대한소화기학회지 2008;51:19-24
접수: 2007년 7월 11일, 승인: 2007년 10월 15일
연락처: 조영석, 480-717, 경기도 의정부시 금오동 65-1번지 가톨릭대학교 의정부성모병원 소화기내과 Tel: (031) 820-3658, Fax: (031) 847-2719 E-mail: [email protected]
* 이 논문은 2005년도 한국학술진흥재단의 지원에 의하여 연 구되었음(KRF-2005-331-E00117).
Correspondence to: Young Seok Cho, M.D.
Department of Internal Medicine, Uijeongbu St. Mary's Hos- pital, The Catholic University of Korea, 65-1, Geumo-dong, Uijeongbu 480-717, Korea
Tel: +82-31-820-3658, Fax: +82-31-847-2719 E-mail: [email protected]
가토에서 형광자성나노입자를 이용한 위 감시 림프절 탐색
가톨릭대학교 의과대학 내과학교실, Center for Molecular Imaging Research, Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital*, 포항공과대학교 신소재공학과†
김진수ㆍ윤태종*ㆍ김형근ㆍ김성수ㆍ채현석ㆍ최명규ㆍ김용진
†ㆍ이규철
†ㆍ조영석
Sentinel Lymph Node Mapping of the Stomach Using Fluorescent Magnetic Nanoparticles in Rabbits
Jin Soo Kim, M.D., Tae Jong Yoon, Ph.D.*, Hyung Keun Kim, M.D., Sung Soo Kim, M.D., Hiun Suk Chae, M.D., Myung Gyu Choi, M.D., Yong Jin Kim, M.S.†,
Gyu Chul Yi, Ph.D.†, and Young Seok Cho, M.D.
Department of Internal Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea,
Center for Molecular Imaging Research, Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital*, USA, Department of Material Science and Engineering, POSTECH†, Pohang, Korea
Background/Aims: Sentinel lymph node (SLN) mapping of the stomach cancer using available techniques is lim- ited by unpredictable lymphatic drainage patterns and skip metastasis. The aim of this study was to test the feasi- bility of gastric SLN mapping using fluorescent magnetic nanoparticles (FMNP) of uniform nano-size. Methods:
Biocompatible silica-overcoated magnetic nanoparticles containing rhodamine B isothiocyanate (RITC) within a sili- ca shell of controllable thickness with 60 nm thickness were used as model nanomaterials. Gastric lymphatic mapping was performed by injecting 100μL of either FMNP or isosulafan blue subserosally. Gastric injections (n=7) were made into the body, approximately 5 cm from the lesser curvature of rabbits. Sentinel lymph nodes were visualized using fluorescent nanoparticle detection system. Results: In 7 rabbits, it was demonstrated that FMNP quickly and accurately detected sentinel lymph nodes. Injection into the stomach resulted in identification of a retrogastric lymph node. Histological analysis in all cases confirmed the presence of nodal tissue.
Conclusions: FMNP can be a potential alternative to existing tracers in the detection of SLN in this animal experiment. (Korean J Gastroenterol 2008;51:19-24)
Key Words: Sentinel lymph node; Fluorescent magnetic nanoparticle
서 론
위암은 우리나라에서 암 발생률 1위, 암 사망률 2위를 차 지할 만큼 흔하고 중요한 질환이다. 위암의 전통적인 치료
는 위절제술 및 림프절절제술로 조기위암의 경우 95% 이상 에서 5년 생존율을 보인다.1 내시경 검사를 비롯한 진단 기 술의 발달로 조기위암 환자의 비율이 점차 증가되어 최근에 는 우리나라에서도 전체 위암 환자의 30-40%에 이르고 있
20 대한소화기학회지: 제51권 제1호, 2008
다.2 조기위암은 10% 정도의 낮은 림프절 전이를 보이며 예 후가 양호하여 장기생존을 기대할 수 있으므로 최근에는 술 후 환자의 삶의 질(QOL)과 장기 기능의 보존 등을 고려하 여 선택된 환자에서 내시경절제술과 최소침습수술을 시도 하고 있다.
감시 림프절이란 일차 병소로부터 처음으로 림프액이 배 액되는 림프절로 최초의 전이가 일어날 수 있는 림프절이 다. 감시 림프절의 개념은 Cabanas 등3이 음경암 수술에서 처음 제안하여 감시 림프절 전이 유무에 따라 광범위 림프 절 절제술의 시행 여부를 결정하였다. 이후 이 개념은 악성 흑색종과 유방암 수술에 도입되었다.4,5 유방암에서는 액와 부 림프절 전이가 없는 경우 근치 액와부 림프절 절제술이 치료 효과면에서 볼 때 더 장점이 있는 것으로 인정되지 않 고 있어 감시 림프절 생검을 통한 림프절 전이 진단이 많이 이루어지고 있다.6 위암에서는 림프계 구조가 사지 또는 유 방과는 달리 복잡하고 도약 전이(skip metastasis)와 미세 전 이 등으로 감시 림프절 생검의 유용성이 크지 않은 것으로 알려져 있다.7 그러나 조기위암의 경우 진행암에 비해 위음 성률이 낮아 미세 전이를 찾는 데 감시 림프절 생검이 유용 하게 사용될 수 있으며, 또한 예측하기 힘든 위치의 감시 림 프절 탐색에 유용한 방법이 될 수 있다.8
현재 사용되는 감시 림프절 탐색 방법에는 청색 염료를 이용한 색소법과 방사선 동위원소법 등 두 가지 방법이 있 으며, 최근 동정률을 높이기 위해 두 가지 방법을 동시에 사 용하기도 한다. 그러나 청색 염료를 이용한 림프절 탐색은 크기가 작은 염료 입자가 감시 림프절을 지나쳐 주변 림프 절로 확산될 수 있어 위양성률이 높다는 단점이 있다.9 또한 방사성 동위원소법의 경우 청색 염료에 비해 동정률을 높이 기는 하였지만 일차 주입 부위에 동위원소의 활성도가 높아 수술 중 주변 림프절을 탐색하는 데 어려움이 있다.10 이러 한 단점을 극복하기 위하여 반도체 양자점(quantum dots)을 이용하여 근적외선형광영상 시스템으로 술 중 감시 림프절 을 탐색할 수 있는 방법이 개발되었지만 반도체 양자점은 중금속으로 이루어져 인체 독성의 문제가 있다.11
이번 연구에서는 인체 독성을 최소화한 형광자성나노입 자를 위 감시 림프절 탐색에 이용할 수 있는지 알아보고자 하였다.
대상 및 방법
1. 대상 동물
암수 구별 없이 흰색 가토 중 몸무게가 3.0-3.4 kg인 7마 리를 대상으로 하였다. 마취방법은 zoletil 50 (Vibac Labo- ratories, Carros, France) 1 ml/kg과 xylazine hydrochloride (rom- punⓇ, BayerKorea, Seoul, Korea) 0.2 ml/kg를 혼합하여 정맥
주사하였다. Zoletil 50은 약효지속기간이 40-60분이며 수술 도중 동물이 깨었을 때는 처음 용량의 50%를 첨가 주사하 는 방식으로 마취를 한 후 수술하였다.
2. 형광자성나노입자 합성
형광자성나노입자는 윤 등12의 방법에 따라 합성하였다.
공침법으로 합성된 페라이트 자성나노입자 5 mg/mL 수용액 13.8 mL을 고분자 polyvinylpyrrolidone (PVP, Sigma, St. Louis, MO, USA) 수용액 250 mL (농도는 25.6 g/L)에 첨가하여 상 온에서 2시간 동안 고속 교반기를 통해 혼합하였다. 고분자 로 안정화된 자성나노입자를 원심분리하여 침전을 유도하 고, 이를 에탄올 250 mL에 분산시켰다. 여기에 rhodamine B isothiocyanate (RITC, Fluka, Switzerland)를 3-aminopropyl- triethoxysilane (APS, Gelest, Morrisville, PA, USA)으로 처리 한 용액과 tetraethoxysilane (TEOS, Gelest)을 0.04：0.3의 몰 비율로 혼합한 후 이 혼합물을 에탄올에 녹인 것을 첨가하 였다. 이후 NH4OH를 4.2 vol% 첨가하여 자성나노입자 표면 으로부터 유기형광물질이 함유된 실리카 껍질이 형성되도 록 유도하였다. 유기형광물질이 함유된 실리카 껍질로 둘러 싸여진 형광자성나노입자를 고속 원심 분리기를 이용하여 20,000 rpm에서 20분 동안 원심 분리한 다음, 침전물을 에탄 올과 물로 세척함으로써 정제하였다.
3. 감시 림프절 탐색
마취한 가토를 체온을 일정하게 유지하기 위해 표면 온도 가 38oC인 따뜻한 판에 앙와위 자세로 고정하였다. 가토를 전복벽의 정중선을 따라서 절개하였다. 감시 림프절 탐색을 위해 형광자성나노입자 또는 1% isosulfan blue (Lymph- azurinⓇ, Ben Venue Laboratories Inc., Clevelend, OH, USA) 100μL를 27-gauge 주사기를 이용하여 Soltesz 등11의 방법에 따라 체부 소만의 한 부위에 장막하로 주입하였다. 형광자 성나노입자를 탐색하기 위하여 입체현미경(SZX12, Olym- pus, Tokyo, Japan)을 이용하였고 charge-coupled device (CCD) camera로 영상을 기록하였다. 비형광광선을 차단하기 위하 여 long-wavelength pass filter (λ=600 nm)를 입체현미경의 접안렌즈 전면에 부착하였다. 조명을 위해 100 watt의 수은 램프에 광학 섬유를 연결하여 사용하였다. 나노입자의 여기 광선을 위해 band pass filter (λ=550 nm with the band width of half maximum 40 nm)를 램프와 섬유 사이에 삽입하였다.
조명의 광도는 비추는 부위에 일정하게 유지되도록 하였다 (Fig. 1). 조영제가 처음 관찰되는 림프절을 감시 림프절로 정의하고 감시 림프절에 도달하는 시간을 기록하였다. 형광 자성나노입자가 감시 림프절에서 이동하는지를 알아보기 위하여 3시간 동안 관찰 후 림프절을 절제하였다. 주변의 형광이 보이지 않는 림프절을 절제하여 음성 대조군으로 하
김진수 외 8인. 가토에서 형광자성나노입자를 이용한 위 감시 림프절 탐색 21
Fig. 1. Sentinel lymph node mapping of the rabbit stomach. (A) Schematic diagram of the detection system for the fluorescent magnetic nanoparticle. (B) The filtered light from the mercury lamp is illuminated over the observation area.
CCD, charge-coupled device.
Table 1. The Time Required to Stain the Sentinel Lymph Node (SLN) after Subserosal Injection of Fluorescent Magnetic Nanoparticles or Dye Solutuion
Solution N Time to stain SLN Positive rate of SLN
FMNP 7 3.9±0.1 100%
Isosulfan blue 7 3.6±0.6 100%
FMNP, fluorescent magnetic nanoparticles.
였다.
4. 조직 검사
절제된 림프절을 10% 중성 포르말린에 고정하고 파라핀 포매한 후 5μm로 박절하고 H&E 염색을 시행하여 관찰하 였다. 또한 형광을 확인하기 위하여 공초점 현미경으로 관 찰하였다.
5. 통계 분석
통계 분석은 SPSS (version 10.0)을 이용하였고, 모든 결과 는 평균±표준편차로 표시하였다. Isosulfan blue와 형광자성 나노입자가 감시 림프절에 도달하는 시간의 비교는 un- paired Students t-test를 이용하였으며, p값이 0.05 미만인 경 우 유의하다고 평가하였다.
결 과
1. 감시 림프절 탐색
60 nm 크기의 형광자성나노입자 100μL를 체부 소만의 장막하로 주입하였을 때, 7마리 모두에서 5분 이내에 형광 을 발현하는 위뒤 림프절(retrogastric lymph node)이 확인되 었다. 감시 림프절에 도달하는 평균시간은 3.9±0.1분이었다.
isosulfan blue와 형광자성나노입자를 동시에 주입하였을 때 감시 림프절에 도달하는 시간에는 유의한 차이가 없었다 (Table 1). 림프관이나 림프절 조직으로부터 형광자성나노입 자의 누출은 관찰되지 않았다. 3시간 경과 후 림프절을 절 제하여 입체현미경으로 관찰하였을 때 형광이 발현되었다 (Fig. 2).
2. 조직 검사
감시 림프절을 H&E 염색하여 관찰하였을 때 염증 변화 가 없는 림프절 조직임을 확인하였고(Fig. 3A). 공초점 현미 경으로 관찰하였을 때 붉은 색 형광이 관찰되었다(Fig. 3B).
고 찰
이번 연구는 형광자성나노입자 탐색 시스템을 이용하여 가토에서 위 장막하로 약 60 nm의 형광자성나노입자를 주 입하여 위 감시 림프절 탐색을 시행한 연구이다. 이번 연구 에 이용된 형광자성나노입자는 실리카로 표면처리하여 인 체에 독성을 최소화하였고, 비교적 정확하고 신속한 실시간 감시 림프절 탐색이 가능하였다.
감시 림프절 생검을 임상에 적용하는 연구를 통해 현재 유방암과 악성 흑색종에서 감시 림프절 생검이 림프절 전이 를 평가하기 위한 방법으로 인정받았으며, 최근 다기관 임 상 시험을 통해 이들 종양에서 림프절 전이 예측률이 95%
이상인 것으로 보고하였다.13,14 악성 흑색종과 유방암 이외
22 The Korean Journal of Gastroenterology: Vol. 51, No. 1, 2008
Fig. 2. A stereomicroscopic bright field image (A) and red fluo- rescence image (B) of excised lymph node. These images are taken 3 hours after fluorescent magnetic nanoparticle injection.
Fig. 3. Histological analysis of sentinel lymph node. (A) H&E stained section is shown at ×10.
(B) Unstained section photogra- phed on a confocal laser scanning microscope at ×10. Note the ab- sence of trauma or edema in this nodal tissue.
여러 고형암에서도 연구가 진행 중이지만 아직까지 임상 적 용에는 많은 논란이 있다. 여러 연구에서 위장관암에서 감 시 림프절 탐색의 가능성을 제시하였지만, 예측률에서 다양 한 결과를 보였다.15-17 Bertagnolli 등18은 대장암에서는 감시 림프절 생검 기술이 유방암이나 악성 흑색종에서 만큼 정확 도가 높지 않다고 하였다. 그러나 이 연구는 환자수가 적고, 주입 방법이 표준화되어 있지 않으며 기술적으로 복잡하다 는 제한점이 있다.
위암에서는 감시 림프절 생검이 절제 범위에 영향을 미치 지 못한다는 점 때문에 아직도 논쟁의 여지가 있다. 위 림프 관의 해부 구조가 복잡하고 도약 전이가 있기 때문에 현실 적으로 어려우며,7 종양이 위 소만이나 후벽에 위치하는 경 우 감시 림프절 생검의 민감도가 매우 낮다.19 그러나 일부 연구에서는 위암 환자의 감시 림프절 생검이 술기적으로 가 능할 뿐만 아니라 수술 중 각 환자에서 림프절 전이 여부를 알 수 있는 유용한 방법으로 보고하고 있다.20-24 향후 추가 연구를 통해 위암에서 감시 림프절 탐색이 감시 림프절 생 검에 이용될 수 있을 뿐만 아니라 개개의 환자에 특이적인 위 주변 감시 림프절들이 분포하는 림프절 정거장(lymph node stations)을 확인하고, 비정상적인 림프 배액이 있는 지 를 확인하는 데 도움을 줄 수 있을 것으로 생각한다. 또한 위암 수술 때 특이 감시 림프절 탐색은 비정상적인 림프 배 액이 있는 경우 근치림프절절제술의 범위를 변화시킬 수 있
으며, 중요한 국소 림프절에 대해 조직병리학적인 분석을 가능하게 할 수 있을 것이다.
기존의 감시 림프절 생검에 사용되는 색소법과 방사선 동 위원소법은 여러 제한점이 있다. 청색 염료의 단점을 보완 하기 위해 이용되는 방사성 동위원소의 경우 수술 2-16시간 전에 내시경을 이용하여 주입할 필요가 있고, 내시경이 도 달할 수 없는 병소에서는 적용이 어렵다. 또한 복강경을 이 용한 감시 림프절 탐색의 경우 복강경용 gamma probe가 굴 곡성이 없으므로 기술적인 제한점이 될 수 있다.10 이러한 단점을 극복하기 위하여 Kim 등25은 반도체 양자점을 이용 하여 근적외선형광영상 시스템으로 술 중 감시 림프절을 탐 색할 수 있는 방법을 개발하였다. 그러나 인체에서 반도체 양자점을 이용하기 위해서는 독성 문제가 해결되어야 한다.
이 연구에서는 반도체 양자점이 실험 동물에 급성 독성을 유발하지 않았으며, 감시 림프절 생검에 사용하는 용량이 작고 감시 림프절이 수술 중 절제되므로 독성이 거의 없을 것으로 추정하였다. 그러나 반도체 양자점의 중심부는 cad- mium, telluride, selenide와 alkyl phosphine 등 급, 만성 독성 을 일으킬 수 있는 중금속으로 구성되어 있으므로 독성 문 제가 완전히 해결될 수는 없을 것으로 생각한다. 또한 반도 체 양자점을 이용한 여러 복강 내 장기로 200 pmol 정도의 근적외선형광 양자점을 주입한 연구에서 1분 이내에 감시 림프절에 도달하였지만 어느 정도 머물렀는지에 대한 결과
Kim JS, et al. Sentinel Lymph Node Mapping of the Stomach Using Fluorescent Magnetic Nanoparticles in Rabbits 23
가 확실치 않다.11
감시 림프절 탐색의 기술을 실제 수술에 적용하기 위해서 는 조영제 주입 후 탐색에 걸리는 시간과 림프절에 머물러 있는 시간이 중요하다. 조영제 주입 직후 림프절에 도달하 여 다른 림프절로 이동하지 않고 가능한 오랜 시간 동안 머 무를 수 있는 조영제가 이상적이라고 할 수 있다. 쥐에서 fluorescent bead를 이용한 감시 림프절 탐색 연구에서 입자 의 크기가 100 nm 이상이면 감시 림프절에 도달하는데 시 간이 너무 걸리는 단점이 있었고, 20 nm 이하인 경우에는 주입 직후 감시 림프절에 도달하지만 곧 사라진다는 단점이 관찰되었다.26 한편 혈액 내 헤모글로빈과 수분은 생체 조직 에서 빛을 강하게 흡수하는 물질이다. 헤모글로빈은 650 nm 이하의 가시광선 영역의 빛을 흡수하고, 수분은 1,100 nm 이상의 빛을 흡수한다. 따라서 형광을 이용한 감시 림프절 탐색에는 650-1,100 nm의 파장의 빛을 흡수하는 물질이 적 합하다. 이번 연구에 사용된 형광자성나노입자에 삽입한 RITC는 여기파장이 495 nm이고, 방출파장이 527 nm의 가시 광선 영역대의 형광 물질이다. 따라서 헤모글로빈이 가시광 선 파장대에서 흡수력이 강하므로 자가형광에 의한 배후 잡 신호가 높을 수 있다. 이러한 문제점은 자성나노입자에 삽 입하는 형광물질을 Cy5.5 또는 ICG (indocyanine green)를 이 용함으로써 배후 잡신호를 최소화할 수 있을 것으로 생각한 다.
이번 연구에서 isosulfan blue는 형광자성나노입자에 의해 규명된 림프절에 동시에 발견되었다. 이러한 사실은 형광자 성나노입자가 적절한 림프친화 광학 탐촉자이며, 높은 민감 도와 특이도로 수술 중 감시 림프절 탐색을 가능하게 할 수 있다는 것을 입증한다. 그러나 이번 연구의 제한점은 실험 에 이용된 동물 모델이 형광자성나노입자의 림프절 탐색의 정확도를 충분히 반영하지 못할 수도 있다는 점이다. 실제 암이 없는 경우 병적 림프절 종대가 생기지 않을 수 있으며 이와 같은 상황에서 적출한 림프절은 감시 림프절로서의 기 능을 못 할 수 있다. 또한 위암이 발생하면 기존의 정상 림 프 흐름이 바뀌어 비정상적인 림프 배액이 발생할 수 있으 며, 위암의 위치에 따라 다른 양상을 보일 수 있다. 따라서 림프절 전이가 발생하는 위암 동물 모델을 수립하여 병적인 림프절 종대와 이상 림프 배액이 발생한 경우에도 감시 림 프절을 정확하게 예측할 수 있는 지에 대한 평가가 중요하 다.
향후 이번 연구에 이용된 형광자성나노입자가 인체에 유 해성을 보이지 않는다는 점이 확인되고 위암 동물 모델에서 도 감시 림프절 탐색의 정확도가 높을 경우 형광자성나노입 자를 이용한 감시 림프절 생검은 여러 감시 림프절 생검 방 법 중의 한 가지 방법이 될 수 있을 것이다. 또한 형광자성 나노입자의 특성상 자기공명영상을 이용하여 술 전 림프절
의 상태를 미리 확인할 수 있는 장점이 있을 것으로 생각한 다.
요 약
목적: 여러 방법을 이용한 위암의 감시림프절 생검은 림 프계 구조가 복잡하고 도약전이로 인해 제한이 있어 왔다.
이번 연구에서는 위 감시림프절 탐색에서 형광자성나노입 자를 이용할 수 있는지를 알아보고자 하였다. 대상 및 방 법: 페라이트 자성나노입자 표면으로부터 유기형광물질인 rhodamine B isothiocyanate (RITC)이 함유된 실리카 껍질이 형성되도록 형광자성나노입자를 합성하였다. 7마리의 흰색 가토를 대상으로 형광자성나노입자 또는 1% isosulfan blue 100μL를 위체부 소만에 장막하로 주입하였다. 주입한 형광 자성나노입자의 형광 탐색은 형광자성나노입자 탐색 시스 템을 고안하여 이용하였다. 결과: 60 nm 크기의 형광자성나 노입자를 주입하였을 때 7마리 모두에서 5분 이내에 형광을 발현하는 위뒤 림프절이 확인되었다. 감시 림프절에 도달하 는 평균시간은 3.9±0.1분이었다. Isosulfan blue와 형광 자성 나노입자를 동시에 주입하였을 때 두 물질 간에 감시 림프 절에 도달하는 시간에는 유의한 차이가 없었다. 림프관이나 림프절 조직으로부터 형광자성나노입자의 누출은 관찰되지 않았다. 감시 림프절은 조직학적으로 염증 변화가 없는 림 프절 조직임을 확인하였고, 공초점 현미경으로 관찰하였을 때 붉은 색 형광이 관찰되었다. 결론: 이번 동물 실험 연구 를 통하여 위 감시 림프절 탐색에 형광자성나노입자를 이용 할 수 있음을 확인하였다. 위암 동물 모델에 적용하는 추가 연구가 필요하다.
색인단어: 감시 림프절, 형광자성나노입자
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