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나노기술을 이용한 암전이 진단기술

감시림프절(sentinel lymph node) 바이오메디컬 이미징

임용택 교수 충남대학교 분석과학기술대학원 나노메디컬시스템연구실 노영욱 박사 충남대학교 분석과학기술대학원 나노메디컬시스템연구실

1. 서론

사람에게 발생하는 악성종양은 림프절 전이에 따라 예후에 차이를 보인다.

따라서 암환자에게 림프절 전이 여부는 예후를 결정하는 중요한 인자로, 수술 후 보조화학요법 시행 여부를 결정하는 가장 중요한 지침이 되고 있다.

Sentinel lymph node(SLN)는 종양이 림프관을 통해 직접 전이되는 경우 첫 번째로 전이되는 림프절을 의미하며(그림 1), 1992년 Morton 등이 흑색종 환자의 종양근처의 림프액이 감시림프절로 이동함을 확인하여 처음으로 알려지게 되었다1. 종양이 림프관을 통해 전이되는 현상은 항상 일정하고 순차적으로 이루어지는 것으로 알려져 있다. 따라서, 림프절 전이는 SLN에 가장 먼저 전이될 것이라는 예측을 근거를 두고 종양의 전이 가능성을 진단한다. 이를 SLN mapping 이라고 한다¹. 즉 다양한 분자영상 기법을 이용하여 종양 주위의 림프절을 정확히 찾아내 떼어낸 후 조직 검사를 시행함으로써 림프절 전이 여부를 확인하고 전이암에 대한 진단을 가능하게 한다. SLN 조직검사에서 전이가

없는 경우 다른 림프절을 떼어내지 않고 경과관찰 함으로써 불필요한 수술로 인한 합병증 유발 위험성을 감소시키고 경제적인 측면에서도 장점을 취하고 있다.

현재 SLN mapping은 초기 유방암, 상피성 흑색종에서 표준적인 진단법으로 사용되고 있으며 또한, 대장암, 위암, 폐암, 식도암 그리고 구강암 같은 다른 암종에도 임상에 적용할 수 있는 가능성에 대해 활발히 연구 중에 있다².

그림 1. Diagram presenting the concept of SLN²

2. 본론

가. SLN 이미징 기법

SLN mapping의 방법, 즉 종양 주위의 림프절을 정확히 찾아내기 위한 방법으로 여러 가지 분자영상 기법이 연구되고 임상에 사용되고 있다. 대표적인 SLN 이미징 방법은 방사성동위원소를 이용하는 핵의학적 영상기법과 생체 염료액을 사용하는 광학영상기법이 이용되고 있다^3‐6(그림 2). 핵의학적 영상기법에 사용되는 방사성 추적자로는 technetium-99m(⁹⁹mTc) sulfur colloid가 유용하다고 알려져 있다. 이것의 분자크기는 100-400 nm이고 종양주위 피하지방에 주입 후 약 2-4시간내에 림프관 조영술(lymphoscinitgraphy)와 감마선검출기(gamma probe)를 이용 SLN의 위치를 확인할 수 있다⁴. 방사성동위원소를 사용하는 SLN 이미징 기법은 생체 내 깊은 곳에 위치하는 림프절 전이를 확인 할 수 있는 장점이 있는 반면, 낮은 해상도로 인해 종양에서 가까운 SLN는 확인이 어려운 문제점이 있다. 또한, 방사성동위원소의 높은 가격과 체내에 잔존하게 될 방사성물질의 안전성에 대해 고려해야 한다.

광학영상기법에 사용되는 생체 염료액으로는 isosulfan blue가 대표적이다⁶. Isosulfan blue는 초기 동물실험을 통해 림프계를 선택적으로 염색하는 능력이 발견되었고, 이후 SLN 이미징에 널리 사용되기 시작했다. 그러나 isosulfan blue를 사용하는 환자들에서 과민반응 등의 부작용이 나타나고, 또한 그 공급이 부족하게 되면서 최근에는 isosulfan blue에 비해 공급이 안정되어 있고, 가격과 부작용 발생률이 낮은 장점을 가지고 있는 methylene blue를 SLN 이미징에 사용하고 있다. 이 생체 염료액을 종양주위 피하지방에 주입 하면 5-10분 후 염색된 림프관이 관찰되고 이 림프관을 따라 푸르게 염색된 SLN 위치를 확인 할 수 있다6. 이 생체 염료액을 이용한 광학영상기법은 blue dye의 특성상 체내 깊은 곳에 위치하는 림프절을 확인하는데 시각적인 도움을 주지 못하는 단점이 있고, 작은 분자량으로 인해 림프절을 쉽게 통과하여 여러 림프절을 푸른색으로 염색하는 현상이 나타나 정확한 진단에 한계를 나타내고 있다.

그림 2. SLN mapping by radio-guided (A) and dye-guided method (B)⁵

나. 근적외선 형광 영상

형광영상이란 생체 조직내의 형광물질이 외부에서 조사한 빛을 흡수한 후 여기되어 방출되는 빛을 감지하여 영상화 하는 것이다. 생체 내 형광영상은 생체 조직에서 나오는 빛의 흡수, 산란, 그리고 자가 형광 등을 고려할 때 근적외선 형광영상이 가장 유용하게 활용되고 있다. 그림 3은 생체내 존재하는 헤모글로빈 과 물이 각기 다른 파장의 빛을 흡수하는 효율을 나타낸 그림이다(그림 3)⁷. 혈액 내에 존재하는 헤모글로빈은 가시광선 영역의 빛을 흡수하고, 체내 많은 부분을 차지하고 있는 물과 지방은 적외선 영역에서 주로 빛을 흡수하기 때문에

근적외선 영역대인 700-900 nm에서 조직 투과 깊이가 길어지기 때문에 피부에서 깊이 떨어진 장기에 형광염료를 주입하고 추적하는 것이 가능하며 피부를 절개하기 않고도 정확한 형광영상을 얻을 수 있어 비칩윤적 이미징이 가능하다⁷.

그림 3. The NIR window for in vivo imaging⁷

최근에 인도시아닌그린 (indocyanine green; ICG), IRDye800, IR-780iodide 그리고 heptamethine cyanine dye와 같은 근적외선 형광염료를 이용한 SLN mapping에 관한 연구가 전임상과 임상에서 활발히 진행되고 있으며, 특히 ICG는 FDA에서 사용이 허가된 형광염료로써, 환자들에서 부작용이 나타나지 않아 SLN 이미징에 가장 적합한 근적외선 형광염료로 사용되고 있다(표 1)⁸.

Low autofluorescence

Minimal photon absorption and scatter Improved tissue depth penetration Non-radioactive

Non-invasive

Relatively inexpensive Portability

표 1. Advantages of NIR fluorescence for in vivo imaging⁸

다. 근적외선 형광영상 시스템

근적외선 형광염료를 이용한 SLN 이미징 기법은 많은 장점을 가지고 있으나, 가시영역의 염료와 달리 사람의 눈으로 관찰 할 수가 없다. 따라서, 수술에 최적화된 근적외선 형광영상 시스템이 개발이 요구되기 시작했고 현재 몇몇 시스템이 개발 단계에 있다. 미국 Novadaq사에서 SPY Imaging 시스템을 개발하여 혈관 이식과 장기 이식 수술에 활용되고 있다. 그리고, 일본의 Hamamatsu사에서는 Photodynamic Eye(PDE) 시스템을 개발하여 일본과 독일에서 상용화 하였다. PDE는 ICG에 최적화 되어 있는 시스템으로 유방암, 위암, 대장암 등에서 ICG를 이용한 SLN 이미징에 활용하고 있다. 다음으로 미국 하버드의과대학의 Frangioni 연구팀에서 Fluorescence-Assiosted Rescection and Exploration(FLARE) 시스템을 개발하여 유방암 환자의 SLN 이미징에 활용하였다⁸. 국내에서는 충남대학교에서 ICG에 최적화되어 있는 근적외선 형광영상 시스템을 개발중에 있으며, 현재 대동물에서 SLN mapping 연구에 활용하고 있다⁹.

라. ICG를 이용한 SLN 이미징

ICG는 감광성 형광염료로 생체에 독성이 없고 근적외선 영역의 빛의 흡수율이 높아 임상 조영제로서 FDA 승인되어 임상에서 사용 중인 형광염료이다 ICG는 임상에서 간기능 검사와 심혈관 검사에 주로 이용되고 있으며 최근에는 ICG의 근적외선 형광 특성을 이용, SLN 이미징에 활용하고 있다. 그러나 SLN 이미징에 ICG를 사용하는데 극복해야할 문제점이 있다. ICG는 양친매성을 가지고 있어 수용액내에서 쉽게 응집되면서 불안전해 지고 quantum yield가 급격히 감소되는 양상을 보이고 있다. 또한, ICG는 입경이 1.2 nm인 매우 작은 입자이므로 림프절을 쉽게 통과하여 SLN의 형광이 오래 유지되지 않고 여러 림프절에서 형광 영상이 관찰되어 SLN mapping 효율이 감소될 수 있다^8‐11.

따라서, 많은 연구자들이 생체내에서 ICG의 안전성과 형광특성을 유지시킬 수 있는 방법에 관하여 연구하고 있다. 대표적으로, 알부민 단백질(HSA)과 ICG의 복합체를 만들어 SLN mapping에 이용하였으며, 결과적으로 생체내에서 ICG가

응집되는 현상을 방지하고 7.3 nm 정도의 나노입자 복합체가 이루어져 림프절에서의 형광세기를 3배이상 높여 SLN mapping 효율을 증가시켰다⁸. 또한, 양친매성 고분자인 감마글루탐산 (poly-γ-glutamic acid)과 역시 양친매성인 ICG의 복합체를 제조하여 ICG의 형광 특성이 3일 이상 유지되는 결과를 얻었다.

ICG와 ICG/γ-PGA 복합체를 마우스 파하에 주입한 후 형광영상을 관찰한 결과 ICG에 비해 ICG/γ-PGA 복합체가 림프절에 오랜시간 체류하여 강한 형광영상을 나타내었다. 이는 ICG/γ-PGA 복합체가 림프절내 면역세포에 의해 uptake 되는 현상을 통하여 입증할 수 있었다¹⁰(그림 4). Detmar 연구팀에서는 리포좀내에 ICG가 봉입되어 있는 60 nm 크기의 입자(LP-ICG)를 제조하여 ICG의 광학특성과 형광 안전성이 오랜기간 유지되는 결과를 얻었다. ICG와 LP-ICG를 마우스의 피하에 주입한 후 형광영상을 관찰한 결과, ICG는 림프절을 쉽게 통과한 후 다음 림프절로 이동한 반면, LP-ICG는 SLN를 통과하지 못하였다. 게다가 ICG의 경우 혈관으로 흡수되어 간으로 이동하는 현상이 관찰되었다¹¹. 위와 같이, 고분자와 ICG와의 복합체는 ICG의 생체내 안전성과 체류시간을 높여줌으로써 SLN mapping에 효과적으로 활용될 수 있음을 보여주었다.

그림 4. SLN mapping in the mouse by the ICG/γ-PGA complex¹⁰

마. 근적외선 형광 나노입자를 이용한 SLN 이미징

SLN mapping에 가장 적당한 이미징 조영제는 종양부위에서 림프절로 신속하게 수송된 다음 오랜 시간 체류할 수 있는 크기의 입자이고, 생체내 안정성이 유지되는 것이 매우 중요하다. 이 조영제 입자의 크기가 300 nm 이상일 경우에는 림프관내로 이동하지 않고 주입된 장소에 머무르게 되고, 크기가 5 nm 이하일 경우에는 림프관을 거쳐 여러 림프절을 통과하게 되고 또한, 주변 모세혈관을 통하여 흡수되어 간으로 이동하게 되므로 SLN mapping에 적합하지 않다. 따라서 SLN mapping에 이상적인 입자 크기는 10∼50 nm 이라고 알려져 있다^8,9(그림 5).

그림 5. Illustration of imaging nanoprobes optimized for SLN mapping⁹

가) 양자점 나노 입자 (quantum dots)

나노 입자를 이용한 SLN mapping에 관한 연구의 본격적인 시작은 2004년 Frangioni 연구팀에서 진행하였던 양자점 (quantum dots; QDs)이라 불리는 반도체 입자를 이용한 SLN mapping 이다¹². QDs은 양자제한 효과 (Quantum Confinement effects)에 의해 흡수(absorption)와 방출(emission) 파장이 조절되는 물질로서 기존 유기 염료에 비해 광 안정성 등이 우수하고, 그 크기를 조절함으로 방출 파장을 조절할 수 있다는 특성으로 인하여 이미징 분야에서

응용이 기대되는 있는 나노 입자이다. Frangioni 연구팀에서 SLN 이미징에 사용한 QDs은 중금속 (cadmium, tellurium, selenium) 코어-셀 구조에서 type-II 구조를 형성하여 근적외선 형광을 나타내는 CdTe/CdSe코어-셀 QDs이며, 840–860 nm의 파장을 구현할 수 있었고, 여기에 친수성의 유기체를 코팅하여 약 15-20 nm 크기를 가지는 나노입자로 제조함으로써 SLN mapping 연구에 적합하도록 하였다¹². 그리고 이는 소동물과 대동물을 이용한 실험을 통하여 증명하였다(그림 6).

그림 6. NIR QDs SLN mapping in the mouse and pig¹²

나) 근적외선 형광 고분자 나노젤 (NIR-PNG)

QDs 나노입자 (< 20 nm)는 동물실험을 통해 SLN mapping 연구에 좋은 효능을 나타내는 것을 입증하였다. 그러나, QDs을 임상에 이용하는데 있어서 중요한 문제 중 하나는 생체 독성에서의 가능성이다. 비록, 비중금속 재료의 이용과 유기물질의 코팅을 통해 독성 문제가 해결되고 있기는 하지만, 아직 QDs을 임상에 이용한 예가 보고되지 않고 있다. 따라서, 생체 친화적인 고분자와 안전성이 입증된 근적외선 형광 염료를 이용한 SLN 이미징 조영제 개발에 관한 연구가 진행되었다. 생분해 특서을 가지며 독성이 없고 비면역원성 고분자인 플루란과 콜레스테롤을 이용하여 플루란 나노젤 (PNG)을 제조하였다⁹. 여기에 근적외선 형광 염료인 IRDye 800을 결합하여 근적외선 고분자 나노젤 (NIR-PNG)를 제조하였다. NIR-PNG는 30 nm의 나노 입자 크기를 가지고 있어 SLN mapping 연구에 최적화된 특성을 나타냈다. NIR-PNG를 마우스

그림 7. NIR-PNG SLN mapping in the mouse and pig⁹

파하에 주입한 후 형광영상을 관찰한 결과 2분 이내에 SLN 이미징이 가능하였으며 IRDye 800 형광 염료에 비해 SLN mapping에 있어서 높은 효능을 보였으며 돼지에서도 10분 이내에 SLN 이미징에 높은 효과를 나타냈어다. 또한, SLN를 적출하여 형광현미경을 통해 관찰한 결과 NIR-PNG는 림프절내 대식세포/수지상세포 등에 의해 uptake 되어 있음을 확인 할 수 있었다⁹(그림 7). 이러한 결과는 생체 친화성 고분자를 이용하여 SLN mapping에 최적화 되고 안전하여 임상에서 진단과 치료에 활용할 수 있는 나노입자 기반 이미징 조영제의 개발 가능성을 제시해 주고 있다.

3. 결론

삶의 질의 향상과 더불어 의학적 패러다임이 질병의 치료에서 조기 진단으로 변하고 있으며, 진단 분야에서도 단순한 병변에 대한 분석보다는 진단의 정확성과 신뢰도 향상에 대한 필요성이 대두되고 있다. 이는 환자들의 질병 특히 암에 대한 인식변화와 진단 영상의학의 발달을 가져오고 있다. 최근, 보다 정확성을 높이고 부작용을 최소화 할 수 있는 근적외선 형광 이미징 나노 조영제가 개발되어 임상 유용성에 대한 검증이 진행되고 있고 이는, 임상에서 SLN를 감지 할 수 있는 광학영상시스템의 개발의 가치를 높여주고 있다. 암의 전이를 조기에 진단하고

예방적 수술범위를 최소화 한다는 개념의 연장선 상에서 대두되어진 SLN 이미징은 지금까지 발전한 나노조영제 기술과 광학영상의학 기술 발달을 기반으로 수술 후 합병증을 최소화하고 삶의 질을 향상시키는 데 임상적 유용성이 매우 클 것으로 기대하고 있다.

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