Tunicamycin 이 돼지정자의 생존성, 미토콘드리아 활성, 정자의 운동성에 미치는 영향

(1)

www.earticle.net

Tunicamycin 이 돼지정자의 생존성, 미토콘드리아 활성, 정자의 운동성에 미치는 영향

이아성^1# · 이상희^2# · 이승형^1* · 양부근¹

강원대학교 동물생명과학대학¹, 강원대학교 동물자원공동연구소²

Effect of Tunicamycin on Sperm Viability, Mitochondrial Activity and Motility in Boar Semen

A-Sung Lee^1#, Sang-Hee Lee^2#, Seunghyung Lee^1* and Boo-Keun Yang¹

1College of Animal Life Sciences, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea

2Institute of Animal Resources, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea

ABSTRACT¹⁾

This study was to investigate effect of tunicamycin (TM) on sperm viability, mitochondrial activity and motility in boar semen. Collected sperm were incubated with semen extender containing 0, 1, 2, and 5 μM TM for 3, 6 and 9 h. Sperm viability was analyzed using SYBR14/PI doubling staining, and mitochondrial activity was detected using Rhodamine123/PI staining methods. Sperm viability, mitochondrial activity and motility were measured every 3 h during incubation. In results, boar sperm viability, mitochondrial activity and motility were significantly decreased in 2 and 5 μM TM groups compare to control group at all incubation time (p<0.05). In addition, mitochondrial activity and motility were significantly decreased in 1, 2, and 5 μM TM groups compare to control group at 9 h after incubation (p<0.05). These results suggest that TM can inhibit sperm viability, mitochondrial activity and motility in boar semen, and it may influence on the fertility of sperm.

(Key words: Tunicamycin, Sperm viability, Mitochondrial activity, Sperm motility)

Ⅰ. 서론

Tunicamycin(TM)은 endoplasmic reticulum(ER) stress 를 유도하는데 사용되는 뉴클레오티드계 항생물질의 혼합물 로 약 10개의 동족체를 가지고 있다(Abraham et al., 2011;

Zhang et al., 2012a). 세포 내 polypeptide에서 N-linked glycosylation을 억제함으로써 ER 단백질의 mis-folding을

유도하여 ER stress를 활성화 시킨다고 알려져 있으며, 이 러한 반응에 의해 ER에서 분비된 인자들은 세포 원형질막 에 존재하는 세포사멸 수용체와 결합하거나 미토콘드리아 의 세포사멸 인자들을 활성화 시켜 세포를 사멸을 일으킨 다고 알려져 있다(Zhang et al., 2011; Kim et al., 2012;

Zhang et al., 2012b). Tunicamycin은 주로 ER stress로부 터 발생하는 세포 신호기작 또는 질병을 연구에 이용되고

* Corresponding author: Seunghyung Lee, College of Animal Life Sciences, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea.

Tel: +82-33-250-8637, E-mail: [email protected]

# These authors contributed equally.

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.ko), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. The moral rights of the named author(s) have been asserted.

[Provider:earticle] Download by IP 118.70.52.165 at Monday, December 20, 2021 7:51 PM

(2)

www.earticle.net

12 Ann. Anim. Resour. Sci. Vol. 29 (1), 2018

있으며, 다양한 화학 요법에 쓰이는 약품들과 함께 결합 하여 간암세포의 성장과 증식에 관련된 세포신호기작을 억제시키는데 이용된다고 보고되었다(Hou et al., 2013).

Tunicamycin을 특정적인 질병의 치료를 위해 다양하게 사용되고 있지만, 그 외, 간접적으로 영향을 미치는 연구 가 미흡한 상태이다. 따라서 tunicamycin이 생리적인 현 상의 변화와 남성 불임의 원인을 초래할 수 있는지를 조 사하는 것은 tunicamycin의 지속적인 연구진행을 위해 중 요하다.

일반적으로 TM은 X-box-binding protein 1(XBP-1) mRNA splicing을 유도하며 돼지 및 쥐 배아의 발달을 저 해해 배반포 단계까지의 발생률을 떨어트리며(Abraham et al., 2011; Kim et al., 2012), 돼지 embryonic fibroblast cell에서 ER stress 유도는 세포사멸을 촉진하여 세포의 생존율을 저하시키는 것으로 보고되었다(Zhang et al., 2011). 또한 암양의 번식 능력에는 영향을 주지 않지만, 숫양의 seminiferous tubule epithelium의 손상 및 testicular 수축을 유도한다고 알려져 있다(Stewart et al., 1998). 또한, 돼지 난자와 정자의 수정과정에서 TM은 난 자성숙에 영향을 끼치지 않지만, N–glycosylation을 억제 를 하여 정자와 투명대의 결합률과 침투속도를 저해한다 고 보고되었다(Sakaguchi et al., 2010; Lay et al., 2011).

수컷의 생식 세포인 정자는 다음 세대로 유전자를 전달 하기 위해 분화된 세포로 일반 체세포와 다른 구조적 특 성을 지니고 있다. 정자는 난자에 DNA를 전달하기 위하 여 스스로 운동성을 유지해야하기 때문에 분화 과정에서 편모가 발달되며, DNA 운반에 불필요한 세포 소기관인 ribosomes, golgi apparatus 및 ER은 정자 분화과정에서 퇴화하며 탈락되고, 대신 에너지를 생산에 필요한 미토콘 드리아가 발달되는 형태로 분화된다(Steinberger, 1971;

Grootegoed et al., 2000; Schwarz and Blower, 2016). 그 러나 ER이 정자의 기능에 미치는 영향에 대한 연구는 미 흡한 실정이다. 따라서 본 연구는 ER stress를 유도하는 TM이 정자 생존성, 미토콘드리아 활성 및 운동성에 미치 는 영향에 대하여 검토하여 질병치료 및 억제제로 사용되 는 물질이 생식기관에 어떠한 영향을 미치는지를 명확하 게 알아보고자 실시하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

본 실험에 사용된 tunicamycin(TM)은 Sigma-Aldrich

(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 실험동물 진행은 강원대학교에서 승인된 실험동물윤리(KIACUC-09-0139)에 따라 진행하였다.

1. 정액 준비

실험에 사용된 정액은 9마리(평균연령 28.2±3.4월) Duruc×Yorkshire×Landrace 3원교잡 수컷으로부터 음경 수압법을 이용하여 채취하였으며, beltsville thawing solution (BTS; 37mg/mL glucose, 1.25mg/mL EDTA, 6mg/mL sodium citrate, 1.25mg/mL sodium bicarbonate, 0.75mg /mL potassium chloride, 0.6mg/mL penicillin 및 1mg/

mL streptomycin)로 희석한 후 실험실로 운반하여 실험 에 이용하였다. BTS를 이용하여 2.0×10⁶개/mL로 희석된 정액에 0, 1, 2 및 5μM 되도록 TM을 처리한 후 37℃의 5% CO2 환경에서 3, 6 및 9 시간 동안 배양하였으며, 배 양 시간마다 정자 생존성, 미토콘드리아 활성 및 운동성 을 검사하였다.

2. 정자의 생존성

정자의 생존성은 SYBR-14(Invitrogen, Eugene, OR, USA) 및 propidium iodide(PI; Invitrogen) 이 중 염색법 을 이용하여 실시하였다(Lee and Park, 2015). 100μL의 정 액 샘플에 5μL의 SYBR-14(10μL/mL in DMSO)와 섞고 10분간 암실에서 배양한 후, 5μL의 2.4mM PI와 혼합하여 10분간 다시 배양하였다. 이 후 슬라이드 글라스에 분주 된 시료는 형광 현미경(Zeiss Axioskop, Jena, Germany) 을 이용하여 녹색을 형광을 띄는 정자를 생존 정자, 붉은 색 형광을 띄는 정자를 사멸 정자로 판정하였으며, 최소 500개 이상의 정자를 관찰한 후 생존율로 나타내 주었다 (Fig. 1A).

3. 미토콘드리아 활성 검사

Rhodamin123(R123; Sigma) 및 PI 이중 염색 방법을 이 용하여 정자의 미토콘드리아 기능을 판정하였다. 3μL의 R123(0.1mg/mL)을 1mL의 정액 시료에 첨가한 후 37℃에 서 15분간 배양한 후 원심 분리하여 상층액을 제거한 다 음 500μL BTS와 2.4mM PI 10μL를 첨가 한 뒤 10분간 배 양하였다. 이 후 슬라이드 글라스에 분주 된 시료는 형광 현미경(Ziess Axioskop) 각각의 필터(R123; 490/515nm, PI;

(3)

www.earticle.net

Fig. 1. Sperm viability was measured by SYBR-14/propidium iodide double staining assay (A), and mitochondrial membraene activity was analyzed using rhodamin123/propidium iodide double staining assay (B). Viable sperm was stained with green-fluorescent dye (SYBR-14) and dead sperm was stained red-fluorescent (A). Green-fluorescent dye (rhodamin123) at the mid-piece region of sperm indicates normal mitochondrial activity red-fluorescent dye (propidium iodide) sperm indicates abnormal mitochondrial function (B). White scale bar = 0.1 μm.

545/590nm)를 이용하여 최소 500개 이상의 정자를 관찰 하였다. 중편부가 녹색 형광을 띄는 정자를 미토콘드리아 의 기능이 정상인 것으로 판단하였으며, 두부가 붉게 염 색된 정자를 사멸 정자로 판단하였다(Fig. 1B).

4. 정자 운동성

정자의 운동성은 37℃로 미리 가온 시킨 슬라이드 글라 스 위에 정액 시료를 20μL를 분주 한 후 cover glass를 덮 은 뒤 위상차 현미경(Nicon Eclipse TE300, Tokyo, Japan) 을 이용하여 200배 배율에서 관찰하였다. 정자의 미부가 움직이는 정자를 정상 운동성이 있는 정자로 판단하였으 며, 최소 500개 이상의 정자를 관찰하여 백분율로 결과를 나타내었다(Ax et al., 2000).

5. 통계처리

실험의 결과는 평균과 표준 오차(mean±SEM, n=9)로 나타냈으며, 통계 분석은 statistical analysis system software version 9.2(SAS Institute Inc. USA)를 이용하한 분산 분석을 실시한 후, duncan 다중검정을 실시하여 처 리구간의 유의성을 검정하였다.

Ⅲ. 결과

1. Tunicamycin(TM)이 정자의 생존성의 미치는 영향

정자의 배양시간 별 TM이 정자의 생존성에 미치는 영 향을 Table 1에 나타내었다. 1μM 처리구에서는 배양시간 에 관계없이 대조구와 유의적인 차이가 나타나지 않았지 만, 2 및 5μM TM 처리구에서는 대조구와 비교하여 유의 적으로 감소하였다(p<0.05).

2. 정자의 미토콘드리아 활성에 미치는 tunicamycin (TM)의 영향

TM처리에 따른 정자의 미토콘드리아 활성에 대한 결과 를 Table 2에 나타내었으며, 1μM TM 처리구에서는 미토 콘드리아 활성이 배양 3 및 6 시간 때에는 대조구와 유의 적인 차이가 나타나지 않았으나 배양 9시간 때에는 대조 구와 비교하여 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 또한 2 및 5μM TM을 처리하였을 때, 배양시간과 관계 없이 모든 처리구에서 미토콘드리아 활성이 유의적으로 감소하는 것 으로 나타났다(p<0.05).

(4)

www.earticle.net

Table 1. Effect of tunicamycin on boar sperm viability

Tunicamycin concentration (μM) Viability (%)

3 h 6 h 9 h

0 64.4â±1.0 54.0â±0.7 45.5â±1.0

1 61.6â±2.4 54.7â±0.8 43.7â±1.4

2 51.5^b±2.5 44.1^b±2.1 34.0^b±1.2

5 44.2^c±1.5 37.4^c±1.2 28.2^c±0.9

a~cValues with different superscripts within same column are significantly different, p<0.05.

Table 2. Effect of tunicamycin on mitochondrial activity of boar sperm

Tunicamycin concentration (μM) Mitochondrial activity (%)

3 h 6 h 9 h

0 58.3â±2.3 50.1â±1.9 45.4â±0.9

1 57.0^a±0.5 48.8^a±2.7 33.4^b±1.4

2 43.7^b±1.5 34.4^b±0.8 21.6^c±0.9

5 41.7^b±1.4 33.0^b±1.0 19.7^c±0.7

Table 3. Effect of tunicamycin on boar sperm motility

Tunicamycin concentration (μM) Motility (%)

3 h 6 h 9 h

0 88.3â±1.1 77.7â±3.6 57.7â±1.4

1 85.5^ab±1.7 70.0^a±5.2 48.8^b±2.6

2 80.5^bc±2.4 65.5^ab±4.4 46.6^b±4.0

5 77.7^c±2.2 56.6^b±3.3 27.7^c±2.7

3. Tunicamycin(TM)이 정자 운동성에 미치는 영향

정자의 운동성은 TM의 농도 의존적으로 감소하는 것으 로 나타났다(Table 3). 3시간 배양 시, 2 및 5μM TM 처리 구가 대조구에 비해 정자의 운동성이 유의적으로 감소하 였으며(p<0.05), 6시간 배양 시, 5μM TM 처리구가 대조구 와 비교하여 유의적으로 낮은 운동성 나타났다(p<0.05).

또한 배양 9시간 때에는 TM의 모든 처리구에서 대조구에 비하여 유의적으로 낮은 운동성을 나타냈다(p<0.05).

Ⅳ. 고찰

수컷 생식세포인 정자는 암컷의 생식기관 내에 사출되 어 배란된 난자까지 이동해 수정 후 부계의 유전정보를 다음세대로 전달하는 역할을 한다(Bungum et al., 2006). 체

세포인 정원세포(spermatogonia)는 정모세포(spermatocyte) 로 분화되며, 최종적으로 염색체 개수의 절반이 되는 정세 포(spermatid)로 분화하게 되는데 이러한 과정을 spermato- genesis라고 정의한다(Grootegoed et al., 2000). 이 후 정 세포는 운동성을 획득하기 위하여 형태학적인 변형이 일 어나게 되는데 핵의 한쪽 방향으로 golgi apparatus가 모 여 첨체를 형성하며, 정반대로 부분에 중심소체(centriole) 가 위치하게 되며, 세포 소기관인 미토콘드리아, ribosome 및 ER 등이 중심소체 쪽으로 이동하게 된다(Grootegoed et al., 2000). 이때 정자는 편모가 형성되며 미토콘드라아 는 정자의 중편부에 모이게 되며 기타 세포 소기관들은 세포소적(droplet)의 형태로 정자 중편부에 붙어 있다가 탈락되게 되며, 최종적으로 운동성을 얻게 되는데 이러한 과정을 spermio-genesis라고 정의한다(Hess and de Franca, 2009).

정자는 spermato-genesis 및 spermio-genesis의 과정을

(5)

www.earticle.net

거치면서 유전정보 전달에 불필요한 세포 소기관은 탈락 되거나 제거된다(Hess and de Franca, 2009). 최종적으로 정자는 전체 세포를 둘러싸고 있는 원형질막, 정자의 두 부 앞쪽 방향을 감싸고 있는 첨체 및 첨체막, 유전정보를 함유하고 있는 핵과 이를 둘러싸고 있는 핵막, 운동 에너 지를 생산하기 위한 중편부에 위치한 미토콘드리아와 이 를 둘러싸고 있는 미토콘드리아 막 그리고 운동성을 갖는 편모로 이루어진 미부로 구성된다(Steinberger, 1971;

Grootegoed et al., 2000). 따라서 정자의 ribosome, golgi apparaturs 및 ER등과 관련된 세포신호기작은 일반 체세 포에 비하여 상이하다고 보고되었다(Salicioni et al., 2007). 몇몇 연구에서는 정자에서 ER-marker로 알려진 calreticulin이 존재하고 주로 미토콘드리아 바깥쪽으로 적 은 양이 위치해 있다고 알려진 바 있다(Nakamura et al., 1993; Carreau et al., 2010). 하지만 대부분의 연구에서는 정원세포에 존재하던 세포 소기관 중 미토콘드리아를 제 외한 나머지는 세포소적의 형태로 정자에서 분리된다고 밝히고 있다(Hess and de Franca, 2009). 이러한 결과를 종합하여 보았을 때 정자의 경우 소량의 ER이 정자 중편 부에 존재할 수 있다고 판단된다. TM은 정원세포, 정모세 포, leydig 세포, steroil 세포 및 상피세포와 같은 수컷 생 식기관 내에 존재하는 체세포에서 부정적인 역할을 미치 며 ER stress 유도하여 정자 형성을 억제한다고 알려져 있 다(Stewart et al., 1998). 하지만 spermato-genesis 및 spermio-genesis가 완료되어 ER이 존재하지 않는 정자에 서 ER stress를 유도한다고 알려진 TM의 부정적인 영향 이 없을 것이라 예상하였지만 본 연구결과에서는 사출된 정자에서 TM이 생존성, 미토콘드리아의 활성 및 운동성 에 악영향을 미치는 것을 확인하였다.

ER stress에 의하여 세포 내에는 칼슘 이온, 프리 라디 컬 및 다양한 인자들이 분비되어 세포의 사멸과 관련된 apoptosis 신호기작에 직접적으로 관여한다고 알려져 있 다(Tabas and Ron, 2011; Chaudhari et al., 2014). ER stress에 의해 분비되는 칼슘 이온, caspase family, Bax 및 프리 라디컬은 미토콘드리아의 apoptosis 경로를 자극 하여 세포사멸을 유도하며, apoptosis 세포 수용체와 결합 되는 Fas를 포함한 다수의 물질들이 분비되어 미토콘드리 아 의존적인 세포사멸을 유도한다고 알려져 있다(Tabas and Ron, 2011). 이 외에도 unfolded protein, 염증작용 및 신경퇴화에 대한 연구도 활발하게 이루어지고 있으나, ER stress에 의한 수컷 생식세포의 연구는 아직까지 활발 하게 이루어지지 않고 있는 실정이다(Hou et al., 2013).

정자의 둘러싸고 있는 원형질막은 대사에 필요한 이온 물질의 교환을 비롯한 다양한 생리학적인 역할을 담당하 고 있기 때문에 정자의 생존과 밀접한 관련이 있다고 알 려져 있다(Lee et al., 2010; Lee et al., 2017). 본 연구에서 는 SYBR14 및 PI 이중 염색법을 이용하여 원형질막이 손 상되지 않은 정자에만 SYBR14가 정상적으로 결합되는 원 리를 이용해 생존율을 판단하는데 사용하였다(Baumber et al., 2000). 그 결과 TM을 2μM 이상 첨가하였을 때 원 형질막이 손상되는 것을 확인하였다. 사출된 정자의 경우 spermato-genesis 및 spermio-genesis 과정을 거쳐 ER이 제거 되었는데도 불구하고 TM에 의하여 원형질막이 손상 된 것으로 보았을 때 TM이 정자의 원형질막에 영향을 미 친다고 판단되며, 향 후 TM과 원형질막의 관계에 대한 연구가 필요하다고 판단된다.

정자는 중편부에 위치한 미토콘드리아에서 생산되는 에 너지를 이용하여 운동성을 얻게 된다(Bungum et al., 2006). 또한 미토콘드리아는 다양한 세포신호기작에 관여 한다고 알려져 있으며, 이 중 apoptosis 신호기작은 세포 의 생존과 밀접한 관련이 있다(Chaudhari et al., 2014). 정 자의 경우 ER이 존재하지 않기 때문에 ER stress와 관련 된 미토콘드리아 기능이 연관되지 않을 것이라 예상하였 으나, 본 실험결과를 통해 TM은 미토콘드리아의 활성을 억제시켰으며, 특히 배양 9시간 때에는 1μM의 TM이 미 토콘드리아의 활성을 감소시키는 것으로 확인하였다. 또 한 배양 9시간째 정자의 생존율과 미토콘드리아 활성을 비교하여 보았을 때 원형질막에 비하여 미토콘드리아에 더욱 민감하게 작용하였다. 이러한 이유는 정원세포 세포 질에 존재하는 ER을 포함한 소기관들이 spermio-gensis 과정을 거치면서 중편부로 이동되었기 때문이라고 사료된 다. 실제로 ER에 존재하는 calreticulin 단백질은 사출된 정자에서 발견되었으며, 중편부 바깥쪽에는 소량의 ER이 위치해 있다고 보고되었다(Carreau et al., 2010; Nakamura et al., 1993). 이러한 연구결과들을 종합하여 보았을 때 정 자의 중편부 미토콘드리아 주변에 위치한 ER은 TM에 의 하여 ER stress가 유도되었고, 이에 따라 XBP-1이 미토콘 드리아 의존적 apoptosis를 유도시켜 미토콘드리아의 활 성을 억제시켰다고 생각된다(Abraham et al., 2011; Kim et al., 2012). 향 후 정자에서 XBP-1와 미토콘드리아 의존 적 apoptosis에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 판단된 다. 본 연구결과에서는 돼지 정자 중편부에 ER의 존재 여 부까지는 확인하지 못하였다. 하지만 TM은 정자의 미토 콘드리아 활성에 악영향을 미쳤으며, 미토콘드리아 에너

(6)

www.earticle.net

지 생산과 관련된 정자의 운동성도 감소된 것을 확인하였 다.

본 연구는 ER stress를 유발한다고 알려진 TM이 정자 에 미치는 영향에 대해 알아보았으며, 특히 ER이 존재하 지 않는 생식세포인 정자에서 TM의 부정적인 역할에 대 해 알아본 연구이다. TM을 이용한 다양한 치료법과 항생 제의 이용은 과거에 비해 감소한 것은 사실이지만, 아직 까지 ER stress를 유발하는 물질로 연구에 이용되고 있고 암 치료 목적으로 연구되는 물질 중 하나이다(Hou et al., 2013). 본 연구결과를 바탕으로 ER stress를 유발하는 다 른 물질들 역시 ER이 존재하지 않는 세포의 원형질막과 미토콘드리아에도 악영향을 미칠 수 있다는 것을 시사하 고 있으며, 특히 인간의 암을 포함한 질병을 치료하는데 있어 다른 복합물과 함께 TM이 사용될 경우 정자에 부정 적인 역할을 미칠 수 있으며, 동물의 경우 첨가 및 질병치 료 목적에 있어 TM을 사용할 시 수컷 생식세포에 악영향 을 미칠 수 있다고 판단된다. 따라서 본 연구결과를 종합 하여 보았을 때 TM은 돼지 정자의 생존율, 미토콘드리아 의 활성 및 운동성에 부정적인 영향을 미치며, ER이 존재 하지 않는 세포의 원형질막과 미토콘드리아에 악영향을 미친다고 생각된다.

Ⅴ. 요약

본 연구는 돼지 정액에 있어 tunicamycin(TM)이 정자 의 생존성, 미토콘드리아 활성 및 운동성에 미치는 영향 을 검증하였다. 채취된 돼지 정액은 0, 1, 2, 및 5μM의 TM이 함유된 정액 희석액 내에서 3, 6 및 9시간동안 배양 되었다. 정자의 생존성은 SYBR14/PI 이중 염색을 이용하 여 분석되었으며, 미토콘드리아 활성은 Rhodamine123/PI 염색을 이용하여 확인되었다. 정자 생존성, 미토콘드리아 활성 및 운동성은 배양시간동안 3시간마다 측정되었다.

그 결과 돼지 정자 생존성, 미토콘드리아 활성 및 운동성 은 모든 배양시간동안 대조구에 비해 2 및 5μM TM 처리 구들에서 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 또한 미토콘드 리아 활성 및 운동성은 배양 후 9시간 때 대조구에 비해 1, 2, 및 5μM TM 처리구에서 유의적으로 감소하였다 (p<0.05). 이러한 결과는 돼지 정액에서 TM이 정자 생존 성, 미토콘드리아 활성 및 운동성을 억제할 수 있으며, 정 자의 수정능력에 영향을 미칠 것으로 판단된다.

사사

본 연구는 한국연구재단 이공분야기초연구사업(NRF- 2017R1D1A3B03036349)의 지원을 받아 수행되었습니다.

Ⅵ. 참고문헌

1. Abraham, T., Pin, C. L. and Watson, A. J. 2011.

Embryo collection induces transient activation of XBP1 arm of the ER stress response while embryo vitrification does not. Mol. Hum. Reprod. 18:229-242.

2. Ax, R., Dally, M., Didion, B., Lenz, R., Love, C., Varner, D., Hafez, B. and Bellin, M. E. 2000. Semen evaluation. In Reproduction in Farm Animals, E, Hafez (Ed.), 7th ed., Blackwell Publishing, South Carolina, U.S.A. pp. 363-375.

3. Baumber, J., Ball, B. A., Gravance, C. G., Medina, V.

and Davies-Morel, M. C. 2000. The effect of reactive oxygen species on equine sperm motility, viability, acrosomal integrity, mitochondrial membrane potential, and membrane lipid peroxidation. J. Androl. 21:

895-902.

4. Bungum, M., Humaidan, P., Axmon, A., Spano, M., Bungum, L., Erenpreiss, J. and Giwercman, A. 2006.

Sperm DNA integrity assessment in prediction of assisted reproduction technology outcome. Hum.

Reprod. 22:174-179.

5. Carreau, S., Wolczynski, S. and Galeraud-Denis, I.

2010. Aromatase, oestrogens and human male reproduction. Philos. Trans. R. Soc. B. 365:1571-1579.

6. Chaudhari, N., Talwar, P., Parimisetty, A., d’Hellencourt, C. L. and Ravanan, P. 2014. A molecular web: endoplasmic reticulum stress, inflammation, and oxidative stress. Front. Cell.

Neurosci. 8:1-15.

7. Grootegoed, J. A., Siep, M. and Baarends, W. M.

2000. Molecular and cellular mechanisms in spermatogenesis. Best Pract. Res., Clin. Endocrinol.

Metab. 14:331-343.

8. Hess, R. A. and de Franca, L. R. 2009. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. In

(7)

www.earticle.net

Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C, Y.

Cheng (Ed.), Springer, New York, U.S.A. pp. 1-15.

9. Hou, H., Sun, H., Lu, P., Ge, C., Zhang, L., Li, H., Zhao, F., Tian, H., Zhang, L. and Chen, T. 2013.

Tunicamycin potentiates cisplatin anticancer efficacy through the DPAGT1/Akt/ABCG2 pathway in mouse Xenograft models of human hepatocellular carcinoma. Mol. Cancer Ther. 12:2874-2884.

10. Kim, J. S., Song, B. S., Lee, K. S., Kim, D. H., Kim, S. U., Choo, Y. K., Chang, K. T. and Koo, D. B.

2012. Tauroursodeoxycholic acid enhances the pre‐

implantation embryo development by reducing apoptosis in pigs. Reprod. Domest. Anim.

47:791-798.

11. Lay, K., Ashizawa, K., Nakada, T. and Tatemoto, H.

2011. N-glycosylation of zona glycoproteins during meiotic maturation is involved in sperm-zona pellucida interactions of porcine oocytes.

Theriogenology 75:1146-1152.

12. Lee, A. S., Lee, S. H., Lee, S. and Yang, B. K. 2017.

Effects of streptozotocin, bisphenol A and diethylstilbestrol on production of reactive oxygen species and lipid peroxidation in the boar sperm.

Bio. Sci. Lett. 23:128-132.

13. Lee, S. H. and Park, C. K. 2015. Effect of magnetized extender on sperm membrane integrity and development of oocytes in vitro fertilized with liquid storage boar semen. Anim. Reprod. Sci.

154:86-94.

14. Lee, S. H., Lee, J. H., Cheong, H. T., Yang, B. K., Kim, H. M., Lee, S. B., Kwon, S. S., Choi, S. K., Sim, J. M., Kim, J. D. and Park, C. K. 2010. Effect of brine mineral water on sperm preservation in miniature pig. Ann. Anim. Resour. Sci. 21:19-25.

15. Nakamura, M., Moriya, M., Baba, T., Michikawa, Y., Yamanobe, T., Arai, K., Okinaga, S. and Kobayashi, T. 1993. An endoplasmic reticulum protein, calreticulin, is transported into the acrosome of rat sperm. Exp. Cell Res. 205:101-110.

16. Sakaguchi, Y., Uzuhashi, R., Iwata, H., Monji, Y.

and Kuwayama, T. 2010. Changes in the sperm-zona pellucida binding properties during porcine oocyte maturation. J. Mam. Ova. Res. 27:130-135.

17. Salicioni, A. M., Platt, M. D., Wertheimer, E. V., Arcelay, E., Allaire, A., Sosnik, J. and Visconti, P. E.

2007. Signalling pathways involved in sperm capacitation. Proceedings of 2007 Annual Congress of Society of Reproduction and Fertility, pp. 245-249.

18. Schwarz, D. S. and Blower, M. D. 2016. The endoplasmic reticulum: structure, function and response to cellular signaling. Cell. Mol. Life Sci.

73:79-94.

19. Steinberger, E. 1971. Hormonal control of mammalian spermatogenesis. Physiol. Rev. 51:1-22.

20. Stewart, P., Jago, M., Dufty, J. and Peterson, J. 1998.

Lack of effect of tunicamycin on spermatogenesis in rams. Aust. Vet. J. 76:289-290.

21. Tabas, I. and Ron, D. 2011. Integrating the mechanisms of apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress. Nat. Cell Biol. 13:184-190.

22. Zhang, J. Y., Diao, Y. F., Kim, H. R. and Jin, D. I.

2012a. Inhibition of endoplasmic reticulum stress improves mouse embryo development. PLoS One 7:e40433.

23. Zhang, J. Y., Diao, Y. F., Oqani, R. K., Han, R. X.

and Jin, D. I. 2012b. Effect of endoplasmic reticulum stress on porcine oocyte maturation and parthenogenetic embryonic development in vitro.

Biol. Reprod. 86:1-9.

24. Zhang, J. Y., Lee, K. S., Kim, J. S., Song, B. S., Jin, D. I., Koo, D. B. and Yu, K. 2011. Functional characterization of the ER stress induced X-box-binding protein-1 (Xbp-1) in the porcine system. BMC Mol. Biol. 12:1-11.

(Received 09 January 2018, Revised 20 February 2018, Accepted 21 February 2018)