소포체 스트레스는 PKCε-ATF2 신호 전달을 통해 CAP2 발현을

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3.3. 소포체 스트레스는 PKCε-ATF2 신호 전달을 통해 CAP2

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vivo에서 ATF2가 이 CAP2 프로모터 영역 내에 결합하는 것을 확인하기 위해 thapsigargin을 처리 또는 처리하지 않은 Huh7세포에서 chromatin immunoprecipitation (ChIP)를 수행하였다. 면역 침강된 염색질은 CAP2 프로모터 특이적 primer를 이용하여 PCR하여 증폭하였다(ChIP-1 primer와 ChIP-2 primer, Table 3). 그 결과, thapsigargin 처리 후 ATF2가 CAP2의 프로모터 부위에 결합하고 있음을 확인한 반면(ChIP-1). 음성 대조군으로는 CAP2 유전자의 ATF2 부착 부위로부터 -2.5kb downstream에 결합하는 ChIP-2 primer를 이용한 PCR을 수행하였을 때, 예상대로 면역 침강된 시료로부터 어떠한 신호도 보이지 않았다(Figure 7D). 이러한 결과는 소포체 스트레스 자극에 의해 활성화된 전사인자 ATF2가 CAP2 프로모터에 결합하여 복합체를 형성함으로써 CAP2의 전사 발현을 조절할 수 있음을 의미하는 것이다. 이를 검증하기 위해 ATF2를 knockdown 시킨 간암세포에 thapsigargin을 처리한 결과, CAP2의 mRNA발현 및 단백질 발현이 감소되었다(Figure 8A-C). 상기 결과들을 종합하면, CAP2 전사 유도를 위해 ATF2의 활성화가 필요하다는 것을 시사한다.

ATF2는 다양한 자극에 반응하여 ERK1, JNK, p38, protein kinase epsilon(PKC)같은 스트레스 활성 단백질 인산화 효소에 의해 즉각적으로 인산화된다(Yamasaki et al., 2009; Lau and Ronai, 2012). 또한 전사인자인 ATF2는 암종에 따라서 종양 억제 활성 또는 종양 유발 활성을 유도 할 수 있다고 알려져 있다(Lau and Ronai, 2012). 이에 관련하여 소포체 스트레스가 유발된 간암 세포에서 ATF2 활성화에 관여하는 단백질 인산화 효소가 무엇인지 확인하고자 하였다. 이를 위해 SNU423과 Huh7 세포에 thapsigargin을 처리하였고, western blot 분석을 통해 활성화된 단백질 인산화 효소를 조사하였다. 그 결과, Figure 9A 와 같이 thapsigargin 처리된 세포에서 ERK, JNK, p38, PKC의 활성 형태(phospho form)가 검출되었다.

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검출된 인산화 효소 중 ATF2–CAP2 전사에 관련하여 소포체 스트레스에 의해 활성화되는 단백질 인산화 효소를 좀 더 특정하기 위해 스트레스에 의해 활성화되는 단백질 인산화 효소의 억제제를 처리하였다. 흥미롭게도, 소포체

스트레스에 의해 증가되었던 CAP2 mRNA 발현은 PKC

억제제(GF109203X)의 단독 처리만으로도 감소되었으나(Figure 9B), ERK1 (U0126, 20mM)이나 JNK (SP600125, 25mM), p38 (SB203580, 10mM) 억제제들을 단독으로 처리했을 경우에는 유의미한 발현 변화를 보이지 않았다(Figure 9C). 특히 JNK 억제제는 오히려 Huh7과 SNU423에서 공통적으로 CAP2의 발현을 증가시키는 효과를 보여주었는데, 이것은 JNK 억제제의 부작용에 대해 고려하지 못한 결과이다. SP600125는 JNK의 인산화를 억제하는 효과도 가지고 있지만 동시에 ATF2를 인산화 시킬 수 있는 p38을 인산화 시키는 효과도 가지고 있음을 확인하였다. 따라서 drug을 처리할 때에는, drug의 효과가 어떠한 작용에 의한 것인지, target-specific한 약물인지, 부작용은 무엇인지 확인하는 것이 필수적이다. 또한 drug은 target effect 외에 다른 효과를 보일 수 있다는 단점을 가지고 있어 target 억제 실험에 있어서 specific한 targeting이 가능한 siRNA를 가지고 검증하는 것이 더욱 좋은 방법이다. 이 경우엔 drug을 처리 후 ATF2의 인산화가 실제로 억제되었는지 검증하는 과정을 거치지 않은 것이 큰 오류로 작용하였다.

따라서 drug을 사용할 경우 target이 원하는 방향으로 억제 또는 유도되었는지 확인하는 과정이 필요하다는 것을 보여준다.

억제제 처리를 통해 얻은 결과를 검증하기 위해 siPKC을 형질 주입시켜 PKC을 knock down 시킨 결과, 앞서 보여준 데이터와 동일하게 thapsigargin에 의한 CAP2의 mRNA발현이 억제되는 것을 확인하였다(Figure 10A, B). 소포체 스트레스에 의해 활성화된 PKC이 ATF2의 인산화를 조절하여 CAP2 발현을 유도한다는 가설을 입증하기 위해 ATF2

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활성화(pATF2)가 PKC의 활성화를 통해 유도되었는지 여부를 조사했다.

예상대로, siPKC 처리는 thapsigargin 처리된 간암세포에서 ATF2의 활성화를 유의하게 억제하였다(Figure 10C). 이러한 결과는 소포체 스트레스를 받은 간암세포에서 CAP2의 전사를 조절하는데 있어 활성화된 PKC이 조절하는 ATF2의 활성화가 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.

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Figure 7. ATF2 binds to CAP2 promoter in ER stress. (A) Schematic representation of the CAP2 luciferase reporters. ChIP primer sets were also shown. (B and C) Huh7 cells were transiently co-transfected with pTurbo-GFP and deleted constructs (B) or ATF2 binding site mutated construct (ATF2-Mut) (C) of the CAP2 promoter. After treatment with 100 nM thapsigargin for 24 h, total RNA was extracted. Luciferase expression was monitored by qRT-PCR; all luciferase expression data were normalized to that of GFP mRNA (right). Data represent mean ± SEM of 3 independent experiments. (D) Cross-linked chromatin

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preparation from control and thapsigargin (100 nM, 24 h) treated cells were immunoprecipitated with anti-ATF2, anti-Histone H3 (H3), or normal rabbit IgG (IgG) antibodies. The ATF2 binding sites on the immunoprecipitated DNA was determined by RT-PCR using the primers.

Amplification of input chromatin (input) prior to immunoprecipitation were served as controls for chromatin extraction and PCR amplification.

Chromatin immunoprecipitation using a Histone H3 antibody served as a positive control (P.C) and a non-specific antibody (normal rabbit IgG) served as a negative control (N.C).

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Figure 8. Expression of ATF2 in HCC cells. (A) Huh7 cells were transient transfected with 100 nM siNegative control (siNeg) or siATF2. After 48 h post-transfection, the cells were harvested. The ATF2 mRNA expression levels were measured by qRT-PCR. Values were means ±SEM of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001. (B and C) Huh7 cells were transiently transfected with siNegative control (siNeg) or siATF2 and after 24 h, thapsigargin (100 nM) was treated for 24 h. CAP2 expression was monitored by qRT-PCR (B) and western blotting. * is indicated CAP2 (C). Data represent mean ± SEM of 3 independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001.

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Figure 9. Effect of inhibitors of stress-activated protein kinases on CAP2 mRNA expression. (A) SNU423 and Huh7 cells were treated with thapsigargin (50 nM and 100 nM, respectively) for the indicated times and cell lysates were examined by western blotting with the indicated antibodies. (B) SNU423 and Huh7 cells were treated with thapsigargin (50 nM and 100 nM, respectively) alone or with thapsigargin plus the PKCε inhibitor GF109203X (GF, 20 mM) for 24 h. Relative expression of CAP2 mRNA was measured by qRT-PCR. Data represent mean ± SEM of 3 independent experiments. (C) SNU423 and Huh7 cells were treated with thapsigargin (50 nM and 100 nM, respectively) alone, or with of ERK1 inhibitor (U0126, 20 μM), JNK inhibitor (SP600125, 25 μM), p38 inhibitor (SB203580, 10 μM), or PKCε inhibitor GF109203X (GF, 20 μ M) for 24 h. Relative mRNA expression levels of CAP2 were measured by qRT-PCR. Values were means ±SEM of three independent experiments.

*p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001.

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Figure 10. Expression of PKCε in HCC cells. SUN423 and Huh7 cells were transfected with 100 nM siNegative contol (siNeg) or siPKCε. After 48 h post-transfection, the cells were harvested. The PKCε mRNA levels were measured by qRT-PCR. Values were means ±SEM of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001. (B and C) SNU423 and Huh7 cells were transiently transfected with siNegative control (siNeg) or siPKCε and after 24 h, thapsigargin (100 nM) was treated for 24 h. CAP2 expression was measured by qRT-PCR. Data represent mean ± SEM of 3 independent experiments (B). ATF2 activation was monitored by western blotting with the indicated antibodies (C). *p<0.05, **p<0.01, and

***p<0.001.

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