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책임저자：정상영, 광주시 동구 학1동 8번지
501-757, 전남대학교 의과대학 외과학교실 Tel: 062-220-6472, 6456, Fax: 062-227-1635 E-mail: [email protected]
접수일：2007년 4월 8일, 게재승인일：2007년 5월 31일
FK506의 T 림프구 세포 독성 기전
전남대학교 의과대학 외과학교실
김광용ㆍ김광현ㆍ박찬용ㆍ최수진나ㆍ정상영
Cytotoxic Mechanism of FK506 on Human T Lymphocytes
Kwang Yong Kim, Gwang Hyun Kim, Chan Yong Park, Soo Jin Na Choi and Sang Young Chung
Purpose: FK506 (Tacrolimus) has been widely used as an immunosuppressant. We examined the effects of FK506 on the activation, proliferation and expression of cytotoxic effec- tor molecules of Jurkat human T-lymphocytes.
Methods: We investigated the effects of this compound on cell viability, the production of reactive oxygen species and mitochondrial dysfunction. The cells were cultured in the presence or absence of FK506. Flow cytometric analysis was performed after staining with PI. The viability of the Jurkat cells was decreased by the addition of FK506 in a dose-and time-dependent manners.
Results: FK506-induced cytotoxicity was characterized by G0/G1 phase cell-cycle arrest. FK506 induced cell death was confirmed by the caspase-3 protease activation. In addition, the pharmacologic scavenging study of reactive oxygen spe- cies (ROS), including H2O2, revealed that cytotoxicity was achieved by the generation of ROS, which might modulate the mitochondrial dysfunction.
Conclusion: These results suggest that FK506 functions in CDK4-cyclin D1 mediated cell-cycle arrest of Jurkat cells via generation of ROS and mitochondrial dysfunction. (J Korean Surg Soc 2007;73:191-197)
Key Words: FK 506, Tacrolimus, Human T lymphocyte, Jurkat cell, Immunosuppressant, Cytotoxic me- chanism
중심 단어: FK 506, Tacrolimus, 사람 T 림프구, Jurkat 세포, 면역억제제, 세포 독성
Department of Surgery, Chonnam National University Medi- cal School, Gwangju, Korea
서 론
면역 기능을 억제시키는 약물은 크게 네 가지로 분류할 수 있다. 첫째로 프레드니솔론(prednisolone)과 같은 코르티 코스테로이드(corticosteroid) 계통의 항염증제이고, 둘째로 아자치오프린(azathioprine)이나 사이클로포스파마이드(cy- clo-phosphamide) 등의 항대사제(antimetabolic drug), 셋째로 사이클로스포린(cyclosporine A)이나 FK506 (tacrolimus)과 같이 T 림프구 내의 신호 전달 과정을 억제하는 세균이나 진균 등에서 유래한 약물, 넷째로 단 클론이나 다 클론 항체 들이다. 이 중에서 FK506은 토양 진균인 Streptomyces tsu- kubaensis에서 얻어지는 마크롤라이드(macrolide)계 항생 물 질이다.
현재 이식 수술 후에 사용되는 면역 억제제는 calcineurin inhibitor인 사이클로스포린과 FK506이 주 면역 억제제로 널 리 쓰이고 있는데 급성 거부 반응의 감소에는 매우 효과적 이지만 심혈관 질환 같은 합병증을 유발할 수 있으며,(1) 그 가운데 FK506은 당뇨병이 더 흔하게 발생하고, 사이클로스 포린은 고혈압 및 고지혈증이 더 흔히 발생하는 것으로 알 려져 있다.(2)
FK506은 사이클로스포린 A와 구조적으로 다르지만 비슷 한 작용 기전을 가진다. 이 두 약제는 세포 내에서 immuno- philin이라는 수용체와 결합하는데, 사이클로스포린 A는 cyclophilin과 결합하고, FK506의 경우에는 FK506-binding protein (FKBP)와 결합한다.(3-5) 이 세포 내 수용체들은 peptidyl-prolyl isomerase 활성을 가지고 있어서 세포 내에서 단백질 샤페론으로 작용한다. 즉 약제와 immunophilin의 복 합체는 calcineurin과 결합하여 calcineurin의 기질인 nuclear factor of activated T cells (NF-AT)의 탈인산화를 억제함으로 써, NF-AT에 의한 각종 염증 유발성 사이토카인의 전사를 억제함이 보고되었다.(3,4) 그러나, 사이클로스포린 A에 비 교하여 FK506에 의한 T 림프구의 증식 억제에 대한 신호 전달 과정 및 작용 기전에 대한 연구가 미흡한 실정이다.
따라서 본 연구에서는 사람 T 림프구인 Jurkat 세포에 대한 FK506의 세포 독성 유도 현상, 세포 주기 신호 전달분자 및 미토콘드리아 기능 등에 관한 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
방 법 1) 재료
(1) 세포주: 사람 T 림프구 세포주인 Jurkat 세포는 한국 세포주 은행(KNCC, 서울대학교)으로부터 구입, 계대 배양 하면서 실험을 실시하였다.
(2) 시약 및 기기: 실험에 필요한 RPMI 1640, 항생제 및 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)은 GIBCO BRL사 (Grand Island, NY, USA)제품을, 배양 용기(24 well plate와 10 cm dish)는 Falcon사(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 에서 구입하여 사용하였다. 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyl tetrazolium bromide (MTT), DAPI, bicinchoninic acid (BCA), dimethyl sulfoxide (DMSO), Reduced glutathione (GSH), N-acetyl-L-cysteine (NAC)는 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
2) 방법
(1) Jurkat 세포주 배양 및 시약 처리: Jurkat 세포는 CO2
세포 배양기(37oC, 5% CO2)에서 10% 우태아 혈청이 포함된 RPMI 1640 배지로 배양하였으며, 24시간 간격으로 배양액 을 교체하여 log phase에 있는 세포에 FK506을 처리한 후 세포 독성 현상과 이에 연관된 생화학 실험을 수행하였다.
FK506은 10μM 농도로 DMSO에 녹여 －70oC에 보관하였 고, RPMI 1640 배지에 희석하여 사용하였다.
(2) 세포활성도 측정: 세포의 활성도 측정은 MTT 분석법 으로 측정하였다. 세포 배양판(24-well plate)에 세포(1×105 /mL)를 1 ml씩 분주하여 3시간 이상 CO2 세포배양기 안에 서 안정시킨 후 시료를 각각의 조건에 따라 처리하였다.
MTT 용액(5 mg/mL, phosphate buffered saline: PBS, pH7.4) 은 각각의 배양 세포에 배양액의 1/10을 첨가하여 4시간 반 응하였다. 살아있는 세포에 의해 생성된 보라색 formazan 은 10% SDS가 포함된 0.01N HCl 용액을 1 ml/well에 첨가 하여 용해시킨 후, 분광 광도계(THERMO max, USA)를 이 용하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포 활성 도는 정상 대조군과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.
(3) 세포 주기 분석(flow cytometry): 세포 주기에 미치는 영향을 알아보기 위해 propidium iodide (PI)로 DNA를 염색 한 후에 Flow cytometry (FACSCalibur, BD Biosciences, CA, USA)를 이용하여 형광의 세기를 측정하였다. 세포에 FK506 을 처리하여 시간별로 포집하여 PBS로 두 번 세척하였다.
세척한 세포(1×106)의 DNA는 PI 용액(0.1% Triton X-100, 20 μg/ml PI, 200μg/ml RNase)을 600μl로 20분 반응하였다. 유 식 세포 분석에서 얻은 정보의 분석은 CellQuest software (Becton Dickinson, CA, USA)를 이용하였다.
(4) Caspase계 cysteine protease 활성도 측정: FK506 처리 후 포집한 Jurkat 세포(1×106)를 4oC에서 15분 lysis buffer
(1% Triton X-100, 0.32 M sucrose, 10 mM Tris/HCl, pH 8.0, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 mM PMSF, 1μg/ml aprotinin, 1μg/ml leupeptin)로 용해하고 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하였다. 원심 분리하여 얻은 세포 파쇄액은 bicincho- ninic acid (BCA, Sigma Co. MO, USA)법으로 단백질을 정량 하고, 세포 파쇄액을 분석 완충 용액(100 mM HEPES, pH 7.5, 10% sucrose, 1.0% Chaps, 2 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 μg/ml aprotinin, 1μg/ml leupeptin)에 희석된 형광기질과 37oC에서 30분간 반응시켰다. Caspase protease의 활성 측정 은 fluorogenic substrate를 사용하였으며, 이 기질의 proteo- lytic cleavage에 의하여 생성되는 형광값의 차이를 형광 분 광 광도계(Molecular Devices Co, USA)로 측정하여 caspase 활성을 결정하였다.
(5) Western blot analysis: FK506을 처리한 Jurkat 세포는 포집하여, 냉 PBS로 2회 세척하였다. 얻어진 세포는 파쇄 용액(50 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% deoxy- cholate, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1μg/ml aprotinin)과 4oC 에서 30분 반응하였다. 동량의 세포 파쇄액(200μg)과 두 배 희석된 sample buffer를 혼합하여 100oC에서 3분 가열하여 단백질의 변성을 유도한 후에 12.5% 및 15% SDS-poly- acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 시행하였다. 전 기 영동이 끝난 gel의 단백질은 electrotransfer system (Ellard Inc, Seattle, WA, USA)을 이용(0.8 mA/cm)하여 nitrocellulose membrane으로 이동시키고, blocking buffer (5% skim milk)와 상온에서 2시간 반응하였다. cyclin D1, CDK4, p53, Bcl-2, Bak 및 actin에 대한 항체는 0.05% (v/v)의 tween-20이 함유 된 Tris-buffered saline (TBS-T)에 1：1,000으로 희석하여 ni- trocellulose membrane과 상온에서 2시간 반응하였으며, 각 항체에 대한 이차 항체 anti-rabbit IgG conjugated horse rad- ish peroxidase (HRP)와 anti-mouse IgG conjugated HRP는 TBS-T로 희석(1：3,000)하여 상온에서 1시간 반응한 후, en- hanced chemilluminescence (ECL) kit (Amersham, England)를 이용하여 현상하였다.
(6) 세포 내 ROS 생성의 측정: FK506에 의한 세포 내 활 성화 산소의 생성을 측정하기 위하여 형광 probe 2',7'-di- chlorofluorescein diacetate (DCF-DA; Sigma)를 이용하였다.
비형광 물질인 DCF-DA는 세포 내 hydrogen peroxide와 관 련된 peroxides 존재 시 형광의 DCF로 변환되어 녹색의 형 광을 발한다. Jurkat 세포에 FK506을 처리한 후 세포를 수확 하기 전에 5μM DCF-DA를 처리하여 37oC에서 30분 배양 하였다. 배양한 세포는 PBS (pH 7.4)로 세척하여 1% tryp- sin-EDTA 용액을 처리하여 세포를 수확하고, 다시 PBS로 세척하여 Flow cytometry (FACSCalibur, BD Biosciences, CA, USA)로 형광을 측정하고 CellQuest software (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
(7) 미토콘드리아 막전위 측정: 미토콘드리아 막전위의 변화를 조사하기 위하여 JC-1 염색을 시행하였다. FK506을
Fig. 1. FK506 decreased the viability of Jurkat cells in dose- and time-dependent manners. Cells were treated with various concentrations of FK506 for 72 hrs (A) or various periods (B) and then, viability was measured by MTT assay after FK506 treatment. Data represent the mean±standard deviation (S.D.) of quadruplicates. *P＜0.5, †P＜0.01 by Student's t-test, compared to control group.
Fig. 2. FK506 induced cell cycle arrest to G0/G1 phase on Jurkat cells in time-dependent manner. Cells were treated 10μM FK506 for (A) control, (B) 24 hrs, (C) 48 hrs, and (D) 72 hrs. After PI staining, the fluorescence intensity of more than 10,000 cells was analyzed using a flow cytometry. (A) Control, (B) 12 hrs, (C) 24 hrs, (D) 36 hrs.
처리한 세포는 포집하여 냉 PBS로 세척한 후 cytospin (Shandon Southern Products Ltd., England)으로 600 rpm, 3분 간 회전 분사하여 슬라이드 글라스에 부착시켰다. 슬라이 드 글라스에 부착된 세포는 PBS로 세척하여, 10μg/ml JC-1 과 20분간 실온에서 반응한 후 다시 PBS로 세척하여 형광 현미경(Leica MPS 60, Germany)으로 형광의 변화를 관찰하 였다.
(8) 통계처리: 표시된 결과는 3번 이상의 독립적인 실험 결과이며, 실험 결과의 통계 처리는 student's t-test에 준하여 처리하였고, P-value가 최대치 0.05 (P＜0.05) 이하인 경우를 유의한 것으로 판정하였다.
결 과
1) FK506이 T 림프구, Jurkat 세포의 세포 생존율에 미 치는 영향
FK506의 Jurkat 생존에 대한 영향을 조사하기 위하여 FK506을 다양한 농도로 72시간 처리한 후, 세포 활성도를 MTT 방법으로 조사하였다. FK506 0.625μM 농도에서 세포
생존율은 96%, 1.25μM 농도에서는 89%, 2.5μM 농도에서 는 77%, 5μM농도에서는 76%의 세포 생존율을 보였으며, 10μM의 농도에서는 대조군에 비교하여 64%의 세포 생존 율을 보였다(Fig. 1A). 또한, FK506에 의한 Jurkat 세포 죽음 의 시간 의존적인 변화를 확인하기 위하여 10μM 농도의 FK506을 처리한 후 시간별로 세포 생존율을 조사하였다.
Jurkat 세포의 생존율은 FK506 처리 12시간 후부터 감소하 기 시작하여, 72시간 이후에는 약 65%로 유의한 세포 생존 율의 감소를 보였다(Fig. 1B). 이상의 결과는 FK506에 의한 세포 독성이 Jurkat 세포에서 농도 및 시간 의존적으로 축적 되어 증가함을 보여주었다.
2) Jurkat 세포에서 FK506에 의한 세포 주기 및 관련 단백질의 발현 변화
FK506에 의한 Jurkat 세포의 세포사가 세포 주기의 변화 를 초래하는지 조사하기 위하여, FK506 (10μM)을 처리한 세포의 DNA를 PI 염색 후 유식세포 분석기(Flow cytometry) 를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 처리 24시간 후부터 G0/G1기의 정지가 축적되었으며, 72시간 이후 G0/G1 분획
Fig. 3. FK506 increased expression of cyclin D1 and CDK4 on Jurkat cells in time-dependent manner. Cells were treated with FK506 for 24 to 72 hrs. Cell lysates were separated on 15% SDS-PAGE and immunoblotted for anti-cyclin B1, CDK4, p53 and β-actin. The immunoreactive signals were visualized by ECL detection kit.
Fig. 4. FK506 increased the catalytic activity of caspase-3 protease of Jurkat cells in a dose-dependent manner. Cells were treated with 10μM FK506 for 12 to 72 hrs and lysed to measure the activity of caspase proteases by using fluoro- genic biosubstrates. Data represent the mean±S.D. of quadruplicates. *P＜0.05 by Student's t-test, compared to control group.
Fig. 5. Production of H2O2 in FK506 treated Jurkat cells. Cells were treated with 10μM FK506 for 12 to 36 hrs. Then, cells were incubated with the dye 2', 7'-dichlorofluorescin diacetate (5μM) and the fluorescence intensity of more than 10,000 cells was analyzed using a flow cytometry. (A) Control, (B) 12 hrs, (C) 24 hrs, (D) 36 hrs.
이 최대 64% 증가를 보였다(Fig. 2). 따라서, G0/G1기의 세 포사가 주로 초래됨을 알 수 있었다.
또한, 단백질의 발현 변화를 조사하기 위하여 western blot 을 수행하였다. FK506 처리 시 G0/G1기의 조절에 관여하는 cyclin D1 단백질의 발현이 시간 의존적으로 증가하였다. 또 한 CDK4도 동일한 양상이 관찰되었다. 그러나 p53의 발현 양상은 변화가 없었다(Fig. 3). 이때 단백질양은 β-actin을 통하여 동일한 양임을 확인하였다.
3) FK506에 의한 caspase-3 protease의 활성의 변화 세포 독성의 특징적인 현상을 초래하는 세포 내 신호 전 달 기전에서 caspase의 중요성이 이미 잘 알려져 있다.
FK506에 의한 Jurkat 세포 독성 현상이 caspase 활성화와 관 계가 있는지를 확인하기 위하여 caspase-3, -6, -8, 및 -9 pro- teases의 효소적 활성을 이들 효소의 형광 기질(fluorogenic substrate) 이용하여 조사하였다. Jurkat 세포는 FK506 (10μ M)을 처리하였으며 12시간 간격으로 caspase protease의 활 성을 측정하였다. 그 결과 caspase -6, -8, 및 -9 protease의 활성은 대조군에 비교하여 유의한 변화가 없었으나, cas- pase-3 protease는 시간 의존적으로 증가하여 FK506 처리 72 시간 후 대조군에 비하여 최대 3.8배의 증가된 활성을 보였
다(Fig. 4).
4) FK506에 의한 Jurkat 세포 죽음에서 세포 내 활성 산소 생성에 미치는 영향
FK506에 의한 세포 내 H2O2의 생성 변화를 flow cy- tometry를 통하여 조사하고 M2 값으로 표시하였다. 그 결 과, 10μM의 FK506을 처리 시 대조군인 52.0%에 비하여, 12시간에 53%, 24시간에 57.2%, 36시간에 92%로 시간 의존 적인 증가를 보였다(Fig. 5). 이상의 결과는 FK506에 의한 세포 내 활성 산소인 H2O2 생성이 세포 독성을 유도할 가능 성을 시사하였다.
5) FK506에 의한 Jurkat 세포 죽음에서 미토콘드리아 막전위 변화에 미치는 영향
미토콘드리아의 막전위차 변화를 확인하기 위하여 JC-1 형광 염색을 시행하였다. 10μM의 FK506을 Jurkat 세포주에
Fig. 6. Change of mitochondrial membrane potential tran- sition in FK506 treated Jur- kat cells. Cells were treated with 10μM FK506 for 12 to 36 hrs. FK506 treated cells were stained with 10 μg/ml of JC-1 visualized under a fluorescent micro- scope. The data were one of three independent ex- periments. (A) Control cells, and FK506 treated cells for (B) 12 hrs, (C) 24 hrs, (D) 36 hrs.
각각 12, 24 및 36시간 처리 후 JC-1으로 염색하여 형광 현 미경으로 관찰하였다. 그 결과 Jurkat 세포는 FK506을 처리 하지 않은 대조군 점상형(punctuated pattern)의 오렌지 형광 (Fig. 6A)이 녹색 형광으로 시간 의존적으로 변화하면서 미 만형(diffused pattern)으로 세포질 전체에 균질하게 분포하 였다(Fig. 6D). 이상의 결과는 FK506 처리가 Jurkat 세포의 미토콘드리아 막전위차 변화를 초래하였음을 시사하였다.
고 찰
장기 이식에서 극복해야 할 가장 큰 과제는 거부 반응과 세균 감염이다. 그러나, 사이클로스포린의 개발 이후 선택 적이면서도 강력한 면역 억제제들의 등장으로 이식 후 거 부 반응이 많이 해결되고 이식의 장기적 성적도 크게 향상 되었다. 특히, 면역 매개성 질환들의 최신 치료들은 수많은 천연 및 합성 물질에서 추출된 면역 억제제들이 이용되고 있다. 이들은 모두 작용 범위가 대단히 광범위하며, 거부 반 응뿐만 아니라 면역 기구의 정상적인 방어 기능들도 억제 한다. 현재 간, 신장, 췌장, 심장, 폐, 골수 이식 등 이식 환자 들에게 사이클로스포린 제제가 주요 면역 억제제로서 역할 을 해온 것은 20여년이 되며 그 이후 FK506 (tacrolimus)의 발견으로 이식 현황은 좀 더 다양한 발전을 해오고 있다.
이는 FK506이 좀 더 우수한 효능으로 보다 폭넓은 환자군
에게 효과를 나타내기 때문이다. FK506은 토양 진균인 Streptomyces tsukubaensis에서 얻어지는 마크롤라이드 (mac- rolide)계 항생 물질이다. 이는 1982년 일본에서 개발되어 1990년 미국 피츠버그대학 이식 팀이 간이식에 최초로 임 상을 실시하였고, 그 성공적인 결과를 바탕으로 현재는 전 세계에 걸쳐 신장, 췌장, 심장, 폐 및 골수이식에까지 널리 사용되고 있다.(1,2,6) 이는 사이클로스포린보다 10∼100배 정도 우수한 면역 억제 효과를 인정받음으로써 가능해졌다 고 할 수 있으며, 특히 간이식 환자에게 있어서 FK506의 효과는 사이클로스포린을 능가하여 거의 유일한 약제로 자 리매김되어, 근래는 간이식환자 과반수가 FK506을 복용하 고 있다고 알려져 있다.(6) 현재 국내에서는 신장과 간이식 에 허가가 되어 FK506 복용 환자수가 급격히 증가하는 추 세이고 췌장, 심장, 골수이식에서도 사용되는 등 FK506의 점유율이 점점 확대되고 있다. 또한 이런 이식환자들 중 사 이클로스포린으로 면역 억제가 되지 않아 이식받은 장기를 거부할 때 FK506으로 대체하면 효과를 나타내어 이식한 장 기 및 환자를 구할 수 있다.(7) 또한 이식 당시 콜레스테롤 수치가 높거나 고혈압 약을 복용하는 등 위험 요소를 많이 안고 있는 환자에게 FK506이 훨씬 안전한 약물임이 입증되 었다.(6) 소아 이식 환자의 경우 사이클로스포린과는 달리 FK506은 스테로이드 복용을 중단할 수 있기 때문에 특히 성장 억제 등 스테로이드로 인한 부작용을 최소화할 수 있
다.(8)
본 연구에서는 사람 T 림프구인 Jurkat 세포에 대한 FK506의 세포 죽음 유도 현상과 신호 전달 기전을 조사하 였다. 그 결과 FK506은 Jurkat 세포에 대해 시간 및 농도 의 존적인 세포 독성을 유도하였다.
세포 주기 조절 장치는 주로 섬유아 세포 및 조혈 세포를 통하여 많은 연구가 진행되어 왔다. 세포 분열 주기는 분열 기(M phase)와 간기(interphase)로 구분되며, 세포는 분열기 에는 핵분열(mitosis)과 세포질 분열(cytokinesis)이 1시간 이 내에 신속하게 일어나고 대부분의 시간을 간기에서 보내게 된다. 간기는 제1간기(G1 phase), 제2간기(G2 phase) 및 DNA 증식이 일어나는 합성기(S phase)로 구분된다.(9,10) 세포 주기는 여러 종류의 단백질에 의한 신호 전달에 의 하여 조절됨이 보고되고 있다.(11) Cyclin 계열의 단백질과 cyclin dependent kinase (CDK) 그리고 cyclin dependent kinase inhibitor (CDKI) 등의 발견과 이들 단백질에 대한 연구는 세포주기 조절에 대한 분자 생물학적 기전을 이해하는 데 크게 기여하였다.(12) 정상 세포의 핵 내에서 cyclin의 증가 에 의하여 CDK는 Rb 단백질의 serine 및 threonine을 인산화 시키고, 그 결과 Rb 단백질에 의해 억제되어 있던 E2F 같은 전사 인자들이 활성화 되면서 세포는 G1기에서 S기로 들어 가게 되어 세포증식이 기반이 마련된다.(13) 세포 주기 조 절 단백질인 cyclin D1과 CDK4, 6는 세포 주기의 G1기 초기 또는 중기에 결합하여 세포 주기의 진행에 영향을 미치며, cyclin E와 CDK2는 G1기의 말기에 결합하여 세포주기에 영 향을 미친다.(12) 이와 더불어 세포의 주기를 정확히 조절 하기 위하여 세포는 cyclin이나 CDK 같은 활성인자 외에도 p27kip1, p21WAF/CIP1 등의 CDK 억제인자(CDKI)들이 존재한 다.(14) 이들 중 p27kip1은 세포 내에서 항상 일정량으로 존재 하고 있으며 cyclin 혹은 cyclin-CDK 복합체와 결합하고, cy- clin A, B, D 및 E와도 결합할 수 있다. p27kip1은 cyclin D-CDK4 복합체 및 cyclin E-CDK 복합체와 결합하여 CDK 의 활성을 억제함으로써 Rb 단백질의 인산화를 억제한다.
분열 촉진 물질의 자극이 계속되면 cyclin D 및 cyclin E의 양이 계속 증가하여 상대적으로 고정된 양으로 존재하던 p27kip1은 희석되어 결국 CDK에 대한 억제 효과가 사라지고 Rb 단백질의 인산화가 가속되어 세포는 G1기에서 S기로 진행된다.(15) 본 연구에서는 세포 생존율의 결과를 바탕으 로 10μM의 FK506을 처리하여 시간별로 세포 주기 분석과 세포 주기 조절 물질의 발현을 연구하였다. 그 결과 10μM 의 FK506은 대조군과 비교하여, G0/G1주기는 증가, S주기 는 감소하였다. 또한 10μM의 FK506을 처리한 Jurkat T 세 포에서 세포 주기 조절 단백질의 발현을 알아보기 위하여 Western blotting을 시행하였다. 본 연구에서는 FK506이 cy- clin D1 및 CDK4의 발현을 촉진하였다. 따라서 FK506 처리 는 G1/S phase 이행 단계를 조절하는 cyclin D1 및 CDK4의 발현 증가시켰으나, 정상 세포와는 달리 G1 phase의 arrest
를 초래하였다. CDK 억제제인 p21, p53, pRb는 cyclin-CDK 복합체의 활성을 억제하여 G1-S기로의 진행을 억제하는 것 으로 알려져 있다. 즉 cyclin-CDK 복합체에 결합을 하여 kinase의 활성을 억제한다.(16,17) 본 실험에서도 p53과 Rb 단백질의 연관성을 조사하였으나, p53의 경우 발현에 차이 가 관찰되지 않았으며, Rb 단백질의 경우 발현 여부의 확인 이 불가능하였다. 따라서 G1/S phase arrest와 관련하여 Cyclin D1, CDK4, p53 및 Rb 단백질의 활성화에 대한 연구 가 요구된다.
활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 활성화된 호 중구, xanthine oxidase, 미토콘드리아 호흡 및 아라키돈산 대사 과정을 통해서 생성된다.(18) 비록 superoxide dis- mutase, catalase, glutathione peroxidase 효소 등이 세포 내에 서 생성된 활성산소종을 제거하기 위한 생리적 방어 기전 으로 작용하지만, 과도한 활성 산소종은 이들 방어 체계를 초과하여 세포 손상을 초래한다.(19) FK506 처리 시 세포 내 유의한 H2O2 생성 증가가 관찰되었다. 이러한 세포 내 활성 산소는 미토콘드리아 기능 이상에 의해 초래되거나, 반대로 미토콘드리아 기능 이상을 초래한다고 알려져 있 다.(20) 본 연구에서도 위 결과에 의한 미토콘드리아의 기 능 변화의 지표인 막전위차의 변화를 JC-1 형광 염색과 Bak 단백질의 발현 증가를 통하여 확인하였다.
사이클로스포린 A의 개발 이후 mycophenolate mofetil (MMF)의 이용과 더욱 강력한 면역 억제 기능을 가진 FK506의 가세로 면역 억제제의 선택과 병합 요법의 방법이 훨씬 다양해졌다.(21-23) 그러나 이와 같은 강력한 면역 억 제제는 수해자의 면역 체계를 억제함으로써 발생하는 여러 가지 합병증과 약제 부작용이 예상되기 때문에 이의 사용 과 선택에 주의를 기울여야만 한다. 지금까지 개발된 약제 들은 급성 거부 반응의 발생 빈도는 현저히 감소시켰으나 새로운 종양의 발생이나 당뇨의 발생, 신 및 간 독성, 그리 고 장기적으로 이식 장기의 혈관을 침범해서 만성 이식 장 기 기능 부전 등을 일으키고 있다.(24) 현재 국내에서는 자 체 개발한 약제는 없지만 이들 약제들이 수시로 수입되어 이미 서구에서 보고된 약물의 효과를 참고하여 서로 병용 또는 단독 사용하고 있는 실정이다. 조 등(25)은 신장 이식 후 면역 억제제로서 사이클로스포린 또는 FK506을 MMF와 병용하였을 경우, FK506과 병용 처리한 군에서 거부 반응 의 발생 빈도와 스테로이드 유지 용량에서 의미 있게 낮았 다고 보고하였다. 또한 FK506의 병용 처리 시 FK506의 용 량 조절을 통해 거부 반응의 억제 효과를 유지하면서 BK 바이러스 감염을 방지 방법 모색을 제안하였다.
결 론
이상의 결과를 종합하면, 첫째 FK506은 사람 T 림프구인 Jurkat 세포에 농도 및 시간 의존적인 세포 독성을 보였으
며, 둘째 G0/G1기의 정지를 통한 세포 독성 현상을 유도하 였으며, 셋째 Jurkat 세포에서 caspase-3 protease 활성화에 따 른 세포 독성을 유도하였다. 넷째 Jurkat 세포 내 활성 산소 인 H2O2의 생성 증가가 미토콘드리아의 기능 변화에 기여 하였다. 결론적으로 FK506은 caspase-3 protease의 활성화 등 을 통하여 사람 T 림프구의 세포 독성을 유도함을 확인하 였다. 그러나, 세포 주기 조절 인자에 대한 상호 작용 등의 추가적인 분자 생물학적 연구가 필요하며, 이는 면역 억제 제의 작용 기전에 대한 임상 적용의 과학적 기반을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
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