pISSN 1738-6640 eISSN 2234-4020 http://dx.doi.org/10.6114/jkood.2017.30.3.046
Original Article / 원저
忍冬藤이 DNCB로 유발된 알레르기성 접촉피부염에 미치는 영향
이유진·이호찬·최정화·김종한·박수연*
동신대학교 한의과대학 안이비인후피부과학교실
Effects of Lonicerae Caulis (LC) on Allergic Contact Dermatitis (ACD) induced by DNCB in mice
Yu-Jin Lee·Ho-Chan Lee·Jung-Hwa Choi·Jong-Han Kim·Soo-Yeon Park*
Department of Ophthalmology, Otolaryngology & Dermatology, College of Korean medicine, Dongshin University
Abstract
Objectives : Allergic contact dermatitis(ACD) is a type IV delayed hypersensitivity reaction that results from cumulative exposures and subsequent sensitization to an environmental chemical. Lonicerae Caulis(LC) can clear away heat and relieve toxin, disperse wind and heat, dredge the channel. The present study was designed to investigate the effects of LC on allergic contact dermatitis(ACD) induced by 2,4-dinitrochlorobenzene(DNCB) in mice.
Methods : In this experiment, the effects of LC on changes in body weights, ear and dorsum skin thicknesses, ear weights, clinical aspects on the dorsum skin, histopathological changes, spleen/body ratio, cytokines were investigated. In addition, the effects on proliferations of splenocytes were also investigated in vitro and vivo study.
Results : LC spread(SPR) group and LC spread and administered(SPR+ADM) group showed diminished ear thicknesses. In SPR+ADM group, ear weights were lowered significantly compared to contact dermatitis control(CTL) group. LC treatment diminished erythema, desquamation and keratosis which were induced by repeated painting of DNCB. In histopathological observation, spongiosis and edema were diminished in SPR and SPR+ADM group. In cytokines, SPR+ADM group were increased in IL-10, and SPR and SPR+ADM group were decreased in TNF-α compared with control group.
Conclusions : These data suggest that LC can decrease symptoms of ACD, then LC is useful to treat patient with ACD.
Key words : Allergic Contact dermatitis(ACD); Lonicerae Caulis(LC); 2,4-dinitrochlorobenzene(DNCB); IL-10; TNF-α.
ⓒ 2017 the Society of Korean Medicine Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology
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Ⅰ. 서 론
접촉피부염이란 외부 물질과의 접촉에 의하여 발생 하는 피부염으로1), 알레르기성 접촉피부염은 T 림프 구와 대식세포 등에 의해 발생하는 세포성 면역과민 반응으로 항원과 접촉 후 수 시간에서 72시간 사이에 염증반응이 시작되는 지연형 과민반응이며, 흔하고 만성적인 경과를 나타낸다2). 急性期에는 搔痒을 동반 한 水泡性 丘疹, 紅斑. 浮腫 등이 나타나며, 慢性期에 는 浮腫, 水泡는 減少되며 대신 苔癬化, 鱗屑 등이 형 성된다3).
한의학에서는 알레르기성 접촉피부염은 漆瘡, 狐尿 刺, 粉花瘡, 膏藥風, 馬桶癬 등의 범주에 속하는 것으 로 알려져 있다3-9). 이 질환들은 正氣虛弱의 신체상태 혹은 체질적인 소인이 있는 상태에서 有毒한 물질에 접촉되어 발생하며, 毒氣가 피부를 통해 침입한 후 鬱 滯하여 熱로 化하고 氣血과 상박하게 되어 발생하며
10), 임상적인 증상과 과정에 따라 風熱, 濕熱, 熱毒등 으로 변증된다. 치법으로 淸熱, 解毒, 祛風, 利濕, 養 血 등이 있으며3), 外治法에는 병정시기에 따라 淸熱 燥濕, 活血養血하는 약물들이 다용되었다11).
忍冬藤(Lonicerae Caulis)은 名醫別錄 에 “甘味.
溫. 無毒. 主治寒熱身腫. 久服輕身. 長年. 益壽. 十二 月採. 陰乾”이라고 최초로 수록되었으며, 忍冬科 (Caprijfoliaceae)에 속한 多年生 半常綠 纏繞灌木인 인동(Lonicera japonica THUNB.)의 莖枝로 가을과 겨울에 채취하여 曬乾한다. 忍冬藤의 性은 寒하고, 味 는 甘하여 淸熱解毒, 疏風通絡하는 작용이 있다12). 기존의 연구에서 忍冬藤의 면역억제효과13), 항염증
작용14,15) 등이 입증된 바 있으며, 천식 등의 알레르기
질환에도 유효한 효과가 있음이 밝혀져 있으나16),
DNCB로 유발된 알레르기성 접촉피부염에 대한 구체 적인 연구는 지금까지 없었다.
본 연구에서는 忍冬藤의 알레르기성 접촉피부염에 대한 효과를 살펴보기 위하여, 생쥐에 DNCB를 반복 도포하여 알레르기성 접촉피부염을 유발하고, 체중변 화, 귀의 두께 변화와 무게, 귀와 등 조직의 조직병리 학적 소견을 관찰하고, 비장을 적출하여 비장/체중 비 및 비장세포의 증식율에 미치는 영향을 관찰하였으며, 혈액을 채취해 혈청내 염증/항염증 사이토카인을 측 정한 결과 유의성이 있었기에 보고하는 바이다.
Ⅱ. 재료 및 방법
1. 재료 1) 동물
실험동물은 동신대학교 실험동물윤리위원회의 승인 을 거친 후 반입하였고, 6주령된 수컷 Balb/c 생쥐를 샘타코(인천, 한국)에서 구입하여, 일주일 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 온도와 습도가 조절되는 환경(24
± 3 , 12-hr light-dark cycle) 에서 고형사료와 물 을 마음껏 섭취하게 하며 실험에 사용하였다.
2) 약재
본 실험에 사용된 忍冬藤(Lonicerae Caulis, LC)은 忍冬科(Caprijfoliaceae)에 속한 다년생 半常綠 灌木인 인동(Lonicera japonica THUNB.)의 줄기와 가지로 동신대학교 부속한방병원에서 구입 정제하여 사용하 였다.
3) 시약 및 기기
알레르기성 접촉피부염(Allergic contact dermatitis, ACD) 유발을 위하여 사용된 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB)은 Sigma(St. Louis, MO, USA)제품을 구입 하였다. 측정을 위해 사용된 기기는 형광측정기 (Molecular Devices, USA), Micro-plate reader
Corresponding author : PhD. Soo-Yeon Park, Department of Korean Medicine Opthalmology & Otolaryngology & Dermatology, Suncheon Oriental Hospital of Dongshin University, 331 Isu-ro, Suncheon-si, Jeollanam-do, Korea. 540-320.
(Tel : +82-61-729-7122, E-mail : [email protected] FAX : (061) 725-1717)
Recieved 2017/7/11 Revised 2017/8/1 Accepted 2017/8/8
(Bio-rad, CA), 광학 현미경(Olympus, Japan)등이며, 시료의 조제를 위하여 원심 분리기(Vision, 한국), 감 압농축기(EYELA, Japan), 동결건조기(삼원, 한국)가 사용되었다.
2. 방법 1) 약물의 준비
세척되고 세절된 상태로 구입된 忍冬藤 200g을 D/W 1,500 를 이용하여 100 에서 3시간 추출한 다음, 원심분리하여 찌꺼기는 버리고 상층액을 모아 감압농축기(EYELA, Japan)를 이용하여 감압 농축한 후, 동결건조기(삼원, 한국)를 이용하여 동결 건조 하 였다. 최종적으로 얻어진 동결 건조 분말은 15.9g으 로 수율은 7.95%였으며, 실험에 사용될 때까지 냉동 보관 되었다.
2) 알레르기성 접촉피부염의 유발 방법
ACD는 acetone과 olive oil을 4대 1로 섞은 AOO 에 DNCB가 1% 함유된 용액을 이용하여 유발하였다
17). 간단히 과정을 소개하면, 생쥐의 등을 가볍게 제 모한 후, 제모제를 이용하여 잔털을 깨끗이 제거한 다 음 상처 치유를 위하여 24시간 방치하였다. 24시간이 지난 후부터 3일간 1% DNCB 용액을 1일 1회 귀(30
)와 등(50 ) 부위에 도포하여 감작하였다. 3일간의 감작이 끝난 후, 3일간 방치하였다가 실험 7일째부터 2일 1회로 총 4회 1% DNCB 용액을 귀와 등 부위에 도포하여 알레르기성 접촉피부염을 유발하였다.
3) 약물의 처리 및 실험군 분류
귀와 등 부위에 도포하기 위한 도포액은 동결 건조 된 LC를 에탄올에 20 / 농도로 녹여 사용하였고, 경구투여액은 동결 건조된 LC 500 /kg을 증류수에 희석하여 사용하였다.
실험 7일째부터 zonde를 이용해 매일 일정한 시간 에 경구하였고, 투여기간은 8일간 1회/1일 실시하였 다. LC와 DNCB의 직접적인 간섭을 최소화하기 위하 여 DNCB 처리 이후 최소 4시간 이상 경과 후에 LC 를 도포하였다(Table 1).
실험군은 다음 4개의 군으로 나누었다.
① 정상군(normal group, NOR) : 알레르기성 접 촉피부염을 유발하지 않고, 증류수를 경구투여 하고, vehicle을 도포한 군(n=4).
② ACD 대조군(control group, CTL) : 알레르기 성 접촉피부염을 유발하고, 증류수를 경구투여 하고, vehicle을 도포한 군(n=8).
③ LC 도포군(LC spread group, SPR) : 알레르기 성 접촉피부염을 유발하고, 증류수를 경구투여 하고, LC 용액을 도포한 군(n=8).
④ LC 도포 및 경구투여군(LC spread and administer group, SPR+ADM) : 알레르기성 접촉피부염을 유발하고 LC의 경구투여와 도포 를 동시에 시행한 군(n=8).
4) 체중, 귀 및 비장 무게의 측정(Table 2) 실험시작일(day 1) 측정한 체중을 기준으로 2주간
Oral Administration and Spread of LC(↓)
↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
day 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑
Spread of DNCB(↑) Table 1. Oral Administration and Spread of LC, Spread of DNCB
Measurement of Body weights(↓)
↓ ↓ ↓
day 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
↑ Measurement of Ear and Spleen weights(↑)
Table 2. Measurement of Body weights, Ear and Spleen weights
Measurement of Ear thicknesses(↓)
↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
day 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
↑ Measurement of Dorsum skin thicknesses(↑)
Table 3. Measurement of Ear and Dorsum Skin Thicknesses
체중 변화를 관찰하였다. 체중의 측정은 측정일 오후 2시에 전자저울(Tanita, Japan)을 이용하여 실시하였 다. 귀와 비장의 무게는 실험 마지막날 생쥐를 희생시 킨 후, 귀와 비장을 적출한 다음 미량 저울(sartorius, 한국)을 이용하여 측정하였다. 귀의 경우, 정확한 측 정을 위하여 귀를 절제한 다음 직경 5 의 둥근 절편 을 만들어 무게를 비교하였으며, 비장은 희생 직전 측 정한 체중에 대한 비율로 제시하였다.
5) 귀 및 등 피부의 두께의 측정(Table 3) ACD가 유발된 생쥐의 귀 두께는 생쥐를 흡입 마 취제(이소플루란, 증외제약, 한국)로 가볍게 마취 시킨 다음, 디지털 캘리퍼(Mitutoyo, Japan)를 이용하여 실 험 첫날부터, 2일 간격으로 측정하였다. 등 피부의 두 께는 실험 마지막 날 등 피부를 절제한 후, 디지털 캘 리퍼를 이용하여 측정하였다.
6) 피부 표면의 육안적 관찰
ACD의 유발 정도를 전반적으로 관찰하기 위하여
실험 마지막날 생쥐를 희생시킨 다음, ACD가 유발된 등 부위를 Digital camera(Olympus, Japan)로 촬영 하여 제시하였다.
7) Symptom score에 미치는 영향
실험이 끝난 후, 생쥐의 등에 발생한 병변의 정도를 관찰하여 수치로 나타내었다. 피부 병변은 피부 부종 과 종창의 정도에 따라 다음과 같이 판정하였다 (Table 4).
Table 4. Symptom Score Score Condition
0 Normal
1 Light skin pigmentation
2 Severe skin pigmentation, erythema 3 Erythema and desquamation
4 Erythema, desquamation and bloodstain 5 Severe erythema, desquamation and bloodstain
8) 피부 조직의 조직병리학적 소견
생쥐로부터 얻어진 피부 조직을 10% 포르말린에 고정한 후, 파라핀에 포매하였다. 포매된 조직을 미세 절단기(Leica, Germany)를 이용하여 4㎛ 두께로 잘라 슬라이드 글라스위에 부착하였다. 부착된 조직으로부 터 파라핀을 제거하고 hematoxylin과 eosin을 이용하 여 염색한 후 광학현미경(Olympus, Japan)으로 관찰 하였다(×100).
9) 비장세포 증식율에 미치는 영향 ① in vitro
생쥐의 비장 세포의 분리는 Wysocki18) 및 Mizel19) 등의 방법에 의하여 실시하였다. 분리 된 비장 세포 부유액을 RPMI 1640 배지로 희 석하고 96 well plate에 1.0×106cells/㎖ 농도로 접종한 다음 비장 세포에 LPS 5㎍/㎖ 및 LC를 농도별(0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0㎎/㎖)로 첨가한 후 각 37℃의 CO2 배양기에서 48시간 배양한 다음 MTT시약을 가하였다. 배양 종료 시 0.1N HCl에 용해시킨 10% SDS 100㎕를 각 well에 첨가하고 차광상태에서 18시간 더 배 양한 후 발색된 각 well의 흡광도를 Microplate Reader로 570㎚에서 측정하였다. 실험군의 흡 광도를 대조군의 흡광도와 비교하여 세포 증식 율을 백분율로 환산하였다.
② in vivo
상기 방법과 같이 실험군을 분류하여 실험을 진 행하였다. 실험이 종료된 다음 마우스의 비장 세포의 분리는 in vitro의 방법과 같이 실시하였 다. 비장세포의 증식율 역시 in vitro의 방법과 동일하게 측정하여 대조군의 흡광도와 비교하여 세포 증식율을 백분율로 환산하였다.
10) 사이토카인 측정 ① 채혈 및 혈청분리
실험이 종료된 생쥐를 urethane으로 마취시킨
후 심장채혈하였다. 채혈한 혈액을 plastic tube 에 담아 실온에 30분 정도 방치하였다가 3,000rpm으로 30분간 원심분리시켜 상층의 혈 청만을 분리하였다.
② Tumor necrosis factor- alpha(TNF-α) 양 측정 상기 방법과 같이 혈청을 분리한 후 혈청 내에 서 생성되는 TNF-α 양을 mTNF-α ELISA kit(Biosource, CA, U.S.A.)를 이용하여 측정하 였다. 96 well plate에 mTNF-α standard diluent buffer 50㎕를 넣은 다음, 나머지 well 에 혈청과 control(high, low)을 각각 50㎕씩 분주한 후 standard diluent buffer 50㎕를 넣 었다. 이후 각 well에 biotin-labeled anti-mTNF-α 50㎕를 넣고 실온에서 90분 동 안 incubation한 다음 washing buffer로 4회 세척하였다. 이후 희석하여 준비해 놓은 streptavidin-HRP를 각 well에 100㎕씩 분주한 다음 다시 실온에서 45분 동안 incubation한 후 washing buffer로 4회 세척하였다. 그 다음 stabilized chromogen을 각 well에 100㎕씩 분 주한 후 빛이 차단된 실온에서 30분 동안 incubation한 후 stop solution을 각 well에 100㎕씩 분주한 다음 microplate reader를 이용 하여 450㎚ 파장에서 측정하였다20,21).
③ Interleukin (IL)-10 양 측정
상기 방법과 같이 혈청을 분리한 후 혈청 내에 서 생성되는 IL-10 양을 mIL-10 ELISA kit(Biosource, CA, U.S.A.)를 이용하여 측정하 였다. 96 well plate에 standard diluent buffer 100㎕씩 분주한 후 나머지 well에 혈청과 control(high, low)을 각각 50㎕씩 분주한 다음 standard diluent buffer 50㎕를 넣었다. 이후 각 well에 biotin-labeled anti-mIL-10 50㎕를 넣고 실온에서 2시간 incubation한 다음 washing buffer로 4회 세척하였다. 이후 희석 하여 준비해 놓은 streptavidin-HRP를 각 well
에 100㎕씩 분주한 다음 다시 실온에서 30분 동안 incubation한 후 washing buffer로 4회 세척하였다. 그 다음 stabilized chromogen을 각 well에 100㎕씩 분주한 후 빛이 차단된 실온 에서 30분 동안 incubation한 후 stop solution 을 각 well에 100㎕씩 분주한 다음 microplate reader를 이용하여 450㎚ 파장에서 측정하였다
22,23)
.
3. 통계 처리
실험 자료에 대한 통계적 분석은 통계 패키지인 SAS(The SAS System for Windows, ver. 6.12, SAS Institute, U.S.A.)를 이용하였다. 실험 성적은 평균±표준편차 (mean±SD)로 나타내었으며, 각 실험 군 간 평균의 차이를 검정할 때에는 Student's t-test 로 검정하여 p-값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있 는 것으로 판정하였다.
Ⅲ. 결 과
1. 체중 변화에 미치는 영향
2주간 체중 변화를 관찰한 결과 모든 군에서 통계 적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다(Fig. 1).
2. 귀 두께에 미치는 영향
정상군의 경우 2주간 특별한 귀두께의 변화가 관찰 되지 않은 반면, ACD대조군에서는 실험 8일째부터 유의한 수준의 귀두께 증가가 관찰 되었다. 이러한 증 가는 실험 12일 째에 최고조에 달하였다. SPR군의 경 우 12일 째에 대조군과 비교하여 유의한 귀두께 감소 가 관찰되었고, SPR+ADM군은 실험 12일째와 14일 째에 유의한 수준의 귀두께 감소가 관찰되었다(Fig.
2).
90 100 110 120
0 1 2
(w eek) Changes in body weights (% of day 1)
NOR C T L S P R S P R +ADM
Fig. 1. Effects of LC on changes of body weights in ACD mice
Body weights were measured once in a week. Changes of body weight were represented as average weights, which were expressed as percentages of weight on day 1. NOR : naive group, CTL : ACD group, SPR : LC spread group, SPR+ADM : LC spread and administered group. Values are represented as mean±SD(n=8).
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
2 4 6 8 10 12 14
(day)
Ear thickness (mm)
NO R C on trol S P R S P R+ADM
*
* *
###
###
###
###
Fig. 2. Effects of LC on ear thickness in ACD mice
Ear thicknesses were measured using digital caliper on every 2 days. NOR : naive group, CTL : ACD group, SPR : LC spread group, SPR+ADM : LC spread and administered group. Values are represented as mean±SD. ###p<0.001 vs. normal group,
*p<0.05 vs. CTL group(n=8).
3. 귀 무게에 미치는 영향
생쥐로부터 ACD가 유발된 귀를 절제하여 무게를 비교한 결과 ACD 대조군에서 정상군에 비하여 유의 한 수준으로 증가된 귀 무게가 관찰되었으며, SPR+ADM군에서 유의한 수준의 귀 무게 감소가 관 찰되었다. SPR군의 귀 무게는 감소하는 경향을 보였 으나 통계적 유의성은 없었다(Fig. 3).
0 5 10 15 20 25 30
NOR CTL SPR SPR+ADM
Ear weights(mg) *
###
Fig. 3. Effects of LC on ear weights in ACD mice
Ear weights were measured at the end of experiment. NOR : naive group, CTL : ACD group, SPR : LC spread group, SPR+ADM : LC spread and administered group. Values are represented as mean±SD. ###p<0.001 vs. normal group, *p<0.05 vs. CTL group(n=8).
4. 귀 조직의 조직병리학적 소견에 미치는 영향 생쥐의 귀 조직을 적출하여 재료 및 방법에서 논술 한 바와 같이 염색하여 관찰한 결과, ACD 대조군에 서 귀 조직의 두께가 정상군에 비하여 확연하게 증가 됨이 관찰되었으며, SPR 및 SPR+ADM군에서는 이 러한 귀 조직 두께 증가를 효율적으로 억제함이 관찰 되었다(Fig. 4).
Fig. 4. Effects of LC on histopathological changes of ear tissue in ACD mice
Ear tissues were stained with hematoxylin and eosin and observed light microscope. (A) : naive group, (B) : ACD group, (C) : LC spread group, (D) : LC spread and administered group(×100).
5. 등 피부 두께에 미치는 영향
생쥐로부터 등 피부 조직을 적출하여 피부 두께를 측정한 결과, 대조군에서 정상군에 비해 유의한 수준 의 등 피부 두께 증가가 관찰되었다. SPR+ADM 군 은 이러한 등 피부 증가를 유의한 수준으로 억제하였 으며, SPR군의 경우 SPR+ADM 군과 유사한 결과를 나타냈으나 통계적 유의성은 없었다(Fig. 5).
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
NOR CTL SPR SPR+ADM
Skin thickness (mm)
*
##
Fig. 5. Effects of LC on thickness of dorsum skin in ACD mice
Skin thicknesses were measured using digital caliper at the end of the day. NOR : naive group, CTL : ACD group, SPR : LC spread group, SPR+ADM : LC spread and administered group.
Values are represented as mean±SD. ##p<0.01 vs. normal group,
*p<0.05 vs. CTL group(n=8).
6. 등 피부 증상에 미치는 영향
Vehicle만을 처리한 정상군의 피부에서는 특별한 변화를 관찰 할 수 없었고, 반복되는 DNCB 접촉이 이루어진 대조군의 등 피부에서는 피부 홍반, 낙설 등 중등도 이상의 알레르기성 접촉피부염 증상이 관찰되 었다. SPR 및 SPR+ADM군에서는 이러한 알레르기 성 접촉피부염 증상이 감소되는 경향을 보였으며, SPR군보다 SPR+ADM군이 더 좋은 효과를 보였다 (Fig. 6).
7. 등 피부 증상 정도(Symptom Score)에 미치는 영향
재료 및 방법에서 논술한 바와 같이 5점 척도를 사
용하여 피부 증상 정도를 수치로 나타낸 결과, 정상군 은 0점으로 특별한 증상을 나타내지 않았고, 대조군에 서는 평균 증상정도 4.3±0.89점으로 증상이 평가되었 다. SPR군에서는 2.4±0.5점, SPR+ADM군에서는 1.6±0.7점으로 평가되어 실험군 모두에서 유의한 수 준으로 알레르기성 접촉피부염의 증상 정도가 감소함 이 관찰 되었다(Fig. 7).
Fig. 6. Effects of LC on clinical aspect in ACD mice
Clinical aspect of dorsum skin in ACD mice were observed using digital camera at the end of the day. (A) : naive group, (B) : ACD group, (C) : LC spread group, (D) : LC spread and administered group.
0 1 2 3 4 5 6
NOR CTL SPR SPR+ADM
Symptom score (arbitrary unit)
*
*
Fig. 7. Effects of LC on symptom score in ACD mice
Symptom scores were estimated in each animal respectively.
NOR : naive group, CTL : ACD group, SPR : LC spread group, SPR+ADM : LC spread and administered group. Values are represented as mean±SD. *p<0.05 vs. CTL group(n=8).
8. 등 피부의 조직병리학적 소견에 미치는 영향 Vehicle만을 처리한 정상군의 피부조직은 특별한 이상 소견이 발견되지 않은 반면, 대조군의 피부 조직 에서는 비후된 스폰지조직(spongiosis)과 부종 (edema), 면역세포의 증가가 관찰되었다. SPR군 및 SPR+ADM군에서는 스폰지 조직과 부종, 면역세포 침윤이 줄어드는 경향을 보였다(Fig. 8).
Fig. 8. Effects of LC on histopathological observation of dorsum skin in ACD mice
Dorsum skin was stained with hematoxylin and eosin and observed light microscope. (A) : naive group, (B) : ACD group, (C) : LC spread group, (D) : LC spread and administered group.
Closed arrow : immune cell infiltration, open arrow : spongiosis(×100).
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
NOR CTL SPR SPR+ADM
Spleen/Body weight ratio(%) ##
Fig. 9. Effects of LC on Spleen / Body weight ratio in ACD mice
Spleen and Body weights were measured at the end of experiment. NOR : naive group, CTL : ACD group, SPR : LC spread group, SPR+ADM : LC spread and administered group.
Values are represented as mean±SD(n=8). ###p<0.001 vs. normal group.
9. 비장/체중 비에 미치는 영향
재료 및 방법에서 논술한 바와 같이 비장을 적출하 여 무게를 측정하고 이를 체중과의 비율로 나타낸 결 과, 대조군에서 정상군에 비하여 유의한 비장/체중 비 의 증가가 관찰되었다. SPR군 및 SPR+ADM군에서 는 대조군과 특별한 차이를 관찰할 수 없었다(Fig. 9).
10. 시험관 내 비장세포 증식율에 미치는 영향 정상 생쥐로부터 비장 세포를 분리하여 재료 및 방 법에 논술한 바와 같이 LC를 처리하고 증식율을 관찰 한 결과, 최고 농도인 1㎎/㎖에서 유의한 수준의 비장 세포 증식율 감소가 관찰되었다(Fig. 10).
0 20 40 60 80 100 120 140
con(-) con(+) 0.0625 0.125 0.25 0.5 1 (mg/ ml)
Splenocyte proliferation (%) *
Fig. 10. Effects of LC on proliferation rates of splenocyte in vitro
Proliferation rates of splenocyte were measured using modified MTT method described in materials and methods. con(-): without LPS group, con(+): 5ug/㎖ of LPS treated control. Values are represented as mean±SD. *p<0.05 vs. LPS treated control group(n=8).
11. 생체 내 비장세포 증식율에 미치는 영향 비장을 적출하여 무게를 측정한 다음, 비장 세포를 분리하여 증식율을 측정한 결과, LPS를 처리하지 않 은 경우 대조군에서 정상군에 비하여 유의한 수준으 로 증가된 비장세포 증식율이 관찰되었으며, SPR 및 SPR+ADM군은 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았 다. LPS를 처리한 경우는 모든 군에서 유의한 차이가
나타나지 않았다(Fig. 11).
0 20 40 60 80 100 120 140
NOR CTL SPR SPR+ADM
(mg/ ml) Splenocyte proliferation (% of LPS control)
w /o LPS w ith LPS
###
Fig. 11. Effects of LC on proliferation rates of splenocyte in vivo
Proliferation rates of splenocyte were measured using modified MTT method described in materials and methods. w/o LPS : without LPS group, with LPS : 5ug/㎖ of LPS treated control.
Values are represented as mean±SD (n=8). ###p<0.001 vs. normal group.
12. 혈중 IL-10 함량에 미치는 영향
혈청 내 IL-10의 함량을 측정한 결과, 정상군에 비 해 유의성 있게 감소된 대조군의 IL-10 함량은 모든 실험군에서 대조군보다 증가되었지만 특히 SPR+
ADM군에서 유의성 있게 증가되었다(Fig. 12).
0 20 40 60 80 100 120 140
NOR CTL SPR SPR+ADM
IL-10 production (%) *
###
Fig. 12. Effects of LC on serum levels of IL-10 in ACD mice
Levels of IL-10 in serum were measured using ELISA methods.
NOR : naive group, CTL : ACD group, SPR : LC spread group, SPR+ADM : LC spread and administered group. Values are represented as mean±SD. ###p<0.001 vs. normal group, *p<0.05 vs. LPS treated control group(n=8).
13. 혈중 TNF-α 함량에 미치는 영향
혈청 내 TNF-α의 함량을 측정한 결과, 정상군에 비해 유의성 있게 증가된 대조군의 TNF-α 함량은 SPR 및 SPR+ADM군에서 유의성 있게 감소되었다 (Fig. 13).
0 20 40 60 80 100 120 140
NOR CTL SPR SPR+ADM
TNF-alpha production (%)
* **
##
Fig. 13. Effects of LC on serum levels of TNF-a in ACD mice
Levels of TNF-a in serum were measured using ELISA methods.
NOR : naive group, CTL : ACD group, SPR : LC spread group, SPR+ADM : LC spread and administered group. Values are represented as mean±SD. ##p<0.01 vs. normal group, *p<0.05,
**p<0.01 vs. LPS treated control group(n=8).
Ⅳ. 고 찰
환경의 오염, 식생활의 변화, 복잡한 사회구조로 인 한 스트레스의 증가 등은 새로운 질병의 원인을 제공 하게 되어, 현대인에게는 당뇨병, 고혈압, 알레르기, 만성 스트레스 등과 연관된 질환이 가장 빈번히 발생 하고 있다24). 특히 알레르기 질환으로는 기관지 천식, 비염, 아토피성 피부염, 알레르기 결막염 등이 대표적 인데, 산업의 발달로 인공화학 합성물의 범람과 환경 오염이 가속화되면서 알레르겐이 급증하는 추세이고 특히 피부과 질환 중에서 가장 많이 볼 수 있는 것은 접촉성 피부염으로 화학물질, 약물, 식물 및 기타자극 물에 의해 피부에 알레르기성 반응을 유발하는 질환 이다25). 알레르기성 피부염의 치료제로 부신피질 호르 몬제 및 항히스타민제 등이 사용되고 있으나 이러한 치료제를 장기간 투여할 경우 여러 가지 부작용이 보
고되고 있어 이에 대한 해결책이 필요한 실정이다26). 忍冬藤(Lonicerae Caulis)은 忍冬科(Caprijfoliaceae) 에 속한 多年生 半常綠 纏繞灌木인 인동(Lonicera japonica THUNB.)의 莖枝로 가을과 겨울에 채취하 여 曬乾한다. 忍冬藤의 性은 寒하고, 味는 甘하여 淸 熱解毒, 疏風通絡하는 작용이 있으며, 溫病發熱, 熱毒 血痢, 癰腫瘡瘍, 風濕熱痺, 關節紅腫熱痛을 主治한다
12). 《東醫寶鑑》에서는 癰疽門에 “治一切癰疽腫毒花 莖與葉生搗煖酒調服.”이라 하여 염증성 피부질환에 대 한 사용 가능성을 제시하였다27).
최근 忍冬藤의 항염증작용과 면역억제에 대한 연구 는 다양한 방면에서 이루어지고 있다. 김28) 등은 忍冬 藤의 주성분인 luteolin이 직장 상피세포에서 IL-8 생 성을 억제함을 보고하였으며 또한 태29) 등은 TNF-α 생성을 억제함으로써 proteinase-activated receptor 2(PAR2)로 야기되는 생쥐의 부종에 대해 忍冬藤 추 출물이 억제작용이 있음을 보고하였고, 송14) 등은 忍 冬藤의 抗炎症作用을 보고하였고, 이15) 등은 유기용매 로 배출한 忍冬藤 추출물이 항염 및 진통작용이 높다 고 보고하였다. 또한 류16) 등은 忍冬藤의 BuOH분획 이 기관지 수축억제, 비만세포 안정화, 폐기관지내의 호산구 증가 억제 등을 통하여 천식에 유효함을 밝혀 면역억제에도 일정한 효과가 있음을 보고하였다. 이11) 등은 忍冬藤 추출물의 물 분획과 ethyl aceteae 분획 이 IL-12, IFN-γ의 유전자 발현을 증가시키는 등 면 역증강 cytokine의 발현에 영향을 미치는 것을 보고 하였다. 하30) 등은 忍冬藤의 성분인 Chlorogenic acid 및 忍冬藤 ethyl acetate 분획이 비장 및 흉선세포에 서 IFN-γ, IL-4, IL-6 등의 유전자 발현에 영향을 미 쳐 면역조절효과를 발휘함을 보고하였고 김31)은 忍冬 藤 추출물이 악성흑생종 세포 내에서 세포증식율을 감소시키고, 멜라닌 생합성을 저해함으로써 피부미백 및 항암효과가 있음을 보고하였다. 이에 저자는 지금 까지 忍冬藤 추출물이 DNCB로 유발된 알레르기성 접촉피부염 동물모델에 미치는 영향에 대한 연구가 전무하고 忍冬藤이 알레르기성 접촉피부염의 증상개
선에 효과가 있을 것으로 사료되어 본 연구를 진행하 였다.
동물을 이용한 실험에서 일반적으로 급격한 체중의 증가나 감소는 부작용의 가능성으로 인식되는데 본 연구의 결과를 살펴보면, 실험 시작 후 1주일째 체중 은 증가하는 경향을 보인다. 그러나 실험 마지막날 측 정한 체중은 정상군에서는 체중이 증가한데 반해, ACD를 유발한 세 군(CTL, SPR, SPR+ADM군)의 동 물들은 실험 1주차에 비하여 오히려 체중이 감소하는 경향을 보였다 (Fig. 1). 이러한 결과는 실험 후반기에 ACD의 증상 발현 시작 시점과 어느 정도 일치하는 것으로 생각되며, ACD의 증상 발현에 따른 일반적인 체중 감소로 해석된다. LC의 도포군이나 도포 및 경 구투여군에서는 이러한 체중증가율 감소를 억제하는 경향은 보이지 않았다.
ACD가 발현하는 국소 부위의 급성 반응은 일차적 으로 부종을 들 수 있다. 특히, 귀 부위의 부종 정도 에 미치는 영향은 약물의 항염증 작용의 척도로 여겨 지고 있다32). 본 연구에서 2일 1회 귀 두께를 측정한 결과, 실험 시작 8일째부터 유의한 수준의 귀 두께 증 가가 관찰 되었으며, 실험 12일째에 최고조에 이르렀 다(Fig. 2). 체중 변화에 미치는 영향(Fig. 1)을 감안하 면, 본 실험에 사용된 동물 모델이 최초 3일간의 감작 과정과 3일간의 휴지기를 거친 다음, 실험 7일째, 첫 번째 challenge를 통하여 본격적인 ACD 증상이 발현 된 것으로 사료된다. 본 실험의 결과에서 LC의 도포 는 실험 12일째 대조군에 비하여 유의한 수준으로 귀 두께 증가를 억제하였으나, 실험 14일째에는 통계적 유의성이 관찰되지 않았다. LC 도포와 경구투여 병행 군은 실험 12일과 14일에 모두 통계적으로 유의한 귀 두께 증가 억제 현상을 보였다(Fig. 2). 이러한 결과는 淸熱解毒 효능이 있어 紅腫熱痛에 사용되는 忍冬藤12) 이 ACD 동물 모델에서도 발휘되는 것으로 해석된다.
ACD 동물 모델에서 귀의 부종 뿐만 아니라 동일 면적 대비 귀 무게도 증가하는 경향을 보이는데, 이는 귀 피부 조직의 비후에 기인하는 것으로 알려져 있다
32). 본 연구 결과를 살펴보면, ACD 유발에 의하여 유 의한 수준으로 귀의 무게가 증가하였고, 이러한 증가 는 LC의 도포 및 경구투여에 의하여 효율적으로 억제 되었다(Fig. 3). 이러한 결과는 귀 부종에 미치는 영향 과 연결지어 생각하면, LC가 항염증 효과를 발휘함으 로써 ACD에서 보이는 피부 조직의 비후를 억제한 것 으로 설명될 수 있다.
이러한 결과를 직접 확인하기 위하여 조직의 절편 을 염색하여 관찰한 결과 ACD 대조군에서 귀 조직의 두께가 정상군에 비하여 확연하게 증가됨이 관찰되었 으며, SPR 및 SPR+ADM군에서는 이러한 귀 조직 두께 증가를 효율적으로 억제함이 관찰되었다(Fig.
4). 이러한 결과는 상기한 귀 부종(Fig. 2) 및 귀 무게 (Fig. 3)에 미치는 영향과 일맥상통하며, LC 도포 보 다는 LC 도포와 경구투여를 병행한 군이 더욱 효과가 있음을 짐작할 수 있다.
귀 부종에 의한 두께 증가가 위주가 되는 귀 조직 과 달리 등의 피부에는 홍반, 낙설, 각화 등의 피부염 증상을 직접적으로 관찰할 수 있으므로, 등 피부에 ACD를 유발하고 두께, 피부염 증상의 발현 정도 조 직병리학적 소견 등을 관찰 하였다.
본 연구의 결과에서 반복되는 DNCB의 처리는 유 의한 수준의 등 피부 두께 증가를 유발 하였으며, LC 의 처리는 이러한 등 피부 두께 증가를 효율적으로 억제하였다(Fig. 5). 대조군의 등 피부 두께는 1.2±0.2㎜로 정상군의 약 300%에 달하며, SPR군은 0.9±0.2㎜, SPR+ADM군은 0.9±0.1㎜로 대조군에 비하여 각각 75.9%, 73.2%에 해당하였지만, 통계적 유의성은 SPR+ADM군에서만 관찰 되었다(Fig. 5).
등 부위에 발생된 ACD의 증상을 직접 관찰한 결 과, 대조군에서는 홍반과 심한 낙설, 각화 현상 뿐만 아니라 심한 경우 출혈반(Blood spot)도 관찰된데 반 해, LC의 처리는 홍반, 낙설, 각화 등의 피부염 증상 을 현저하게 감소시키는 경향을 보였다(Fig. 6). 이러 한 결과를 5점 척도를 이용하여 수치화 한 결과 LC를 처리한 두 군 모두에서 유의한 증상 정도의 감소가
관찰되었으며, LC의 도포 및 경구투여군이 LC 도포 군에 비하여 피부 증상 정도 점수가 더 낮았다(Fig.
7). 이러한 결과는 LC가 ACD의 증상을 개선시켜 줄 수 있음을 시사한다.
ACD가 발생한 조직의 가장 특징적인 변화는 스폰 지 조직의 비후와 부종, 단핵구 및 각종 염증관련 면 역 세포의 침윤 등이라고 할 수 있다33). 본 연구의 결 과에서 반복되는 DNCB의 도포는 ACD에서 보이는 전형적인 스폰지 조직의 비후(검은 화살표)와 단핵성 면역세포 침윤(흰 화살표)을 보였다(Fig. 8B). 이러한 스폰지 조직의 비후는 등 조직 두께 증가를 설명할 수 있는 한 가지 요소로 생각 된다. LC를 처리한 두 가지 투여군 모두에서 스폰지 조직 비후와 면역세포 침윤이 감소하는 경향을 보였다(Fig. 8C, D). 이러한 결과는 등 조직의 두께에 미치는 영향(Fig. 5) 관찰 결과와 유사한 맥락을 가진다. 또한, 염증 세포 침윤 의 감소는 상술한 항염증 효과(Fig. 2, 3)를 감안할 때, ACD 모델에서 항염증 효과를 발휘함으로써 궁극 적으로 염증 세포 침윤을 방지하였음을 짐작 할 수 있다.
비장은 조혈 작용 및 식작용, 적혈구의 재생 및 저 장과 각종 면역작용에 관여하는 장기이다34). 이러한 비장은 비교적 다양한 원인에 의하여 종대가 일어나 는데, 대표적으로 종양, 빈혈, 문맥 고혈압증과 같은 경우가 있으며, 일반적으로 면역기능이 증가되는 경 우 종대가 일어난다35).
본 연구에서 DNCB를 반복적으로 처리하여 ACD 를 일으킨 결과 비장/체중 비가 정상군의 280% 이상 증가 하였다. 그러나, LC의 두 가지 처리군 모두에서 특별한 비장/체중비의 변화는 관찰 할 수 없었다(Fig.
9). 이러한 결과는 DNCB에 의하여 면역 반응이 활성 화된 결과로 해석되며, LC는 비장의 크기에는 특별한 영향을 미치지 않았다.
선행 연구에서 LC는 비장세포 증식율을 증가시키 는 것으로 알려져 있다13). 본 연구의 결과에서는 유효 농도의 LC 처리에 의하여 특별한 비장세포 증식율의
증가는 관찰되지 않았고, 최고 농도인 1㎎/㎖ 농도에 서 오히려 비장세포 증식율이 감소했다(Fig. 10). 최 고 농도인 1㎎/㎖는 생체 내에서 도달하기 매우 힘든 농도로 최고 농도에서 비장세포 증식율 감소는 큰 의 미를 갖지 못할 것으로 판단된다. 이러한 경향의 재확 인을 위하여 DNCB에 의하여 ACD가 유발된 동물의 비장세포를 얻어 증식율을 확인한 결과에서도 LC의 두 가지 투여군은 비장세포 증식율에 특별한 영향을 미치지 않았다(Fig. 11). 이러한 결과를 종합해보면, 서36) 등이 LC를 투여한 결과 T 림프구의 증식을 유의 성 있게 증가시켰다는 보고에 바탕을 두고 생각해 볼 때, LC의 ACD에 대한 치료 작용은 항염증 작용에 기 인하지만 그 항염증 작용이 비장세포 이외의 다른 기 전을 이용하여 이루어지는 것이라고 유추 할 수 있다.
그리하여 LC가 혈청내 사이토카인에 미치는 영향 을 관찰하였다. Th1 사이토카인은 interferon (IFN)- α, TNF-α, IL-1β 등으로 염증 반응을 촉진시키고, Th2 사이토카인은 IL-10, IL-13 등으로 면역반응을 억제한다37). 그 중 TNF-α는 RA(Rheumatoid Arthritis)에서 T세포와 B세포의 기능을 증가시키고
38), IL-10은 Th1 cytokine 생성 억제 인자로 IL-1α 와 IL-1β의 작용을 억제하며 IL-4보다 더욱 강력한 항염증 작용이 있는 것으로 알려져 있다.
각질형성세포(keratinocyte)는 자외선이나 화학물질 등의 자극에 반응하여 IL-1, TNF-α와 같은 염증성 cytokine, IL-8, IL-10과 같은 주화성(chemotactic) cytokine, IL-6, IL-7, IL-15, GM-CSF 등의 성장성 (growth promoting) cytokine 등을 분비한다39). 특 히, IL-1a, IL-1b, TNF-α와 같은 염증성 cytokine은 여러 가지 직, 간접적인 기전을 통하여 피부병변 부위 에 염증을 유발하게 된다40).
ACD의 시작에도 기존의 염증 및 면역 반응에서와 같이 수지상 세포(dendritic cell, DC)가 중요하게 관 여함이 알려져 있으며33), 염증 반응의 시작 단계에서 DC에 의하여 주요한 항염증 cytokine 중의 하나인 IL-10의 분비가 증가되면 이러한 일련의 감작 과정이
억제됨이 알려져 있다40).
항염증 사이토카인인 IL-10을 측정한 결과, LC를 도포한 모든 실험군에서 IL-10이 증가되었으나 특히 LC의 도포 및 경구투여군에서 유의성이 인정되었다 (Fig. 12). 이와 같은 결과는 LC가 IL-10를 11%이상 증가시켰다는 이 등6)의 보고와 상통되는 결과로 LC가 IL-10을 활성화시켜 DC의 염증을 억제시킨 기전으로 생각된다. 또한 염증 촉발 사이토카인인 TNF-α를 측정한 결과, LC를 도포한 모든 실험군에서 TNF-α 의 활성을 유의성 있게 억제하였다(Fig. 13). 이와 같 은 결과는 LC의 항염증 효과가 IL-10과 같은 면역억 제 cytokine의 활성을 촉진시키고, 또한 TNF-α와 같 은 염증촉진인자의 작용을 억제시킴으로써 효과를 발 휘하는 것으로 생각된다.
이상의 결과 LC는 알레르기성 접촉피부염에 유의 하게 항염증 반응을 나타내었고, 그 기전에 TH2의 사이토카인 중 하나인 IL-10의 면역억제기전이 작용 된 것으로 생각된다.
본 연구를 통해 忍冬藤 등의 한약이 근본적인 해결 책을 찾지 못하고 있는 알레르기성 접촉피부염 등 습 진성 피부질환의 증상을 개선하는 임상적 치료약으로 서 다양하게 활용 될 수 있음을 보여주었다. 향후 본 연구에서 확인하지 못한 추출 용매에 따른 효과 차이 를 비교 관찰하고, 또한 외용약과 내복약의 차이를 비 교하는 등의 후속 연구가 필요하다고 생각한다.
Ⅴ. 결 론
忍冬藤이 DNCB로 유발된 ACD에 미치는 영향을 관찰한 결과, 다음과 같은 결론을 얻었다.
1. SPR 및 SPR+ADM군에서 체중 증가율의 변화는 관찰할 수 없었고, 귀 두께의 증가는 유의하게 억 제하였다.
2. SPR+ADM군에서 귀의 무게는 유의하게 감소되었
고, 등 피부 두께 증가를 유의한 수준으로 억제하 였다.
3. SPR 및 SPR+ADM군에서 귀 조직의 두께 증가를 효율적으로 억제하였다.
4. SPR 및 SPR+ADM군에서 알레르기성 접촉피부염 의 증상인 홍반, 낙설 등을 감소시키는 경향을 보 였고, 피부 증상 정도는 유의하게 감소되었다.
5. SPR 및 SPR+ADM군에서 스폰지 조직 비후와 단 핵성 면역세포 침윤이 억제 되는 경향을 보였고, 비장/체중 비에 특별한 영향을 미치지 않았다.
6. 1㎎/㎖ 농도의 LC의 처리는 시험관 내에서 비장 세포 증식율을 유의하게 감소시켰다.
7. SPR 및 SPR+ADM군에서 특별한 비장세포 증식 율의 변화는 관찰되지 않았다.
8. SPR+ADM군에서 IL-10 함량은 유의하게 증가하 였다.
9. SPR 및 SPR+ADM군에서 TNF-α 함량은 유의하 게 감소하였다.
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