대한소화기학회지 1999;34:167 - 178
4)
접수: 1999년 2월 4일, 승인: 1999년 3월 13일
연락처: 정현채, 110-744, 서울시 종로구 연건동 28, 서울대학교 의과대학 내과학교실 Tel: (02) 740-8112, Fax: (02) 743-6701
H elic ob act er p y lori 수용성 추출물에 의한 인체 호중구로부터의 N eu t r op h il- a c t iv a t in g C h em ok in e 발현
서울대학교 의과대학 내과학교실, 간연구소, 한양대학교 의과대학 미생물학교실 및 의과학연구소*
김주성・정현채・김정목*・최일주・송인성・김정룡
E x p re s s i o n o f N e u t r o p h i l-a c t i v a t i n g Ch e m o k i n e s i n H u m a n N e u t r o p h i l s b y H el i c ob a c t er p yl or i Wa t e r E x t r a c t
J o o S u n g Ki m , M.D., H yu n Ch a e J u n g , M.D., J u n g Mo g g Kim , M.D.*, Il J u Ch o i, M.D., In S u n g S o n g , M.D. a n d Ch u n g Yo n g Ki m , M.D.
Department of Internal Medicine, Liver Research Institute,
Seoul National University College of Medicine, Seoul; Department of Microbiology and Institute of Biomedical Science*, Hanyang University College of Medicine, Seoul, Korea
Background/Aims: To elucidate mechanisms of the persistent neutrophil recruitment in Helicobacter pylori (H. pylori)-infected gastric mucosa, we evaluated the activation of human neutrophils and
expression of neutrophil-activating chemokines in neutrophils by H. pylori water extract (HPWE).Methods: HPWE was prepared from extraction of H. pylori surface proteins in distilled water. Hu
man neutrophils were obtained from healthy volunteers by Ficoll-Hypaque density gradient separation After neutrophils were stimulated with HPWE, mobilization of intracellular free calcium, expression of lymphocyte function-associated antigen-1β and secretion of myeloperoxidase (MPO) were deter mined in neutrophils. Electron microscopic findings and MPO levels were also evaluated in Hpylori-infected gastric mucosa. Expression of interleukin-8 (IL-8) and growth-related oncogenes
(GROs; GROα, GROβand GROγ) mRNA and protein was assessed by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction or enzyme linked immunosorbent assay. Results: HPWE enhanced the neutrophil activity in vitro and MPO levels in gastric mucosa were significantly correlated with H. pylori density or neutrophil activity. HPWE also upregulated the expression of IL-8 and GROs mRNA and protein by neutrophils. Conclusions: H. pylori-induced neutrophil recruitment may be mediated via neutrophil-activating chemokines expressed by neutrophils activated by H. pylori water-soluble surface proteins. (Kor J Gastroenterol 1999;34:167 - 178)Key Words: Helicobacter pylori, Neutrophil, Interleukin-8, Growth-related oncogenes, Quantitative
RT-PCR168 대한소화기학회지 : 제 34 권 제 2 호 1999
서 론
Helicobacter pylori는 만성 위염 및 재발성 소화 성 궤양의 중요한 원인인자이며,1-3 최근에는 위선암 및 위림프종(gastric mucosa-associated lymphoid tis- sue lymphoma)과도 관련이 있음이 밝혀졌다.4,5 H.
pylori가 비침습성 세균임에도 불구하고 H. pylori 감 염의 위점막 반응은 호중구, 단핵구 및 림프구 등의 염증세포들이 점막으로 침윤하는 것이 특징적인데, 특히 호중구의 침윤이 뚜렷하다.6 조직에 침윤된 호 중구 수가 증가될수록 반응성 산소대사물 및 단백분 해효소들의 분비량이 증가되어 조직 손상에 기인한 소화성 궤양이 유발될 수 있다. 그러나 H. pylori에 감염된 위점막에서 지속적으로 호중구가 유입되는 정확한 기전은 아직까지 규명되지 못하였다.
CXC chemokine이 호중구에 대한 화학주성을 나 타내고 활성화시키는 친염증성(proinflammatory) cy- tokine임이 확인된 후,7 H. pylori로 유발된 위점막의 염증반응에서 매우 중요한 역할을 담당할 것으로 생 각되고 있다. H. pylori를 인체 위상피세포주에 감염 시킨 연구8,9 및 H. pylori에 감염된 인체 위점막을 대 상으로 한 연구10에서 chemokine mRNA 발현 및 단 백질 분비가 증가되었음이 보고된 바 있다. 최근 저 자들은 H. pylori 배양상청액에 의하여 인체 호중구 가 활성화되고, 활성화된 호중구에서 interleukin-8 (IL-8) 발현이 증가되었음을 보고한 바 있다.11 혈관 내피세포를 통과하여 조직에 침윤된 호중구는 IL-8 을 분비하여 다른 호중구를 끌어들임으로써 염증반 응 및 조직 손상을 증폭시킬 수 있을 것이다. CXC chemokine 중에서 IL-8과 유사하게 호중구를 끌어들 이고 활성화시키는 것으로 알려진 growth-related oncogene (GROs; GROα, GROβ및 GROγ)은 여러 감염 및 면역 신호에 대하여 호중구에서 발현이 증 가되었음이 보고되었다.12,13 H. pylori에 감염된 인체 위점막에서 GROα가 증가됨이 보고14,15되었으나 유 전자 발현을 정량적으로 측정한 경우는 없었다. 더 군다나 H. pylori 표면의 수용성 단백질이 호중구로 부터의 GROs 유전자 및 단백질 발현을 상향 조절하 는 지를 보고한 적이 없었다. 이에 저자들은 H.
pylori에 감염된 인체 위점막에서 호중구 침윤의 증 폭기전을 확인하기 위하여 H. pylori 표면의 수용성 단백질에 의하여 인체 호중구가 활성화되는지를 확 인하고 호중구에서 IL-8 및 GROs 등의 neutrophil- activating chemokine의 발현이 증가되는가를 규명 하며, H. pylori에 감염된 위점막에서 호중구의 활성 도를 조사하였다.
대상 및 방법
1. H . py lori 수용성 추출물(w a t e r ex t r a ct ) 제조
1) H . p y lori 균주
본 연구에 사용된 H. pylori 균주(HP99)는 서울대 학교병원에 내원한 십이지장궤양 환자의 위점막에 서 분리한 후 병독유전자 및 공포성 세포독소 생성 을 확인하였다.11 HP99은 cagA+/cytotoxin+ 이었다.
2) H . p y lori 수용성 추출물 제조
HP99를 계대배양 횟수가 10회를 넘지 않는 범위 내에서 대량으로 배양하였다. H. pylori 수용성 추출 물은 이전의 보고16에서 약간 변형된 방법으로 제조 하였다. 배양된 균을 증류수에 1010/mL의 농도로 부 유시키고 부유액을 실온에 10분 동안 둔 다음 20초 동안 vortexing 하였다. 12,000 rpm으로 15분 동안 원심분리한 후 상청액을 -70℃에 보관하였다. 사용 직전에 18,000 rpm으로 20분 동안 원심분리한 후 상 청액을 0.2 μm 필터에 통과시켰다.
3) H . p y lori 수용성 추출물에서의 성분 확인 H. pylori 수용성 추출물에서의 총 단백량17 및 urease 활성도11,18를 이전의 보고와 동일하게 측정하 였다. 총 단백량은 3.3 mg/mL이었고, urease 활성도 는 91 U/mL이었으며 urease 특이활성도는 27.6 U/
mg of protein/mL이었다. H. pylori 수용성 추출물에 서 lipopolysaccharide (LPS) 함유량을 확인하기 위하 여 Limulus amebocyte lysate assay (Pyrotell test, Associates of Cape Cod, Inc., Falmouth, MA, USA) 를 이용하여 endotoxin 활성도를 측정하였다. Lyo- philized standard endotoxin이 들어 있는 tube에 H.
김주성 외 5인. H. pylori에 의한 호중구로부터의 Chemokine 발현 169
pylori 수용성 추출물 200 μL를 넣고 잘 섞은 다음 37℃에서 1시간 동안 둔 후 gel clot이 일어나는지를 확인하였다. Endotoxin 활성도는 gel clot이 일어나 는 최소량의 U.S. standard endotoxin unit (EU)로 정 의하였다. 본 연구에 사용되었던 H. pylori 수용성 추출물에서의 endotoxin 활성도는 0.125 EU/mL이었 다.
2. 인체 호중구의 분리 및 배양 1) 호중구의 분리
건강한 공혈자의 말초혈액에서 분리된 buffy coat 에 2% dextran 용액을 첨가하여 30분 동안 실온에 두었다. 그 상청액에 1/4 volume의 Histopaque-1077 (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 1,450 rpm 으로 30분 동안 원심분리한 후 침전된 pellet을 얻었 다. 남아 있는 적혈구는 0.2% NaCl로 처리하여 완전 히 제거하였고, 순수분리된 호중구를 phosphate-buf- fered saline (PBS)으로 세척하여 실험에 사용하였다.
2) 생존도 및 순도 확인
Hemacytometer로 세포 수를 측정한 후 trypan blue exclusion test로 세포의 생존도를 확인하였다.
세포 형태를 현미경으로 확인하고 단핵구에 특이적 인 fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti- CD14 antibody (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용한 flow cytometry (Becton Dickinson) 로 단핵구 오염 정도를 측정함으로써 순도를 확인하 였다. 호중구의 생존도 및 순도가 각각 95%를 넘는 경우에 다음 실험으로 진행하였다.
3) 호중구의 배양
RPMI-1640 media (Sigma)에 10 mM HEPES (Sigma), 2 mM L-glutamine 및 10% fetal bovine serum (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA)을 첨 가하여 호중구를 배양하였으며, 배양용기는 호중구 의 활성화를 방지하기 위하여 polypropylene tube를 사용하였다.
3. 호중구에 H . p y lori 수용성 추출물 투여 호중구 세포 수가 5×106/mL이 되도록 배양액에
suspension 시킨 후 배양액만 넣은 대조군과 H.
pylori 수용성 추출물을 첨가(50 μL/mL)한 군을 각 각 배양시켰다. 0, 1, 2, 4, 9시간째에 각각 원심분리 하여 cell pellet으로 flow cytometry 시행 및 RNA를 추출하였고, 상청액은 ELISA를 시행하기 위하여 -70℃에 보관하였다.
4. 호중구의 활성도 측정
1) 호중구에서의 [Ca 2+]i m ob iliz a t ion
호중구 내의 free calcium ([Ca2+]i) 변화를 형광 calcium 표지자인 fluo-3 AM으로 염색한 후 confo- cal laser scanning microscopy로 관찰하였다. 호중구 107/mL를 2 μM fluo-3 AM (Molecular Probes, Eu gene, OR, USA)을 포함한 RPMI-1640 배양액에 넣 어 37℃에서 30분 동안 배양하였다. RPMI-1640 배 양액으로 2회 세척한 후 calcium- and magnesium- free PBS로 세척하여 세포 외의 fluo-3 AM을 제거 한 후 PBS로 resuspension시켰다. H. pylori 수용성 추출물을 넣고 10분 동안 상온에서 배양한 후 con- focal laser scanning microscopy (MRC-1200, Bio- Rad, Hercules, CA, USA)로 관찰하여 대조군과 비 교하였다.
2) 호중구 표면의 ly m phoc y t e f un c t ion - a s - s ocia t ed a n t ig en - 1 발현
호중구 표면에 있는 부착성 물질(adhesion mole- cule)의 일종인 lymphocyte function-associated anti- gen-1 (LFA-1 ) 발현을 flow cytometry로 분석하였 다. 방법은 각 시간대의 sample에서 2×106 세포를 취하여 PBS 200 μL로 부유시킨 다음 FITC-conju- gated anti-LFA-1 antibody (Becton Dickinson) 10 μL와 혼합하여 4℃에서 30분 동안 방치시킨 후 PBS로 washing 한 다음, 2% paraformaldehyde로 고 정시켰다. 각 세포에서의 fluorescence intensity는 FACS scanner (Becton Dickinson)를 이용한 flow cytometry로 분석하였다.
3) 호중구 배양상청액에서 m y e lope r ox ida s e 단백질 양의 측정
자극군 및 대조군에서 각 시간대별로 호중구로부
170 The Korean Journal of Gastroenterology : Vol. 34, No. 2, 1999
터 분비된 myeloperoxidase 단백질을 ELISA 방법으 로 측정하였다. 인체 myeloperoxidase에 대한 단세 포군 항체가 coating된 microtiter plate에 배양상청액 과 표준 myeloperoxidase를 가한 다음, 일정 시간 배 양한 후 결합되지 않은 myeloperoxidase를 제거하였 다. Biotin과 결합된 myeloperoxidase에 대한 polyclonal antibody을 일정 시간 동안 가한 뒤 결합 되지 않은 항체-효소 결합체를 제거한 다음, alkaline phosphatase와 결합된 avidin을 가하였다. 기질용액 (4-nitrophenyl-phosphate)을 첨가하여 실온에서 15분 동안 발색시켰다. 2 N 황산을 사용하여 반응 정지 후 405 nm의 파장에서 ELISA reader (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA, USA)로 광학지수 (optical density)를 측정하였다. 이상의 전과정은 OXIS International, Inc사 (Portland, OR, USA)가 개 발한 kit (BIOXYTECH MPO enzyme immunoassay) 를 이용하였다. Myeloperoxidase의 측정 한계치는 1.6 ng/ mL이었다.
5. 호중구의 RNA 추출 및 역전사 P CR 1) 호중구로부터 RNA 추출
대조군과 H. pylori 수용성 추출물군에서 각 시간 대별로 guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform법 을 이용하여 호중구로부터 RNA를 추출하였다.
2) 역전사
추출한 0.5 μg RNA를 0.1 μg oligo (dT)15 및 50 unit 역전사효소(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, Gibco Research Laboratories, Gaithersburg, MD, USA)와 함께 37℃에서 60분 동 안 반응시켜 cDNA를 만들었다. 이때 사용된 buffer는 10 mM Tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM씩의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP로 구성되었다.
3) c DNA P CR
상기 방법으로 만든 cDNA를 10 mM Tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 μM씩의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 그리고 25 pmole씩의 sense primer와 antisenser primer가 포함된 50 μL의 buffer에서 PCR thermal cycler로 증폭시켰다. 반응 액을 95℃에서 5분간 가열한 후 85℃에서 7분 가량
유지시키면서 각 반응관에 2.5 unit의 Taq DNA polymerase를 첨가하였다. 증폭프로그램은 IL-8, GROα, GROβ, GRO 및 -actin 모두 95℃에서 45 초간 denaturation시키고, 65℃에서 1분 45초 동안 annealing과 extension이 일어나도록 하였다. 이와 같은 cycle의 총 횟수는 28회로 정하였다. 음성 대조 군으로는 cDNA 합성 과정에서 RNA 대신 증류수 를 넣은 것을 사용하고, 양성 대조군으로는 IL-8 mRNA를 발현하는 것으로 알려진 5637 인체 방광 암세포주(ATCC HTB 9)와 -actin의 경우 HUT 78 인체 T 림프종세포주(ATCC TIB 161)로부터 추출 한 RNA를 이용하였으며, GROα, GROβ, GROγ의 양성 대조군은 phytohemagglutinin (Sigma)으로 자 극한 말초혈액 단핵구에서 추출한 RNA를 이용하였 다. PCR이 끝난 후 2% NuSieve agarose gel로 전기 영동하여 band를 확인하였다.
6. C he m okin e m RNA 의 정량적 분석 추출한 1.2 μg RNA와 연속 희석한 표준 RNA를 동일한 시험관에 넣고 역전사를 시행하였다. 이렇게 얻은 cDNA에 각 chemokine에 특이한 primer를 이 용하여 PCR을 시행한 후 PCR product를 전기영동 하여 polaroid film에 영상을 기록하였다.19,20 Po- laroid film을 영상밀도계(imaging densitometer GS- 670, BioRad, Hercules, CA, USA)로 처리하여 각 PCR band의 peak에 해당하는 면적을 구하였다. 그 후 목표 RNA로부터의 PCR product와 표준 RNA로 부터의 PCR product 면적 비를 이중 로그스케일을 이용하여 첨가된 세포 RNA 양과 표준 RNA 분자수 에 대하여 plot하여 표준곡선을 그린 뒤, 등전점 (equimolar point)을 구하여 mRNA 양을 계산하였다.
7. 호중구 배양상청액에서 ch em okin e 단백질 양의 측정
자극군 및 대조군에서 각 시간대별로 호중구로부 터 분비된 IL-8 및 GROα단백질을 ELISA 방법으로 측정하였다.21 인체 chemokine에 대한 단세포군 항 체가 coating된 microtiter plate에 배양상청액과 표준 chemokine을 가한 다음, 일정 시간 배양한 후 결합 되지 않은 chemokine을 제거하였다. Horseradish
Kim, et al. Chemokine Expression in Neutrophils by H. pylori 171
peroxidase와 결합된 chemokine에 대한 polyclonal antibody을 일정 시간 동안 가한 뒤 결합되지 않은 항체-효소 결합체를 제거한 다음, 기질용액과 hy- drogen peroxide를 첨가하여 실온에서 20분 동안 발 색시켰다. 2 N 황산을 사용하여 반응 정지 후 450 nm의 파장에서 ELISA reader로 광학지수를 측정하 였다. 이상의 전과정은 R&D Systems사 (Minneapolis, MN, USA)가 개발한 kit (Quantikine human IL-8 or GROαimmunoassay)를 이용하였다.
본 연구에서 chemokine 측정한계는 16 pg/mL이었 다.
8. 위점막조직에서의 호중구 활성도
소화불량증으로 진단적 내시경을 시행받은 30명 의 환자의 위점막을 채취하여 호중구의 활성도를 조 사하였다. 내시경적 진단은 정상(n=16, 평균 연령:
46세, H. pylori 양성률: 63%) 및 위염(n=14, 평균 연 령: 49세, H. pylori 양성률: 79%)이었다. 내시경 겸 자를 이용하여 위전정부의 정상 점막 부위에서 5조 각을 채취하였다; 1조각은 rapid urease test (CLO test, Delta West, Australia), 2조각은 조직학적 관찰, 1조각은 전자현미경 관찰 및 1조각은 myeloperoxi- dase 양을 측정하는 데 사용되었다. 또한, 체부에서 조직학적 관찰을 위하여 2조각의 점막생검이 시행 되었다. H. pylori 밀도(density) 및 호중구 침윤 활성 도는 updated Sydney system22에서의 normal, mild, moderate 및 marked에 일치하게 0, 1, 2, 3으로 gra ding하여 평가하였다.
생체 내에서 H. pylori에 의하여 호중구가 활성화 되었는지를 확인하기 위하여 전자현미경적 관찰로 위점막에서 호중구의 transendothelial migration 및 transepithelial migration을 확인하였으며, ELISA 방 법으로 점막에서의 myeloperoxidase 양을 조사하였 다. 내시경적 생검조직을 2.5% glutaraldehyde로 고 정한 후 1% osmium tetroxide로 후 고정하였다. 조 직을 에탄올 용액에 순차적으로 탈수시킨 후 Epon 에 포매하였다. 40-60 nm의 초세절편을 1% uranyl acetate 및 lead hydroxide에 염색한 후 전자현미경 (H-700, Hitachi, Japan)으로 관찰하였다. Myelo- peroxidase 양도 위점막조직에서 측정하였다. 생검
조직을 0.5 mL PBS에 넣은 후 즉시 조직분쇄기 (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA)로 균일화 시켰다. 14,000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 후 그 상청액을 얻어서 총 단백량은 Lowry method로 측정하였고, myeloperoxidase 양은 ELISA kit (OXIS International, Inc,)로 측정하였다. 본 연구에서의 ELISA 민감도는 0.8 ng/mL이었다. 통계적 분석은 Spearman rank test를 이용하였으며, p<0.05이었을 때 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
결 과
1. 호중구의 활성도
1) 호중구에서의 [Ca 2+]i m ob iliz a t ion
호중구 내의 Ca2+ 변화를 형광 calcium 표지자인 fluo-3 AM으로 염색한 후 confocal laser scanning
Fig. 1. [Ca2+]i mobilization in neutrophils. Confocal laser scanning microscopy after loading with fluo-3 AM showed enhanced fluorescence emission in neutrophils stimulated with H. pylori water extract (B) compared with controls (A).
172 대한소화기학회지 : 제 34 권 제 2 호 1999
microscopy로 관찰한 결과 H. pylori 수용성 추출물 로 자극한 호중구에서의 형광강도가 대조군에 비해 높았다(Fig. 1).
2) 호중구 표면의 LF A- 1 발현도
호중구 표면의 LFA-1 (CD18) 발현을 flow cytometry로 측정한 결과 대조군에서는 평균 형광강 도(mean intensity of fluorescence)가 4시간까지 변화 가 없다가 9시간째에 급격한 감소를 보였으나, H.
pylori 수용성 추출물을 투여한 군에서는 1시간째부 터 증가하여 2시간째에 정점에 도달한 후 시간이 지 남에 따라 서서히 감소되었다(Fig. 2).
3) 호중구 배양상청액에서 m y e lope r ox ida s e 단백질 양
호중구 배양상청액에서 ELISA로 측정한 myelo- peroxidase 단백질 양은 전체 시간대에서 H. pylori 수용성 추출물을 투여한 군이 대조군보다 많았다.
H. pylori 수용성 추출물을 투여한 군에서의 myelo- peroxidase 양은 지속적으로 증가하였으나, 대조군에 서는 4시간까지의 증가폭이 적었고 9시간째에는 감 소되었다(Fig. 3).
2. 호중구에서 발현된 chemokine mRNA 정량 대조군 및 H. pylori 수용성 추출물을 투여한 군에 서 각 시간대별로 chemokine mRNA 정량을 시행하 였다. 대조군 및 H. pylori 수용성 추출물을 투여한 군에서 얻은 RNA 분자수를 각 시간대별로 측정하 여 IL-8 mRNA 비를 구한 결과 1, 2, 4, 9시간째에 각각 18, 61, 39, 22배로 H. pylori 수용성 추출물을 투여한 군에서 발현이 증가되었다. 각 시간대별 GROαmRNA 비는 29, 70, 13, 12배 이었고, GRO β및 GROγ mRNA 비는 각각 15, 10, 18, 38배 및 10, 6, 6, 19배이었다(Table 1).
3. 호중구 배양상청액에서의 IL- 8 및 G ROα 단백질 양
대조군 및 H. pylori 수용성 추출물을 투여한 군에 서 각 시간대별로 IL-8 및 GROα단백질 양을 ELISA로 측정한 결과, 대조군에서는 시간에 따른
변화가 거의 없었으나 H. pylori 수용성 추출물을 투 여한 군에서는 시간이 지나면서 IL-8 (Fig. 4A) 및 GROα(Fig. 4B) 단백질 양이 증가되었으며 특히 2-4시간에서 급격한 증가를 보였다.
Fig. 2. Expression of LFA-1 on the surface of neutro- phils. After neutrophils were co-cultured with H. pylori water extract (HPWE) or culture medium only (control) for 1, 2, 4 and 9 hours, neutrophils were stained with FITC-conjugated LFA-1 monoclonal antibody, respecti- vely. Mean intensity of fluorescence (arbitrary value) was analyzed by flow cytometry. The data are expressed as means±SEM from three separate experiments.
Fig. 3. Myeloperoxidase production by neutrophils sti- mulated with H. pylori water extract (HPWE). After neutrophils were co-cultured with H. pylori water extract or culture medium only (control) for 1, 2, 4 and 9 hours, culture supernatant was obtained, respectively. Myelo- peroxidase levels were analyzed by ELISA. The data are expressed as means±SEM from three separate experi- ments.
김주성 외 5인. H. pylori에 의한 호중구로부터의 Chemokine 발현 173
4. 위점막조직에서의 호중구 활성도
H. pylori에 감염된 위점막조직을 전자현미경으로 관찰하였을 때 여러 단계의 활성화된 호중구들이 관 찰되었다: 혈관내피세포에 호중구가 부착된 후
transendothelial migration이 관찰되었으며(Fig. 5A), lamina propria 내의 호중구가 점막 선(gland)에 침윤 한 transepithelial migration이 관찰되었다(Fig. 5B).
반면에 H. pylori에 감염되지 않은 경우는 상기 소견 들이 관찰되지 않았다. 위점막에서의 myeloperoxi
Table 1. Chemokine mRNA Expression by Neutrophils Stimulated with H. pylori Water Extract
Incubation time (hours) Control* Stimulation* Ratio (stimulation/control) IL-8
1 2 4 9 GROα
1 2 4 9 GROβ
1 2 4 9 GROγ
1 2 4 9
5.0×106 2.8×106 2.1×106 1.7×106 5.6×106 2.3×106 1.9×106 1.3×106 6.8×106 6.9×106 5.6×105 1.7×105 2.0×106 3.7×106 1.3×106 1.0×105
8.9×107 1.7×108 8.2×107 3.7×107 1.6×108 1.6×108 2.5×107 1.5×107 1.0×108 7.1×107 9.8×106 6.4×106 2.0×107 2.4×107 8.0×106 1.9×106
18 61 39 22 29 70 13 12 15 10 18 38 10 6 6 19
* The data are expressed as the number of mRNA transcripts/μg of total cellular RNA.
Fig. 4. Secretion of chmokine proteins in neutrophils. After neutrophils had been cultured with H. pylori water extract (HPWE) or medium only (control) for 1, 2, 4, and 9 hours, neutrophil culture supernatant was obtained. Levels of IL-8 (A) and GROα (B) were analyzed by ELISA. The data are expressed as means±SEM of three separate experiments.
174 The Korean Journal of Gastroenterology : Vol. 34, No. 2, 1999
dase 양은 H. pylori 밀도(Fig. 6) 및 호중구 침윤정 도(Fig. 7)와 통계적으로 의미 있게 상관관계가 높았 다. 특히 myeloperoxidase 양과 H. pylori 밀도와의 상관계수가 호중구 침윤 정도의 경우보다 상관계수 가 높게 나타났다.
고 찰
H. pylori 감염에 의한 만성 활동성 위염의 조직학 적 소견은 호중구를 위시한 다수의 염증세포들의 위 점막 침윤이다. 특히 지속적인 호중구의 침윤이 특 Fig. 5. Transmission electron microcopic findings of H. pylori-infected gastric antral mucosa. There were the evidences of neutrophil activation by H. pylori: transendothelial migration of a neutrophil (A, ×16,100) and infiltration of neutrophils in a mucosal gland showing transepithelial migration (B, ×3,500).
Fig. 6. The correlation between myeloperoxidase levels and grades of H. pylori density in gastric antral mucosa.
H. pylori density was assessed on a scale of four grades according to the updated Sydney system. Myeloperoxidase levels in biopsy homogenate supernatants were measured by ELISA.
Fig. 7. The correlation between myeloperoxidase levels and grades of neutrophil activity in gastric antral mucosa.
Neutrophil activity was assessed on a scale of four grades according to the updated Sydney system. Myeloperoxidase levels in biopsy homogenate supernatants were measured by ELISA.
Kim, et al. Chemokine Expression in Neutrophils by H. pylori 175
징적인데, 위점막 염증세포 중 호중구의 비율이 높 으면 H. pylori 감염의 특이도 및 양성 예측도가 높 은 것으로 알려졌으며,23 H. pylori를 박멸하면 위점 막 내 호중구 수가 감소하는 것으로 알려졌다.24 H.
pylori가 비침습성 세균임에도 불구하고 지속적인 염증반응을 유발할 수 있다는 사실에 그 기전을 규 명하고자 많은 연구가 시행되었다. 그 중에서도 호 중구를 끌어들이고 활성화시키는 CXC chemokine 에 대한 관심이 집중되었다. 가장 잘 알려진 IL-8 이 외에도 GROs 및 epithelial cell-derived neutrophil-activating peptide-78 (ENA-78) 등이 있는 데, 그 중 호중구에서 발현되는 것으로 보고된 것은 IL-8 및 GROs이다. GROα는 흑색종(melanoma) 세 포의 성장인자라는 특성으로 MGSA (melanoma growth stimulatory activity)라고 불려지다가 인체 정 상세포에서도 여러 친염증성 자극에 대하여 생성되 어 호중구 유입 및 활성화를 촉진시키는 것으로 알 려졌다.12,13 GROβ, GROγ는 GROα와 아미노산 상 동(homology)이 각각 90%, 86%로 유사하나 아직 발현 및 생물학적 활성도에 대한 정보는 부족한 실 정이다.
본 연구에 사용되었던 H. pylori 수용성 추출물은 세포벽의 LPS를 거의 함유하지 않으면서 많은 양의 urease를 포함하였다. H. pylori LPS가 인체 호중구 를 활성화시키지만25 다른 세균 LPS에 의해서도 호 중구가 활성화되며, H. pylori 분비 물질에는 LPS가 없는 점을 고려하면 H. pylori 수용성 단백질 제조에 서 LPS를 제거하는 것이 호중구 활성화 유도 평가 에 중요할 것이다. H. pylori 표면의 urease는 위점막 정착 및 상피세포 손상에 중요한 역할을 담당한다.
암모니아와 물이 평형을 이루어 생성된 ammonium hydroxide는 위점막세포에 직접적 독성을 일으키 며,26 점액층 내에 높은 암모니아 농도는 수소이온 투과성을 증가시켜 위궤양 형성을 유도할 수 있다.27 또한, urease는 인체 백혈구에 대한 강력한 화학주성 인자로서 호중구 및 단핵구를 모집하고 활성화시켜 서 위점막 손상을 유발하는 것으로 알려졌다.28,29
H. pylori 수용성 추출물에 의하여 인체 호중구가 활성화되는지를 초기 단계에서부터 최종 단계까지 3 가지 방법을 사용하여 확인하였다. 첫째, 초기 단계
확인으로 호중구 내의 Ca2+ 변화를 관찰하였는데, 세포가 자극을 받으면 세포 내에 격리되어 있던 Ca2+이 방출되면서 세포 내 Ca2+이 증가하게 된다.
Ca2+이 증가함으로써 여러 cytokine 생성과 관련된 신호전달체계가 활성화된다.30 둘째, 중간 단계 확인 으로 호중구 표면에 있는 부착성 물질의 발현 정도 를 측정하였다. 혈액 내의 호중구가 염증 부위로 침 윤하기 위해서는 내피세포 틈을 통과하여야 하는데, 호중구 표면의 부착성 물질 중의 하나인 LFA-1 발 현이 증가되어 내피세포 표면에 발현되어 있는 intercellular adhesion molecule-1 등의 부착성 물질 과 결합하는 과정이 매우 중요하다. 셋째, 최종 단계 확인으로 호중구의 일차 과립에서 분비되는 myelo- peroxidase 양을 측정하였다. Myeloperoxidase는 호 중구의 세균 살상에 필수적인 구성 성분으로 외부 자극에 대한 호중구 활성화 정도를 확인하는 데 사 용되어 왔다.31 상기 3가지 방법에 의한 호중구 활성 화 정도를 확인하였을 때 H. pylori 수용성 추출물 투여군에서 대조군에 비해 Ca2+ 형광강도가 높았으 며, 시간 경과에 따른 LFA-1 발현도 및 myelo- peroxidase 분비량이 높아서 일정 시간 동안 호중구 의 활성이 지속되고 있음을 알 수 있었다. 생체 내 에서도 H. pylori 감염에 대하여 호중구가 활성화되 었음이 확인되어 본 연구의 시험관적 실험 결과를 입증해 주었다.
활성화된 호중구에 의한 조직 손상은 여러 기전 에 의해 일어날 수 있다. 산소 라디칼 등의 반응성 산소 대사물, hypochlorous acid (HOCl), 아라키돈산 대사물 및 호중구에서 분비되는 단백분해효소 등의 작용으로 발생한다. HOCl은 강력한 산화제로 많은 생물질 (biologic substances)에 영향을 미치며,32 H.
pylori urease에 의해 생성된 암모니아와 결합하여 위점막세포에 독성을 나타내는 monochloramine을 발생시킨다.33 그러므로 소화성 궤양 특히 위궤양의 경우 H. pylori 제균요법과 병행하여 위점막에서의 호중구 활성도를 낮추는 약제를 투여하면 궤양 치유 의 질(quality of ulcer healing)을 향상시킨다는 보고 34에 유념할 필요가 있을 것이다.
인체 호중구를 분리하여 배양액에 부유시키는 즉 시 RNA를 추출하여 IL-8 및 GROs에 대한 RT-PCR
176 대한소화기학회지 : 제 34 권 제 2 호 1999
결과, 호중구로부터 IL-8 및 GROs mRNA가 기본적 으로 발현(constitutive expression)하고 있음을 확인 하였다. H. pylori 수용성 추출물로 자극한 후 1, 2, 4, 9시간째의 IL-8 mRNA를 정량하여 배양액만을 넣은 대조군과 비교한 결과 18-61배로 발현이 증가 되었음을 확인하였으며, 2시간째 가장 높은 발현치 를 보였고 대조군과 비교하였을 때 가장 높은 발현 비를 나타내었다. 이는 친염증성 cytokine 투여 후 호중구 IL-8 mRNA 발현이 2시간에서 정점에 도달 했던 기존의 보고와 일치하였다.35 GROαmRNA 발 현 양상도 IL-8과 유사하여 대조군에 비해 12-70배 로 증가하였으며 2시간째 가장 높은 발현치 및 발현 비를 나타내었다. 또한, GROβ및 GROγ mRNA 발현치는 자극 후 2시간째 가장 높았으나 대조군과 비교한 발현비는 각각 10-38배 및 6-19배로 증가폭 이 작았으며 9시간째 가장 높게 나타났다. 인체 위 점막세포에서 GROαmRNA 및 단백질 양을 조사한 결과 H. pylori에 감염된 위점막에서 GROα발현 정 도가 높아서 위점막의 염증반응에 기여하였을 것이 라는 보고들14,15이 있어서 호중구뿐만 아니라 위상 피세포에서도 GROα발현이 상향 조절될 수 있을 것이라고 생각된다. 이러한 mRNA의 증가가 단백질 분비로 이어지는지를 ELISA로 측정한 결과 H.
pylori 수용성 추출물 투여군에서 시간 경과에 따라 IL-8 및 GROα분비가 증폭되었음을 확인하였다.
특히 2-4시간대에서 분비가 급격히 증폭되었는데, 이는 mRNA 발현의 정점이 2시간째이었음을 고려 하면 순차적인 단백질 분비로 진행되었음을 설명해 주는 것이다.
결론적으로 H. pylori 표면의 수용성 단백질에 의 하여 호중구가 활성화되고, 활성화된 호중구에서 neutrophil-activating chemokine 유전자가 상향 조절 되어 호중구 유입이 증가됨으로써 H. pylori 감염에 의한 호중구의 위점막 침윤이 증폭될 수 있다고 생 각된다. 이는 비침습성 세균인 H. pylori에 의한 위 점막에서의 염증반응을 설명하는 한 기전이라고 추 정된다.
요 약
목적: Helicobacter pylori는 비침습성 세균임에도 불구하고 감염 후 위점막에는 다양한 염증세포가 침윤하는데, 특히 호중구의 침윤이 특징적이다. H.
pylori로부터 분비되는 수용성 단백질이 점막 내로 흡수된 후 호중구에 대한 화학주성인자로 작용하는 것으로 알려졌으나 그 정확한 기전은 아직 규명되 지 못하였다. 이에 저자들은 H. pylori 감염시 조직 에 침윤한 호중구로부터 interleukin-8 (IL-8), GRO α, GROβ 및 GROγ 등의 neutrophil-activating chemokine 발현이 증가하여 염증반응 및 조직 손상 을 증폭시킨다는 가설을 제기하고, 이를 규명하고자 H. pylori 수용성 추출물(water extract)에 의하여 호 중구가 활성화되는지 확인하고, 생체 내에서의 호중
구 활성도를 측정하며, 호중구로부터
neutrophil-activating chemokine의 유전자 및 단백질 발현이 증가되는 지를 확인하고자 하였다. 대상 및 방법: cagA+/ cytotoxin+ H. pylori를 증류수에 부유 하여 수용성 추출물을 제조하였다. 호중구는 건강한 공혈자의 buffy coat에서 density gradient separation 방법으로 분리하였다. H. pylori 수용성 추출물을 호 중구에 투여한 후, 호중구 활성화 정도를 확인하기 위하여 [Ca2+]i mobilization을 confocal laser scanning microscopy로 관찰하였으며, 호중구 표면에 있는 lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1 ) 의 발현을 flow cytometry로 분석하였고, 호중구 배 양상청액 내의 myeloperoxidase 단백질 양을 ELISA 로 측정하였다. 호중구 자극 후 1, 2, 4, 9시간째 RNA를 추출하여 IL-8, GROs (GROα, GROβ, GROγ) mRNA의 발현을 표준 합성 RNA를 이용한 정량적 역전사 PCR로 조사하여 대조군과 비교하였 다. Chemokine 유전자 발현이 단백질 분비로 이어 지는지를 확인하기 위하여 호중구 배양상청액에서 IL-8 ELISA를 시행하였다. 위점막 생검조직에서의
호중구 활성도는 전자현미경 관찰 및
myeloperoxidase 양 측정으로 평가하였다. 결과: H.
pylori 수용성 추출물로 자극하였을 때 호중구 내 [Ca2+]i 형광강도가 증가하였으며, 자극군에서의 LFA-1 발현 및 myeloperoxidase 양은 대조군에 비 하여 증가되었다. Chemokine mRNA 정량 결과 IL-8 및 GROs 모두 자극 2시간째에 정점에 도달하
김주성 외 5인. H. pylori에 의한 호중구로부터의 Chemokine 발현 177
였으며, 그 중 IL-8 및 GROα가 대조군에 비해 각각 61배, 70배로 뚜렷이 증가되었다. IL-8 단백질 양은 시간 경과에 따라 증가되었으며, 특히 2시간에서 4 시간 사이에 급격히 증가되었다. H. pylori에 감염된 위점막에서 여러 단계의 활성화된 호중구를 관찰할 수 있었으며, 위점막에서의 myeloperoxidase 양은 H. pylori 밀도 및 호중구 침윤 정도와 상관관계가 높았다. 결론: H. pylori 표면의 수용성 단백질에 의 하여 호중구가 활성화되고, 활성화된 호중구에서 neutrophil-activating chemokine 유전자가 상향 조절 되어 호중구 유입이 증가됨으로써 H. pylori 감염에 의한 호중구의 위점막 침윤이 증폭될 수 있다고 생 각된다.
색인단어: H. pylori, 호중구, interleukin-8, growth- related oncogenes, 정량적 역전사 PCR
감사의 글
본 연구에서 정량적 역전사 PCR에 사용된 GRO 표준 합성 RNA를 제공하여 주신 울산의대 소화기 내과의 양석균 선생님께 감사드립니다.
참 고 문 헌
1. Warren JR, Marshall BJ. Unidentified curved bacill on gastric epithelium in active chronic gastritis Lancet 1983;1:1273-1275.
2. Marshall BJ. Helicobacter pylori: the etiologic agen for peptic ulcer. JAMA 1995;274:1064-1066.
3. Hopkins RJ, Girardi LS, Turney EA. Relationship between Helicobacter pylori eradication and reduced duodenal and gastric ulcer recurrence: a review Gastroenterology 1996;110:1244-1252.
4. Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, et al Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N Engl J Med 1991;325:1127-1131.
5. Wotherspoon AC, Ortiz-Hidalgo C, Falzon MR Isaacson PG. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet 1991
338:1175-1176.
6. Sobala GM, Crabtree JE, Dixon MF, et al. Acute Helicobacter pylori infection: clinical features, loca and systemic immune response, gastric mucosal his- tology, and gastric juice ascorbic acid concentra- tions. Gut 1991;32:1415-1418.
7. Baggiolini M, Dewald B, Moser B. Interleukin-8 and related chemotactic cytokines-CXC and CC che mokines. Adv Immunol 1994;55:97-179.
8. Jung HC, Kim JM, Song IS, Kim CY. Helicobacte pylori induces an array of proinflammatory cyto kines in human gastric epithelial cells: quantification of mRNA for interleukin-8, -1α/β, granulocyte- macrophage colony-stimulating factor, monocyte chemoattractant protein-1 and tumor necrosis factor- α. J Gastroenterol Hepatol 1997;12:473-480.
9. Sharma SA, Tummuru MKR, Miller GG, Blazer MJ Interleukin-8 response of gastric epithelial cell lines to Helicobacter pylori stimulation in vitro. Infec Immun 1995;63:1681-1687.
10. Loach LA, Bosma NB, Jansen J, Hoek FJ, van Deventer SJ, Tytgat GN. Mucosal tumor necrosis factor-α, interleukin-1β, and interleukin-8 produc tion in patients with Helicobacter pylori. Scand J Gastroenterol 1994;29:425-9.
11. Kim JS, Jung HC, Kim JM, Song IS, Kim CY Interleukin-8 expression by human neutrophils acti vated by Helicobacter pylori soluble proteins. Scand J Gastroenterol 1998;33:1249-1255.
12. Geiser T, Dewald B, Ehrengruber MU, Clark-Lewis I, Baggiolini M. The interleukin-8-related chemo tactic cytokines GROα, GROβ, and GROγ acti vate human neutrophil and basophil leukocytes. J Biol Chem 1993;268:15419-15424.
13. Ahuja SK, Murphy PM. The CXC chemokines growth-related oncogene (GRO) α, GROβ, GRO γ, neutrophil-activating peptide-2, and epithelial cell-derived neutrophil-activating peptide-78 are potent agonists for the type B, but not the type A human interleukin-8 receptor. J Biol Chem 1996 271:20545-20550.
14. Shimoyama T, Crabtree JE. Mucosal chemokines in
178 The Korean Journal of Gastroenterology : Vol. 34, No. 2, 1999
Helicobacter pylori infection. J Physiol Pharmacol 1997;48:315-323.
15. Yamaoka Y, Kita M, Kodama T, et al. Chemokine in the gastric mucosa in Helicobacter pylori infec- tion. Gut 1998;42:609-617.
16. Kurose I, Granger DN, Evans DJ Jr, et al. Helico bacter pylori-induced microvascular protein leakage in rats: role of neutrophils, mast cells, and platelets Gastroenterology 1994;107:70-79.
17. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem 1951;193:265-275.
18. Dunn BE, Campbell G, Perez-Perez GI, Blazer MJ Purification and characterization of Helicobacter pylori urease. J Biol Chem 1990;265:9464-9469.
19. Jung HC, Eckmann L, Yang SK, et al. A distinc array of proinflammatory cytokines is expressed in human colon epithelial cells in response to bacterial invasion. J Clin Invest 1995;95:55-65.
20. Yang SK, Eckmann L, Panja A, Kagnoff MF Differential and regulated expression of C-X-C, C-C and C-chemokines by human colon epithelial cells Gastroenterology 1997;113:1214-1223.
21. Eckmann L, Jung HC, Schuerer-Maly C-C, et al Differential cytokine expression by human intestinal epithelial cell lines: regulated expression of inter leukin-8. Gastroenterology 1993;105:1689-1697.
22. Dixon MF, Genta RM, Yardley JH, Correa P Classification and grading of gastritis. The updated Sydney System. International Workshop on the His topathology of Gastritis, Houston 1994. Am J Surg Pathol 1996;20:1161-1181.
23. Hansing RL, D' Amico H, Levy M, Guillan RA Prediction of Helicobacter pylori in gastric specimen by inflammatory and morphological histologic evaluation. Am J Gastroenterol 1992;87:1125-1131.
24. Genta RM, Lew GM, Graham DY. Changes in the gastric mucosa following eradication of Helicobacter pylori. Mod Pathol 1993;6:281-289.
25. Nielsen H, Birkholz S, Anderson LP, Moran AP.
Neutrophil activation by Helicobacter pylori lipo- polysaccharide. J Infect Dis 1994;170:135-139.
26. Smoot DT, Mobley HLT, Chippendale GR, Lewison JF, Resau JH. Helicobacter pylori urease activity is toxic to human gastric epithelial cells. Infect Immun 1990;58:1992-1994.
27. Desai MA, Vadgama PM. An in vitro study of en hanced H+ diffusion by urease action on urea Implication for Helicobacter pylori-associated peptic ulceration. Scand J Gastroenterol 1993;28:915-919.
28. Craig PM, Territo MC, Karnes WE, Walsh JH. Heli cobacter pylori secrete a chemotactic factor for monocytes and neutrophils. Gut 1992;33:1020-1023.
29. Harris PR, Mobley HLT, Perez-Perez GI, Blaser MJ Smith PD. Helicobacter pylori urease is a poten stimulus of mononuclear phagocyte activation and inflammatory cytokine production. Gastroenterology 1996;111:419-425.
30. Schöndorf M, Bidlingmaier F, von Ruecker AA Protein kinase C regulates IL-8 and fMLP induced cytoplasmic Ca2+ increase in human granulocytes by receptor modulation measurements by flow cyto metry. Biochem Biophys Res Commun 1993;197:
549-555.
31. Nörgaard A, Anderson LP, Neilson H. Neutrophi degranulation by Helicobacter pylori proteins. Gut 1995;36:354-357.
32. Weiss SJ. Tissue destruction by neutrophils. N Eng J Med 1989;320:365-376.
33. Dekigai H, Murakami M, Kita T. Mechanism o Helicobacter pylori-associated gastric mucosal in jury. Dig Dis Sci 1995;40:1332-1339.
34. Arakawa T, Kobayashi K, Yoshikawa T, Tarnawsk A. Rebamipide: overview of its mechanisms of action and efficacy in mucosal protection and ulce healing. Dig Dis Sci 1998;43(suppl):5S-13S.
35. Strieter RM, Kasahara K, Allen RM, et al. Cyto kine-induced neutrophil-derived interleukin-8. Am J Pathol 1992;141:397-407.
