만 아니라 다른 일반 학생들에게도 좋은 모습의 교사로서 자신감 있는 지도를 할 수 있음.

○ 참여 학생과 지도 교사에게 다양한 교과에 대한 통합적 이해의 중요성 을 일깨워주고 STEAM의 효율적 운영에 관한 계기를 제공해 줌으로써, 창의적 탐구력 향상에 큰 도움이 됨.

4. 홍보 및 사후 활용 □ 사후 활용 계획

○ 2014학년도 명덕과학논문집 수록(2014.12월) ○ 삼성휴먼테크논문대상 참가(2014.12월)

○ 미래교육연구소 청소년논문집 ‘발상의 전환’논문 개제(2015.1월) ○ 한국버섯학회 논문게재(2015.1월)

○ 2015 명덕 영어 저널지‘The Pathfinder’수록(2015.6)

○ ‘버섯 유전체를 이용한 섬유소분해효소 생산 균 생산 연구’에 응용(유전 자재조합 이용)(2016년~)

5. 참고문헌 □ 참고자료

○ 곰팡이와 버섯(학생과학문고편찬회), 2009, HomeBook ○ 버섯학(성재모 외), 1998, 교학사

○ 신재생에너지 2판(윤천석), 2013, 인피니티북스 ○ 사이언스올 http://www.scienceall.com/dictionary/

○ 네이버 백과사전

○ Detection of Cellulolytic Activity in Ophiostoma and Leptographium species by Chromogenic Reaction(현민우 외), 2006

○ 합성배지에서 Stropharia rugosoannulata가 생산하는 섬유소분해 효소에 관한 연구(Studies on the Cellulolytic Enzymes Produced by Stropharia rugosoannulata in Synthetic Medium)(유관희 외), 1999

○ Trichoderma reesei를 이용한 섬유소 분해 효소의 생산에 있어서 혼합탄소원의 영향(Effects of Mixed Carbon Sources on the Production of Cellulose by Trichoderma reesei)(남주현 외), 1998

○ Comparison of Dyes for east Detection of Extra cellular Cellulases in Fungi(윤지환 외), 2007

○ Roseofomes subflexibilis로부터 Cellulase 생산을 위한 배양학적성질(Studies on the Cultural Characteristics of Cellulase Production by Roseofomes subflexibilis)(장형수), 2003

○ Plate screening methods for the detection of polysaccharase-producing microorganisms(H.J.Ruijssenaars 외), 2000

○ Degradation of three aromatic dyes by white rot fungi and the production of ligninolytic enzymes(Jayasinghe, C. 외), 2008

○ Lignin oxidation by laccase in isozymes from Trametes versicolor(Bourbounnais, R 외), 1995 ○ Lignin-degrading enzyme from the hymenomycete Phanerochaete chrysosporium(Tien, M 외), 1983

○ Utilization of damaged sorghum and rice grains for ethanol production by simultaneous saccharification and fermentation(K. Suresh 외), 1999

○ Productionof bioethanol using lignocellulosic hydrolysate by the white rot fungis Hohenbuehelia sp.ZW-16(Xiaohui Liang 외), 2013

○ Ethanol production via simultaneous saccharification and fermentation of sodium hydroxide treated corn stover using Phanerochaete chrysosporium and Gloeophyllum trabeum(Micky Vincent 외), 2014