Nicotinic Acid가 동결 융해된 소 정액의 성상능력에 미치는 영향

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Nicotinic Acid가 동결 융해된 소 정액의 성상능력에 미치는 영향

김유진․이상희․양진우․이연주․최수빈․이경진․이승형․박춘근^* 강원대학교 동물생명과학대학

Effect of Nicotinic Acid on Frozen-Thawed Sperm Characteristics in Bulls

Yu-Jin Kim, Sang-Hee Lee, Jin-Woo Yang, Yeon-Ju Lee, Su-Bin Choi, Kyung-Jin Lee, Seunghyung Lee and Choon-Keun Park^*

College of Animal Life Sciences, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea

ABSTRACT¹⁾

The objective of this study was to investigate the efficiency of nicotinic acid during in vitro fertilization (IVF) in frozen-thawed bull sperm . The ejaculated semen was diluted with Triladyl containing 20% egg-yolk and cryopreserved in liquid notrigen. The frozen sperm was thawed for 45 seconds in the 38℃ water bath.

Sperm was diluted with IVF medium (Bovine-Oviduct medium; BO) containing 0, 15, 30 and 60 mM nicotinic acid (NA), which were incubated at 39℃, 5% CO2for 0, 0.5, 1, 2 and 4h. The characteristics of frozen-thawed sperm were estimated with SYBR14/PI double staining for viability, FITC-PNA/PI for outer acrosomal membrane damage and Rhodamine123/PI for mitochondrial integrity using flow cytometry. And the sperm ability was analysed by Coomassie brilliant blue (CBB) staining for acrosome reaction state and Rose bengal staining for abnormality. Acrosome reaction and abnormality were analyzed using a microscope. In results, sperm viability was significantly higer in 30 mM group than 0 and 15 mM groups at 1 and 2 h (p<0.05).

Outer acrosomal membrane damage was significantly lower in 30 mM group than 0 and 15 mM groups at 1, 2 and 4 h (p<0.05). And mitochondrial integrity was significantly higher in 30 mM group than 0 and 15 mM groups at 2 and 4 h (p<0.05). Also, acrosome reaction was significantly lower in 30 mM than 0 and 15 mM groups at 1 and 2 h (p<0.05) and abnormality was lower NA groups than 0 group at 1 h (p<0.05). In couclusion, we suggest that using the thawing medium containing NA for sperm dilution can be benefical for IVF in bulls.

(Keywords: Bull, Frozen-thawed semen, Nicotinic acid, Sperm Characteristics)

Ⅰ. 서론

동결정액은 장기간 보존할 수 있는 장점을 지니고 있기 때문에, 경제동물의 개량과 생산성 향상(Fraser 등, 2014) 및 멸종위기에 처한 종의 유전자원 보존(Kaneko 등, 2014) 에 이용되고 있다. 그러나, 동결 및 융해과정 동안 일어

나는 화학적 및 물리적 충격은 정자의 세포막 손상 (Bernardini 등, 2011)을 주며, 수분과 삼투압 충격 및 온도 변화로 인해 활성산소(Reactive oxygen species; ROS)가 유 도(Guthrie 와 Welch, 2012)된다. 과도하게 생성된 hydroxyl radicals(OH), superoxide anion(O2-), hydrogen peroxide (H2O2)과 같은 ROS 는 세포의 apoptosis 를 유발하여 동

* Corresponding author: Choon-Keun Park, Dept. of Animal Bioyechnology, College of Animal Life Science, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea. Tel: +82-33-250-8627, E-mail: [email protected]

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결보존된 정자의 생존율을 감소시킬 뿐만 아니라(Baumber 등, 2000) 첨체반응을 증가시키며(Ferraz 등, 2011), DNA 를 손상되어(Meseguer 등, 2011) 기형정자의 비율이 증가 하게 된다(Partyka 등, 2012a). 또한, ROS 는 미토콘드리아 내에서 에너지를 생산하는 과정 중에 발생하지만, 과도한 ROS 가 생성되는 경우에는 미토콘드리아 내에서 보다 많 은 에너지를 생성하기 때문에(Ferramosca 등, 2013) 미토 콘드리아의 빠르게 약화된다(Cui 등, 2011). 정자의 운동성 은 미토콘드리아의 활성으로 생성되는 ATP 공급으로 이루 어지는데(Piomboni 등, 2012), 미토콘드리아의 활성이 약 해졌을 경우에는 운동성의 감소(Dietrich 등, 2012)로 수정 능력을 잃은 정자의 비율이 증가하게 된다(Peña 등, 2012).

소의 체외수정의 경우 성숙된 난자를 정자와 체외에서 16-18 시간 동안 공배양(Co-culture)하여 수정을 유기하는 방법(Baldoceda-Baldeon 등, 2014; Valckx 등, 2015)을 널리 이용하고 있으며, 이는 사람(Yeung 등, 2014), 돼지 (Appeltant 등, 2015) 등과 같은 다른 포유동물 체외수정에 비해 공배양 시간이 길기 때문에 체외 수정시간 동안 정자 의 안정적인 성상능력은 수정율과 매우 밀접한 관련이 있 다(Takeo 등, 2014). 하지만 동결정액의 경우 신선정액에 비해 융해 후 정자의 성상능력이 감소하기 때문에 동결보 존의 효율을 증진시키기 위해 항산화 효소와 같은 동해 보 호제를 첨가(Viveiros 등, 2012; Tuncer 등, 2013)하여 고품 질의 동결정액을 생산하는 연구는 많이 이루어져 왔으나 정자의 성상능력을 향상시키는 연구(Yamaguchi 와 Funahashi, 2012)는 미흡한 실정이다.

Nicotinic acid(NA)는 비타민 B3 이며, nicotinamide adenine dinucleotide(NAD)의 전구체로서, 미토콘드리아 활성에 참여하는 조효소 NAD phosphate(NADP)를 규제 한다(Walseth 등, 2012). 또한, TCA 사이클의 메커니즘에 참여하여 에너지를 생산하는 데에 도움을 주는 항산화제 이다(Lin 등, 2012). 이전 연구에서는 돼지의 정액을 동결 시 동결첨가제로 NA 를 첨가하여 융해하였을 때, 생존율, 첨체반응율 및 미토콘드리아 온전성에서 NA 를 첨가한 그 룹에서 정액의 질을 높이는데 효과가 있었다(Kim 등, 2015). 또한 돼지의 액상정액에 NA 를 첨가하여 정액의 보 존성을 평가한 결과, NA 가 정자의 생존율, 첨체반응율 및 미토콘드리아 온전성에 긍정적인 효과가 있다는 것이 보 고되었다(Lee 등, 2014). 따라서 신선정자에 비해 성상능력 이 떨어지는 동결-융해 된 정자의 성상능력을 향상시킬 수 있다면, 다른 종에 비하여 체외에서 수정되는 시간이 긴 소의 체외수정 효율이 증진될 것이라 판단하여, 본 연구에

서는 NA 가 소의 체외수정 배양액과 희석된 동결-융해 정 자의 성상능력에 미치는 영향에 대하여 조사하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

동물실험은 유럽 실험동물취급 면허교재(Baumans 등, 1997)에서 제시된 윤리적이고 과학적인 절차에 따라서 수 행하였으며, 강원대학교 동물실험윤리위원회의 승인(No:

KIACUC-09-0139)을 얻었다.

1. 정액의 채취 및 동결과 융해

인공질을 이용하여 3마리의 한우에서 정액을 채취한 뒤 38℃로 20% egg-yolk가 첨가된 Triladyl(Triladyl^®, Minitube, Germany)에 희석 후, 2시간 동안 0.3℃을 유지하여 실험실 로 운반한 후 4℃에서 18시간동안 평형과정을 거친 후 동 결보존 하였다. 동결보존에 사용된 정액은 70% 이상의 생 존율과 80% 이상의 운동성을 가진 정자만을 사용하였으 며, 20% egg-yolk가 첨가된 Triladyl를 이용하여 정자의 최 종농도를 5.0x10⁷sperm/mL가 되도록 하였다. 그 후 0.5mL straw에 정액을 주입하여 -120℃에서 10분동안 예비동결 후 액체질소에 침지하여 -196℃에서 보관하였다. 정액분석 을 위하여 동결된 정액은 38℃로 예열된 water-bath에서 45초동안 융해 후 Beltsville thawing solution(BTS;

205.4mM glucose, 3.358mM EDTA, 20.4mM sodium citrate, 14.879mM sodium bicarbonate, 10.06mM potassium choride)으로 희석한 후, 1,500rpm에서 5분간 원심분리를 통해 상층액을 제거하는 방식으로 정액샘플을 세척하여 실험에 사용하였다.

2. Bo-medium 준비 및 Nicotinic acid 첨가 후 시간별 배양

실험에 사용할 배양액은 2mg/ml bovine serum albumin(BSA; Sigma, USA)과 0.339mg/mL caffeine (Sigma)이 첨가된 Bovine oviduct medium(Bo-medium;

6.7mg/mL NaCl, 0.23 mg/mL KCl, 2.2mg/mL NaHCO3, 0.15mg/mL L-glutamin, 0.55mg/mL L-lactate, 0.04mg/mL Na-Pyruvate, 0.5µl/mL Gentamicin, 10µl/mL MEM, 20µl/mL BME)에 NA(Sigma)에 NA(Nicotinic acid) 의 최종농도를 0, 15, 30 및 60mM가 되도록 첨가한 후 동 결-융해된 정자의 농도가 5.0×10⁷sperm/mL이 되도록 희석

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한 후 38.5℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 서로 다른 농도의 NA가 첨가된 Bo-medium으로 희석된 정액은 실험 시작 후 0, 0.5, 1, 2 및 4시간 때의 정자의 성상능력을 검사하였다.

3. 생존율, 첨체외막 손상율 및 미토콘드리아 온전성

정자샘플은 BO-medium과 희석하여 5분 동안 1,500 rpm으로 원심분리 후 modified-modena B(glucose 30.0g/L, EDTA 2.25g/L, sodium citrate 6.90g/L, sodium bicarbonate 1.00g/L, Tris 5.00g/L, citiric acid 2.50g/L, cysteine 0.05g/L 및 gentamicin sulfate 0.30g/L)를 이용하 여 정자의 최종농도가 40nM의 SYBR-14(Molecular probes, USA), 2µM Lectin from Arachis hypogagea(FITC-PNA;

Sigma) 및 2µM의 Rhodamine 123(Sigma)를 modified- modena B로 희석된 정액샘플에 첨가하여 5분동안 38℃

암실에서 염색한 후 2µM 의 Propidium iodide(PI; Sigma) 를 추가로 첨가하여 5분동안 38℃ 암실에서 반응시켰다.

이 후 5분 동안 1,500rpm으로 원심분리한 후 상층액을 제 거하고 PBS를 재부유하여 유속세포분석기(flow cytometry; FACSCaliber, BD, USA)를 이용하여 총 10,000 개의 정자의 형광값을 분석하였다. 형광값은 dot-plot 방식 을 이용하여 분석(CellQuest Pro, version 6.0, BD)하였으 며, 생존율 검사는 SYBR-14만이 염색된 정자를 살아있는 정자(alive sperm)로 판단하였다. 그리고 첨체 외막손상율 검사는 전체 정자 중 FITC-PNA의 형광이 발현된 정자를 첨체외막이 손상된 정자(Outer acrosomal membrane damaged sperm)로 판단하였다. 또한 전체 정자 중 Rhodamine 123 형광이 발현되는 정자 비율을 바탕으로 PI 는 염색되지 않고 Rhodamine 123만 염색된 정자는 살아 있는 정자 중 미토콘드리아가 온전한 정자(Mitochondrial integrity)로 판단하여 백분율로 나타내었다.

4. 첨체상태 및 기형율

정자의 첨체상태 및 기형율을 관찰하기 위해 Bo-medium 과 희석된 정자는 5분 동안 1,500rpm으로 원심분리 후 상 층액을 제거하였다. 이 후 PBS를 이용하여 5.0X10⁷sperm/

mL의 농도로 재부유하여 희석한 정자샘플을 slide glass에 도말하여 자연건조시켰다. 정자의 첨체 상태를 관찰하기 위해 50% methanol, 10% acetic acid 및 40%의 증류수로 제조된 용액에 0.25%(w/v) Coomassie Brilliant Bule R-

250가 첨가된 용액(CBB)을 정자가 도말된 slide glass에 분 주하여 자연건조시킨 후 증류수를 이용하여 3회 세척한 후 건조하였다. 위상차현미경을 이용하여 정자두부 첨체부분 에 CBB가 염색되지 않은 정자를 첨체반응이 일어난 정자 (Acrosome reaction)로 판단하여 최소 300개 이상의 정자 를 관찰한 후 백분율로 나타내었다. 정자의 기형율은 slide glass에 정자샘플을 도말하여 3% rose Bengal(Sigma) 용액 을 분주한 후 자연건조 시킨 후 증류수를 이용하여 3회 세 척한 후 건조한 뒤 400배율 위상차현미경을 이용하여 관찰 하였다. 정자기형의 기준은(Ferraz 등, 2011; Oberlender 등, 2012)등의 방법을 참고하여 총 300개 이상의 정자를 관 찰한 후 형태학적으로 기형이 있는 정자의 비율을 백분율 로 나타내었다.

5. 통계분석

본 실험의 결과는 SAS 9.4를 이용하여 general liner mode(GLM)을 적용하여 Duncan 다중검정에 의하여 유의 성을 검정하였다.

Ⅲ. 결과

1. 정자의 생존 능력

NA 가 첨가된 체외수정 배양액과 희석된 동결-융해 정 자의 생존율의 결과를 Fig. 1 에 나타내었다. Fig. 1 에서 보 는 바와 같이 0h 에서는 대조구(0mM, 47.5±1.2%)와 처리 구(15mM, 45.0±1.1%; 30mM, 48.2±1.4%; 60mM, 452±

1.6%)에서는 유의적인 차이가 나타나지 않았으며, 경향 또 한 나타나지 않았다. 하지만, 시간이 경과함에 따라 대조구 에 비해 처리구에서 생존율이 높아지는 경향이 나타났다. 특히, 30mM 그룹에서는 1, 2 및 4h 에서(1h, 36.4±0.6%;

2h, 36.7±1.5%; 4h, 26.3±1.1 %) 0mM(1h, 31.5±1.3%; 2h, 30.1±1.2%; 4h, 20.7±0.3%) 및 15mM(1h, 32.1±1.3%; 2h, 31.9±1.0%; 4h, 23.1±1.4%) 그룹보다 유의적으로 증가하였 다(p<0.05). 또한, 0.5 및 4h 에서는 60mM 그룹(0.5h, 43.6±2.1%; 4h, 26.2±1.1)에서 0mM 그룹(0.5h, 33.5±1.7%;

4h, 20.7±0.3%) 및 15mM 그룹(0.5h, 36.7±1.2%; 4h, 23.1±

1.4%) 보다 유의적으로 증가하였다(p<0.05). 종합적인 결과 를 보았을 때, NA 가 첨가된 체외수정 배양액은 동결-융해 된 정자의 생존율에 긍정적인 영향을 미쳤다.

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Fig. 1. Effect of nicotinic acid on viability in frozen-thawed bull sperm.

a~c Values in the same column with different superscripts are significantly different (p<0.05, n=3).

Fig. 2. Effect of nicotinic acid on outer acrosomal membrane damage in frozen-thawed bull sperm.

2. 정자 첨체 외막 손상율

NA 가 첨가된 체외수정 배양액과 희석된 동결-융해 정 자의 첨체 외막 손상율의 결과를 Fig. 2 에 나타내었다.

Fig. 2 에서 보는 바와 같이 0h 에서는 처리군별(15mM, 27.1±0.9%; 30mM, 25.6±0.9%; 60mM, 26.2±0.7%)에서는 유 의적인 차이가 나타나지 않았지만, 대조구(28.3±0.1%)와 비 교하였을 때, 30mM(25.6±0.9%)에서 유의적으로 감소하였 다(p<0.05). 또한, 1h 및 2h 에서는 30mM(1h, 33.1±0.8%;

2h, 35.7±0.5%) 및 60mM(1h, 31.1±0.4%; 2h, 33.9±0.8%) 그 룹에서 대조구(1h, 39.0±0.6%; 2h, 39.7±0.4%)와 15mM(1h,

36.3±0.8%; 2h, 37.8±0.4%) 보다 유의적으로 감소하였으며 (p<0.05), 0.5h 에서는 60mM 그룹(31.5±0.5%)이 대조구 (36.5±1.0%)와 모든 처리구(15mM, 36.4±0.9%; 30mM, 34.1±0.3%;)에서 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 4h 에서 는 30mM(24.5±0.5%)그룹에서 대조구(30.3±0.6%)와 15mM (27.7±0.8%)그룹에서 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 종합 적인 결과를 보았을 때, NA 가 첨가된 체외수정 배양액은 동결-융해된 정자의 첨체 외막 손상율에 긍정적인 영향을 미쳤다.

3. 정자의 미토콘드리아 온전성

NA 가 첨가된 체외수정 배양액과 희석된 동결-융해 정 자의 미토콘드리아 온전성의 결과를 Fig. 3 에 나타내었다, Fig. 3 에서 보는 바와 같이 0h 에서는 대조구(72.7±0.7%)와 처리구(15mM, 74.1±1.0%; 30mM, 74.2±0.3%; 60mM, 74.9±

0.6%)에서 유의적인 차이가 나타나지 않았지만, 대조구에 비해 처리군에서 증가하는 경향을 확인할 수 있었다. 0.5h 및 2h 에서는 30mM(0.5h, 74.3±0.3%; 2h, 62.7±0.3%)그룹 에서 대조구(0.5h, 66.8±1.0%; 2h, 54.9±0.1%)와 15mM (0.5h, 71.4±0.4%; 2h, 58.1±1.0%) 및 60mM(0.5h, 70.6±

0.2%; 2h, 60.0±0.1%) 그룹에서 유의적으로 증가하였다 (p<0.05). 또한, 1h 에서는 60mM(62.1±0.5%) 그룹에서 대 조구(60.2±0.3%)보다 유의적으로 증가하였다(p<0.05). 종합 적인 결과를 보았을 때, NA 가 첨가된 체외수정 배양액은 동결-융해된 정자의 미토콘드리아 온전성에 긍정적인 영향 을 미쳤다.

Fig. 3. Effect of nicotinic acid on mitochondrial integrity in frozen-thawed bull sperm.

a~d Values in the same column with different superscripts are significantly different (p<0.05, n=3).

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4. 정자의 첨체반응 및 기형율

NA가 첨가된 체외수정 배양액과 희석된 동결-융해 정자 는 CBB와 Rose-bengal을 염색하여 현미경으로 관찰하여 Fig. 4에 나타냈으며, 첨체반응 및 기형율 결과를 Table 1 과 2에 나타내었다. Table 1에서 에서 보는 바와 같이 첨체 반응 에서는 0, 0.5 및 4h 에서 30mM(0h, 1.3±0.3%; 0.5h, 2.3±0.3%, 4h, 16.0±2.7) 및 60mM(0h, 1.3±0.3%; 0.5h, 2.7±0.3%; 4h, 14.7±0.7%)은 대조구(0h, 6.0±2.0%; 0.5h, 9.2±2.9%; 4h, 25.0±3.6%)보다 유의적으로 감소하였고 (p<0.05), 1h에서는 30mM(3.7±0.3%) 및 60mM(2.7±0.3%) 이 대조구(12.3±2.9%) 및 15mM(8.7±0.7%)에서 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 또한 2h에서는 60mM(6.7±1.7%)이 대 조구(19.0±6.7%) 및 모든 처리구(15mM, 13.3±0.3%; 30mM, 11.0±1.0%)에서 유의적으로 감소하였다(p<0.05). Table 2에 서 보는 바와 같이 기형율에서는 0, 0.5, 2 및 4h에서 대조 구(0h, 0.3±0.3%; 0.5h, 0.7±0.3%; 2h, 0.7±0.7%; 4h, 2.0±1.0%)와 15mM(0h, 0±0%; 0.5 h, 0±0%; 2h, 0±0%; 4 h, 1.0±0.6%), 30mM(0 h, 0±0%; 0.5h, 0.3±0.3%; 2h, 0±0%; 4 h 0.7±0.7%) 및 60 mM(0h, 0±0%; 0.5h, 0±0%; 2h, 0±0%; 4 h, 0.7±0.7%)는 유의적인 차이가 나지 않았지만, 대조구에 비해 처리구가 감소하는 경향이 나타났다. 또한, 1h에서는 모든 처리구(15mM, 0±0%; 30mM, 0±0%; 60mM, 0±0%)가 대조군(1.3±0.7%)에 비해 유의적으로 감소하였다. 종합적 인 결과를 보았을 때, NA가 첨가된 체외수정 배양액은 동

결-융해된 정자의 첨체반응과 기형율에 긍정적인 영향을 미쳤다.

Fig. 4. Morphology of abnormality sperm (A), normal sperm (B), acrosome reacted sperm (C) and non-acrosome reacted sperm (D), Scale bar: 50 µm, Pink: Rose bengal stained bull sperm, Blue: CBB stained bull sperm.

Ⅳ. 고찰

본 연구는 NA가 동결 융해된 소 정자의 성상에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 실시하였다. 동결 보존기술은 반영구적으로 생명체의 정액을 보관할 수 있고 사용이 용 이하다는 장점이 있지만 동결과정 중 발생하는 손상에 의

Table 1. Effect of nicotinic acid on acrosome reaction in frozen-thawed bull sperm.

Nicotinic acid (mM) Percentage of acrosome reacted sperm during culture time

0 h 0.5 h 1 h 2 h 4 h

0 6.00±2.00â 9.23±2.85â 12.33±2.85â 19.00±1.73â 25.00±3.61â

15 3.33±0.67âb 5.67±0.67âb 8.67±0.67â 13.33±0.33^b 20.33±0.88âb

30 1.33±0.33^b 2.33±0.33^b 3.67±0.33^b 11.00±1.00^b 16.00±2.65^b

60 1.33±0.33^b 2.67±0.33^b 2.67±0.33^b 6.67±1.67^c 14.67±0.67^b

Table 2. Effect of nicotinic acid on abnormality in frozen-thawed bull sperm.

Nicotinic acid (mM) Percentage of abnormal sperm during culture time

0 h 0.5 h 1 h 2 h 4 h

0 0.33±0.33 0.67±0.33 1.33±0.67^a 0.67±0.67 2.00±1.00

15 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00^b 0.00±0.00 1.00±0.58

30 0.00±0.00 0.33±0.33 0.00±0.00^b 0.00±0.00 0.67±0.67

60 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00^b 0.00±0.00 0.67±0.67

a,b Values in the same column with different superscripts are significantly different (p<0.05, n=3).

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해 신선정액에 비해 정자의 능력이 떨어진다는 단점이 있 어, 이를 향상시키기 위한 연구는 과거부터 현재까지 인간 (Buffone 등, 2012), 돼지(Noguchi 등, 2015), 말(Cerny 등, 2012; Câmara 등, 2011), 소(Bucak 등, 2012), 개(Dorado 등, 2011), 염소(Gadea 등, 2013)등의 다양한 종에서 연구되 고 있다. 특히 소의 경우 대부분 동결 정액을 이용하여 인 공수정이 이루어지는 상황에서 유전적으로 우수한 개체의 정자를 선택하여 고능력 개체를 생산함과 동시에 안정적 인 산자를 생산하기 위해서는 동결-융해 된 정자의 품질을 향상시켜야 하며 이러한 결과는 농가 이익에 직접적인 영 향을 미치게 된다. 따라서, 동결 융해 된 소 정액의 효율을 향상시키기 위해 융해 된 정자에 아미노산(Reddy 등, 2010; Tuncer 등, 2010), 항산화제(Uysal과 Bucak, 2007), 이 당류(Hu 등, 2010), 지방(Adeel 등, 2009) 등 과 같은 물질 을 첨가하는 연구는 많이 진행되어 왔지만, 동결 보존 된 소 정자를 융해 후 수정에 이용되는 희석액에 NA를 첨가 하여 그 능력을 평가한 연구는 없었다.

NA는 vitamin B의 한 종류로써, 체내에서 NAD와 NADP의 전구 물질로 작용하여 세포신호와 지방산, 콜레 스테롤의 합성과 에너지 생성 과정에 관여한다(Kamanna 와 Kashyap, 2008; Tavintharan 등, 2009). 이러한 작용으 로 인해 NA는 체내에서 심혈관 질환(Ganji 등, 2003)을 개 선시키고 간 세포의 지방 축적, 활성산소 및 염증인자를 억제(Ganji 등, 2015)하였으며, 경제동물 중 돼지에게 급여 하였을때, 육질(Flohr 등, 2014)과 골격근(Khan 등, 2013) 및 체내 신호(Jiang 등, 2013) 에 좋은 영향을 미친다고 보 고되었다.

이렇듯 체내에서의 대사작용 및 체세포에서 NA에 대한 연구는 종종 이루어져 왔으나, NA가 정자의 생리학적 작 용에 미치는 영향에 대한 연구는 미미한 실정이다. 하지만 몇몇 연구에서 돼지 정액 희석액에서 NA가 정자의 생존 능력을 증진(Lee 등, 2014)시켰으며, 동결 보존액에 첨가하 여 돼지 정자를 동결 보존하였을 때, 그 생존율이 증진 (Kim 등, 2015) 되었다는 연구결과를 바탕으로 NA는 정자 의 생리학적 영향에 긍정적인 영향을 미친다고 판단된다. 따라서 본 연구에서는 동결-융해 된 소 정자가 일반적으로 16-18시간 동안 체외수정용 희석액에서 배양된다는 점을 바탕으로 체외 수정 동안 소 정자의 수정 효율을 향상시키 기 위해, BO-medium에 NA를 첨가하여 희석된 소 정자의 시간에 따른 성상능력을 분석하였다. 실제로 NA는 융해 후 정자의 생존율을 증진시키며, 정자의 첨체막 손상을 감 소시켰다. NA는 항산화 효과로 인한 지질 과산화의 감소

가 세포막 손상을 억제(Contri 등, 2011)하고 정자의 기능 을 보호(Partyka 등, 2012b)하기 때문에 융해 된 소 정자의 생존율을 증진시켰다고 사료되며, 첨체 외막 손상과 첨체 반응율의 감소는 NA에 의한 Ca²⁺와 수정능의 조절로 인해 살아있는 정자에서 첨체 반응을 억제(Kim 등, 2015)하였다 는 결과와 일치하기 때문에 NA가 수정 동안 첨체막 손상 을 억제시켰다고 판단된다.

NA의 주요한 역할을 NAD와 NADP의 전구 물질로, NAD는 미토콘드리아 내의 에너지 생산 과정인 TCA cycle에 작용하며, NAD/NADH의 비율 증가는 미토콘드 리아 기능을 위한 에너지와 비례한다는 보고가 있다 (Satrústegui 등, 2007). NADP는 미토콘드리아 내막에 작 용하여 에너지 생산 조절에 관여하며, 호흡 과정에서 발생 되는 ROS를 외부에서 공급되는 NADPH 활성화에 의해 NADP를 유지시켜 ROS 생성을 최소화 할 수 있다고 보고 되었다(Satrústegui 등, 2007). 정자에서 에너지의 생산은 운동성을 유지할 수 있는 기본적인 물질로써 정자의 질을 판단하는 지표 중의 하나이다. 본 연구에서 체외 수정에 사용되는 배양액에 NA를 첨가하였을 때, NA가 첨가된 처 리구에서 대조구에 비해 정자의 높은 미토콘드리아 온전 성을 확인 할 수 있었다. 또한 정액 희석액 내 NA의 첨가 가 돼지 정자의 액상 보존 기간을 증진(Lee 등, 2014)시켰 을 뿐만 아니라, 동결 과정 중 정자의 미토콘드리아를 보 호(Kim 등, 2015)하였기 때문에 이전 연구결과들과 본 연 구의 연구를 바탕으로 NA는 미토콘드리아의 기능의 저하 와 손상을 억제시켜 기능을 유지한다고 판단된다.

또한, 형태학적으로 기형인 정자가 많을수록 DNA 손상 율이 높아(Evenson 등, 2002) 체외수정이나 정자미세주입 법을 진행하였을 때, 저품질의 배반포가 형성되어 정상적 으로 착상하지 못하게 되며(Larson-Cook 등, 2003), 이로 인해 임신율이 감소하게 된다(Zini 등, 2002). 또한 ROS에 의한 정자 DNA 손상으로 인해 형태학적 기형이 발생 (Higuchi, 2003)하기 때문에, 항산화제인 NA는 세포 내 NADP와 미토콘드리아를 활성(Navazio 등, 2000)시켜, 세 포 내 ROS를 억제(Apel과 Hirt, 2004)시키기 때문에, 우리 의 연구 역시 체외 수정배양액에서 배양된 동결-융해된 정 자가 NA에 의해 기형율이 감소되었다고 판단되며, 앞으로 의 연구에서는 NA가 첨가된 체외 수정배양액과 희석된 동결-융해 된 정자 DNA의 손상 검사 및 체외에서 배양된 난자와 수정을 실시하여 동결-융해 된 소 정자의 수정능력 을 검증할 예정이다.

이러한 결과를 종합하면, NA 가 첨가된 소 체외수정 배

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양액에 동결-융해된 정자를 희석하였을 때 정자의 생존율, 첨체막 손상율, 미토콘드리아 온전성, 첨체반응 및 기형율 에 있어 효과적인 것으로 나타났다. 따라서, 소 체외수정 배양액 내 NA 의 첨가는 수정시간 동안 정자의 성상능력 을 유지할 수 있기 때문에, 체외 수정 효율을 향상시킬 수 있는 배양액 첨가제로 사용이 가능하다고 판단된다.

Ⅴ. 요약

본 실험의 목적은 nicotinic acid가 동결 융해된 소 정액 의 성상능력에 미치는 영향에 대해 확인하는 것이다. 사정 된 정액은 20% egg-yolk가 첨가된 Triladyl으로 동결하였 고 –196℃에 보관하였다. 동결 정액은 water-bath에서 3 8℃ 에서 45초동안 융해하였으며, nicotinic acid 0, 15, 30 및 60mM이 첨가 된 IVF medium(Bovine-Oviduct medium; BO)에 희석하여 39℃, 5% CO2조건에서 0, 0.5, 1, 2 및 4시간동안 배양하였다. 동결융해된 정액은 생존율을 측정하기 위해 SYBR14/PI, 외첨체막 손상을 측정하기 위 해 FITC-PNA/PI, 미토콘드리아 온전성을 확인하기 위해 Rhodamine123/PI를 이중염색하였다. 후에 flow cytometry 를 사용하여 정자의 성상능력을 분석하였다. 그리고 CBB 를 염색하여 첨체반응을 확인하였고, Rose bengal을 염색 하여 기형율을 확인하였다. 그 결과, 정자의 생존율은 1 및 2시간에서 30mM 처리구가 0 및 15mM 처리구보다 유의 적으로 높게 나타났다(p<0.05). 또한 정자의 외첨체막 손상 율은 1, 2 및 4시간에서 30mM 처리구가 0 및 15mM 처리 구보다 유의적으로 낮게 나타났다(p<0.05). 미토콘드리아 온전성에서도 2 및 4시간에서 30mM 처리구가 0 및 15mM 처리구보다 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05). 정자의 첨 체반응율에서는 1, 2시간에서 30mM 처리구가 0 및 15mM 처리구보다 유의적으로 낮게 나타났으며, 기형율에서는 1 시간에서 NA의 모든 처리구가 대조구에 비해 유의적으로 낮게 나타났다(p<0.05). 결론적으로, nicotinic acid를 IVF medium에 첨가하는 것은 IVF 시 효율을 높일 수 있을 것 이라고 판단된다.

사사

본 연구는 농림수산식품기술기획평가원(과제번호 31060-05-

3-CG000)의 지원에 의해 수행되었습니다.

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(Received 08 August 2015, Revised 17 November 2015, Accepted 18 November 2015)