Effects of Acupuncture and Radix Astragali Aqua-acupuncture at Synsu(BL23) on Transcriptional Expression of Mouse Cytokine IL-4

腎兪穴의 鍼刺戟과 黃芪藥鍼이 실험용 생쥐의 면역활성 Cytokine인 IL-4 유전자발현에 미치는 영향

김법진¹․박수영¹․김창환¹․김철호²․문진영³․최달영⁴․김준기⁴․박선동⁵․박원환¹

동국대학교 한의과대학 진단학교실¹, 생화학교실², 경혈학교실³, 병리학교실⁴, 방제학교실⁵

Effects of Acupuncture and Radix Astragali Aqua-acupuncture at Synsu(BL

) on Transcriptional Expression of Mouse

Cytokine IL-4

Beob-Jin Kim

․Soo-Young Park

․Chang-Hwan Kim

․Cherl-Ho Kim

․Jin-Young Moon

․ Dall-Yeong Choi

․Jun-Kee Kim

․Sun-Dong Park

․Won-Hwan Park

Dept. of Diagnostics¹, Dept. of Biochemistry², Dept. of AM-Meridian & Pointology³, Dept. of Pathology⁴, Dept. of Prescription⁵,

College of Oriental Medicne, Dong-Guk University

Abstract¹⁾

Acupuncture and Radix Astragali aqua-acupuncture stimuli have many been used to cure human diseases. However, it still remains to be unknown on its action mechanism, physiolosical and biochemical aspects. Thus, many attempts were made to show the scientific background covering the above mentioned mechanisms. Most recent studies show that these tests improve blood circulatory system and increase leucocyte counts. In this study, we have applied the acupuncture stimuli to mouse Synsu(BL23), which is a stimulative point of oriental medicine, to see if cytokine such as IL-4 can be detected. Mice were treated with lipopolysaccharide(LPS) for inflammation induction, and then reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) using each primer set was performed to trace the amounts of mRNA. The results are summarized as follow ;

1. IL-4 was expressed in LPS-nontreated mouse at 30min after acupuncture-stimuli, however, hardly expressed in after 1, 2hrs.

2. IL-4 was continuously expressed in LPS-treated mouse at 30min to 3hrs after acupuncture-stimuli, especially highly expressed at 30 to 60min. And IL-4 was a little decreased after 3hrs but was continuosly expressed.

3. IL-4 was highly expressed in LPS-nontreated mouse at 15min after Radix Astragali aqua-acupuncture stimuli, and expression of IL-4 gradually decreased at 30min to 3hrs.

4. IL-4 was gradually expressed in LPS-treated mouse at 30min to 3hrs after Radix Astragali aqua-acupuncture stimuli, especially highly expressed after 1hr.

Therefore, IL-4 in LPS-treated mouse was expressed more effectively than that of LPS-nontreated mouse after acupuncture and Radix Astragali aqua-acupuncture stimuli. And in LPS-treated mouse IL-4

•교신저자 : 박원환, 경북 경주시 석장동 707 동국대학교 한의과대학 진단학교실, el. 054-770-2373, Fax. 054-749-5117, E-mail : [email protected]

J . K or. A M – M e rid ia n & P o in to lo g y S oc.

서 론

인체는 “正氣存內, 邪不可干”

이라 하여 내 적인 정기가 강건하면 사기가 침입하지 못하 고, “陰平陽秘”

라 하여 陰氣가 平順하고, 陽氣 가 固守하여 상호 조절함으로써 상대적 평형을 유지하여 정상적인 생명활동을 유지하려는 기 본조건을 갖추고 있다. 또한 “邪之所溱, 其氣必 虛”

라고 하여 인체의 내적인 정기 손상이 선행함으로써 외부의 사기가 침입하여 질병이 발생할 수 있다고 하였는데, 이러한 관점은 현 대 면역학의 이론과도 부합되는 것으로 생각된 다

. 현대 면역학에서는 생체는 사기의 침습에 대하여 내부환경을 항상적으로 유지하는 면역 조절기구를 통하여 생체자신을 방어하고 있다 고 하였으며, 이에 대하여 조기에 대응하는 면 역활성조절물질로는 interleukin-1α, interleu- kin-1β, interleukin-2, interleukin-3, interleu- kin-4, interleukin-5, interleukin-6, tumor necrosis factor(α,β) 등을 들 수 있다

. 이들 은 그 생물학적 작용의 다양성, 생성세포의 다 양성으로 생체의 항상성을 유지시키는 기본적 인 호르몬의 일종일 것으로 생각되고 있다

. 한의학에서는 인체의 각종 질병에 대하여 침 과 약침제재를 이용한 치료가 광범위하게 이루 어져 오고 있다. 특히 침자극은 인체에 흐르고 있는 경락과 경혈들을 침으로 자극하여 체내의 신경과 기혈을 원활히 순환시킴으로써 질병의 치료는 물론, 예방에 높은 효과를 나타내고 있

다

. 최근 연구에 의하면 침자극은 병균에 대

한 면역 물질인 백혈구를 만들고 증가시킴으로 써 그 비율을 적절히 조절하여 여러 신체 기관

의 운동, 분비, 흡수 및 자양 등의 기능에 도움 을 주어 질병의 예방과 치료효과를 나타내게 한다고 하였다

. 또한 약침요법은 한의학의 경락이론을 바탕으로 특정 수혈에 한약제를 주 입하여 정신기혈, 오장육부의 기능을 조절하여 질병을 치료하는 방법으로써, 약물이 흡수되는 과정에서 위장관을 통한 분해 및 대사과정을 거치지 않으므로 소량으로도 원하는 효과를 얻 을 수 있으며 효과가 직접적이라는 장점이 있

다

. 특히 약침요법의 면역증강 효과에 대해

서 주

, 이

, 이

등에 의하여 연구가 진행되 고 있다. 현재 한의학적 치료법이 가지는 면역 증강작용에 대한 많은 연구가 현재 진행되고

있는데

, 그러나 대부분의 연구에서 생물 활

성이 in vitro계에서 검색된 것으로써 실제 in

성에 대해서는 불명확한 상태에 있다

.

본 논문은 신수혈(BL

)의 침자극과 황기약 침을 이용하여 생체내에서 일어나는 유전자반 응을 관찰한 것으로써, 실험용 생쥐의 면역활 성물질인 cytokine의 IL-4 발현을 추적하였다.

신수혈은 신의 배수혈로 신장의 기능을 왕성하 게 하여 그 결과 생명력이 고무되고 일신이 강 건해지는 혈이고

, 황기(Radix Astragali)는 補脾昇陽, 益衛固表, 益氣昇陽, 托瘡生肌의 효 과가 있어 기허를 치료하는 약으로 이용되고 있으며, 황기약침이 인체 면역력

및 IL-1α

23)

, IFN-γ

등의 유전자발현에 영향을 미친 다는 보고가 있다. 이에 저자는 신수혈의 침자 극과 황기약침을 이용하여 면역체계의 Inter- leukin-4의 유전자 발현능을 관찰하였던 바 유 의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

after Radix Astragali aqua-acupuncture stimuli was expressed more effectively than after acupuncture stimuli. On the other hand, now, we are in progress to elucidate the immunological action mechanism of acupuncture and Radix Astragali aqua-acupuncture stimuli. And cytokine IL-4 can be used not only basis of the effect of acupuncture and Radix Astragali aqua-acupuncture but a diagnostic guide through the immunological actions of those.

Key Words : Acupuncture and Radix Astragali aqua-acupuncture stimuli, Synsu(BL23), Cytokine, IL-4, Lipopolysaccharide(LPS)

재료 및 방법

1. 재 료

1) Primer for IL-4 (sense/antisense)

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ 5'-ATGGGTCTCACCTCCCAACTG-3'

5'-TCAGCTCGAACACTTTGAATATTTCTCT CTCAT-3'

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ 2) 약침 제조

본 실험에서 황기 약침액을 제조하기 위하여 황기 (Radix Astragali)를 동국대학교 부속한 방병원에서 구입하여 사용하였다. 먼저 황기 300g 분량을 3000ml 둥근 플라스크에 증류수 2,000ml과 함께 넣은 다음 냉각기를 부착시켜 2시간 동안 전탕하여 여과하였다. 여액은 rotary evaporatory로 감압농축하고 농축액에 증류수를 가하여 전량이 200ml이 되도록 한 다음, 실온까지 냉각하고 ethanol(Hayman limited, Witham, England)을 가하여 75%

ethanol 용액으로 되게 한 다음, 교반하고 냉장 상태로 방치하여 생성된 침전물을 여별하였다.

여액을 다시 rotary evaporatory로 감압농축한 농축액에 증류수 100ml을 가하고 용해시킨 후, ethanol을 가하여 85% ethanol 용액으로 되게 한 다음 교반하고 냉장상태로 방치하여 생성된 침전물을 여별하였다. 여액을 다시 rotary evaporatory로 감압농축한 농축액에 증류수 100ml을 가하고 용해시킨 후, ethanol을 가하 여 95% ethanol 용액으로 되게 한 다음 교반 하고 냉장상태에서 방치하여 생성된 침전물을 여별하였다. 여액을 다시 rotary evaporatory 로 감압농축하여 생성된 농축액에 생리식염수 를 가하고 1N NaOH로 pH 6-7로 조절하여 전 량이 1,000ml이 되게 한 다음, 냉장상태에서 24시간 방치한 후 membrane filter (0.2μm, φ 47mm, Whatman, England)로 여과한 후 가 압멸균하여 약침액으로 사용하였다.

3) 약침기

1.0 ml의 1회용 주사기(26G, Bobin Medica Co., Korea)를 사용하였다.

4) 실험동물

체중 25∼30g의 ICR계 웅성 생쥐를 물과 고 형사료(실험동물생쥐용, 삼양유지)를 충분히 공 급하면서 2주 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.

5) 시약 및 기구

Primer는 TaKaRa co.(Tokyo, Japan)에서 합성주문하여 사용하였다. Agarose, Ethidium bromide, DEPC 등 실험에 사용한 시약들은 SIGMA사에서 구입한 특급품을 사용하였고, RT-PCR kit는 TaKaRa사의 제품을 사용했다.

실험에 사용한 증류수는 모두 멸균된 3차 증류 수를 사용하고 RT-PCR시 모든 시약 및 기구 를 DEPC-H

O로 처치 하여 사용하고 전과정 을 polyglove를 착용한 상태에서 실시했다.

2. 실험방법

1) 침처치, 혈액채취 및 침자극 조직세포의 분리

생쥐를 고정시킨후 인체의 신수혈(BL

)에 해부학적으로 상응하는 부위를 골도법에 의하 여 취혈하였다. 침자극원에 대한 반응을 실험 하기 위하여, 신수혈에 자침만 하는 경우와 LPS 전처치 후 자침을 하는 경우의 두가지로 나누어서 실험을 실시하였으며 5분간 유침을 하였다. 또한 자침하기전을 control로 하고 발 침 후 15분, 30분, 1시간, 3시간 단위로 또는 각 실험조건에 맞게 시간별로 생쥐의 안와에서 채혈하였다. 한편, 혈액이외에 침자극을 준 각 조직을 분리하여 RNA 분리재료로 사용하였다.

LPS 전처치는 lipopolysaccharide 20㎍/mouse 을 투여하였고 12시간이 경과 된 다음 자침을 실시하였다.

황기약침에 대한 반응도 침자극원에 대한 반

응처럼 약침만 처치하는 경우와 LPS전처치후 약침처치를 하는 경우의 두 가지로 나누어서 실험을 하였다. 약침만을 처치하는 경우는 생 쥐를 고정시키고 신수혈에 황기약침액 0.1 ml/

mouse을 처치한 다음 15분, 30분, 1시간, 3시 간 단위로 혈액을 생쥐의 안와에서 채취한 것 이고, LPS 전처치후 약침처치를 하는 경우는 LPS (20 ㎍/mouse)를 처치한 다음 12시간이 경과한 후에 생쥐를 고정시키고, 신수혈에 황 기약침액 0.1 ml/mouse을 처치한 다음 15분, 30분, 1시간, 3시간 단위로 혈액을 채취한 것이 다.

2) 혈액으로부터 RNA 분리

Total RNA는 RNA isolation kit (TaKaRa,

Co., Japan)를 이용하여 생쥐의 혈액으로부터 추출하였다. 생쥐로부터 100 ㎕의 혈액을 채취 한 다음, catrimox-14

이 담겨져 있는 micro- tube에 첨가하였다. 이때 sample을 격렬하게 혼합해 주고, 상온에서 10분 이상 놓아둔 후, 12,000rpm에서 5분 동안 원심분리를 하였다.

현탁액은 버리고 1 ml의 멸균수를 가지고 조심 스럽게 침전물을 씻어 주었다. 0.5 ml lithium reagent을 첨가하여 pellet을 씻어준 후 잘 혼 합해 주었다. 탁상용 원심분리기를 이용하여 15,000rpm에서 5분 동안 원심분리를 하였다.

이때 현탁액은 버리고 침전물만을 취하여 차가 운 70% ethanol로 씻어 주었다. Speed bag을 이용하여 pellet을 건조시킨후, 0.1% DEPC가 들어 있는 멸균수 20 ㎕로 RNA를 용해시켰다.

가능하면 바로 다음 실험에 이용하고, 저장시 에는 -70

C에 보관하여 사용하였다.

3) Reverse Transcription-Polymerization Chain Reaction (RT-PCR)

Reverse transcription은 생쥐의 혈액을 취 한 후, reverse transcriptase (TaKaRa Co, Japan)를 이용하여 실시하였다. 각 sample의 total RNA은 50 pM random 9 mer, 5 mM MgCl

, 1 mM dNTP, 1 U/㎕ RNase inhibi- tor, 0.25 U/㎕ reverse transcriptase를 1 x

PCR buffer에 혼합하고, 이 reverse transcrip- tase solution을 위에서 분리된 RNA 9.5 ㎕ (

≤ 1 ㎍ total RNA)와 잘 혼합하였고 탁상용 원심분리기를 이용하여 몇초 동안 원심 분리하 였다. cDNA를 만들기 위한 반응 조건으로 30

C에서 10분, 42

C에서 30분, 99

C에서 5분 동안 incubation시켰다. Reverse transcription 의 반응 종결은 5

C에서 5분 동안 놓아 둠으로 써 끝냈다. 위에서 얻어진 complementary DNA (cDNA)는 PCR에 이용되었다.

PCR은 2.5 mM MgCl

, 2.5 U/㎕ Tag polymerase (TaKaRa Co., Japan)와 각각의 10 pmol primer를 reverse transcription에서 얻어진 cDNA 10 ㎕와 잘 혼합한 다음, 전체 부피 20㎕를 가지고 PCR을 수행하였다. PCR 은 Perkin-Elmer DNA thermal cycler 480을 이용하였다. 초기 denaturation을 위해서 94

C 에서 5분 동안 1 cycle을 하였고, 94

C에서 1 분, primer annealing을 위해서 50

C에서 1분 그리고 elongation을 위해서는 72

C에서 2분으 로 하여 50 cycle로 수행하였다. 72

C에서 2분 동안 최종적인 extension을 하였다. 각각의 PCR 생성물은 1 ㎍/mL ethidium bromide를 포함하고 있는 1×TBE buffer 내에서 1%

agarose gel을 이용하여 전기영동 하였다. 다

른 방법으로는 생쥐의 안와로부터 100 ㎕의 혈

액을 채취하여 위와 같은 방법으로 total RNA

를 분리한 후 첫 번째 strand cDNA로 역전사

시켰다. Avian transcriptase (TaKaRa Co.,

Japan)에 대한 primer는 50 pM의 농도를 가

진 random 9 mer를 이용하였으며, reverse

transcription에 사용된 reaction solution은 5

mM MgCl

, 1 U/㎕ RNase inhibitor, 1 mM

dNTP, 0.25 U/㎕ reverse transcriptase로 수

행하였다. Transcription reaction은 30

C에서

10분, 42

C에서 30분, 99

C에서 5분 동안 실시

하였으며, 반응의 종결을 위하여 5

C에서 5분

동안 놓아 두었다. 그런 후 동일 tube에 RNase

H, DNA polymerase, primer를 넣고 37℃에

서 10분 간 반응시켜 두번째 strand를 합성했

다. cDNA stock은 RT-PCR에 이용될 때 까지

-20

C에 보관하여 사용하였다. PCR은 2.5 mM MgCl

, 2.5 U/㎕ Tag polymerase, 각각 의 primer의 10 pmol를 1 x PCR buffer에 넣 어, 전체부피 20 ㎕로 만들어서 수행하였다. 각 각의 tube에, 알려지지 않은 농도의 cDNA 10

㎕와 IL-1α를 발현시키는 발현 vector 1 ㎕를 첨가하였다. PCR은 94

C에서 5분 동안 denaturation시킨후, 50 cycle로 Perkin-Elm- er DNA thermal cycler 480을 이용하여 수행 하였다. 각 cycle의 증폭은 94

C에서 1분, primer annealing을 위해서 50

C에서 1분 그 리고 elongation을 위해서는 72

C에서 2분으로 구성하였다. 최종적으로 생성된 PCR 생성물들 은 ethidium bromide (0.5 ㎍/μL)를 가지고 염색된 1% agrose gel에 loading하여 전기영동 하였다. 그리고 UV light를 이용하여 primer 쌍을 이용하여 증폭된 DNA fragment의 bp의 band를 확인하였다.

4) LPS처치에 의한 염증유발

웅성 생쥐 100마리를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자원센터에서 구입 하여 200 μl의 증류수에 최종적으로 10μg/20μl LPS농도 (Escherichia coli LPS 0111, B4;

Difco Labs. Detroit, MI, USA)가 되도록 조정 하여 관절부위(knee joint)에 주사하였다.

실험결과

1. LPS처치 전의 침자극이 생쥐 IL-4유전 자발현에 미치는 효과

LPS처치 전의 침자극이 생쥐 IL-4유전자발 현에 미치는 효과를 알아보기 위해서, 생쥐의 신수혈에 5분 동안 유침을 한 후 발침을 하였 다. 그리고 발침 후 각각 15분, 30분, 1시간과, 2시간, 3시간 단위로 생쥐의 안와에서 혈액을 채취하여 RNA를 추출한 후 RT-PCR을 이용하 여 DNA의 양을 비교하였다. <Fig. 1> 과 같이 IL-4는 850bp에서 발현되었다. Control에서는 거의 미량이 생성되었지만 30분에 발현되었다.

그 뒤, 1시간 이후에서는 거의 발현되지 않았 다.

2. LPS처치 후의 침자극이 생쥐 IL-4 유전 자발현에 미치는 효과.

LPS에 의한 염증유발후의 침자극이 생쥐 IL-4유전자발현에 미치는 효과를 알아보기 위 해서, 생쥐의 신수혈에 5분 동안 유침을 한 후 발침을 하였다. 그리고 발침 후 각각 15분, 30 분, 1시간과, 2시간, 3시간 단위로 생쥐의 안와 에서 혈액을 채취하여 RNA를 추출한 후 RT-PCR을 이용하여 DNA의 양을 비교하였다.

<Fig.2>와 같이 IL-4는 850 bp에서 발현되었 다. Control에서는 생성되지 않았지만 15분이 후 꾸준하게 IL-4의 발현이 증가하여 그 뒤, 30 분, 1시간, 3시간, 6시간까지 지속적으로 많은 양이 생성되었다. 특히 30분에서 1시간에서는

Lane 1. DNA marker Hind III digest Lane 2. 15 min after acupuncture Lane 3. 30 min after acupuncture Lane 4. 1 hr after acupuncture Lane 5. 2 hrs after acupuncture Lane 6. 3 hrs after acupuncture

대량의 IL-4가 발현되었다. 즉 IL-4 30분에서 1시간사이에 최대의 효과를 볼 수 있고 3시간 이상일 경우에는 침에 의한 효과가 약간 감소 하지만 지속적으로 IL-4를 생성시키고 있는 것 으로 생각된다. 또한 LPS 처치 후, RT-PCR에 의해 생성된 DNA의 양을 비교해보면, 오히려 시간이 더 길어졌다.

3. LPS처치 전의 황기약침이 생쥐 IL-4유 전자발현에 미치는 효과

LPS처치 전의 황기약침이 생쥐 IL-4유전자 발현에 미치는 효과를 알아보기 위해서, 생쥐 의 신수혈에 황기약침액 0.1 ml/mouse을 처치 한 다음 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시 간 단위로 혈액을 생쥐의 안와에서 혈액을 채 취하여 RNA를 추출한 후 RT-PCR을 이용하여 DNA의 양을 비교하였다. <Fig. 3>과 같이

IL-4는 850 bp에서 발현되었다. IL-4는 반응초 기에서는 발현되지 않으나 약침후 15분에서는 대량으로 발현되었으며 30분이후에서 4시간까 지 점차로 감소하였다. 이것은 황기약침에 의 한 면역 반응 효과는 초기 15분이후에 즉각적 인 효과가 나타나는 것으로 생각된다. 즉 IL-4 는 15분에서 최대의 효과를 볼 수 있고 3시간 이상일 경우에는 약침에 의한 효과가 감소하는 것으로 생각된다.

4. LPS처치 후의 황기약침이 생쥐 IL-4유 전자발현에 미치는 효과

LPS에 의한 염증유발후 황기약침이 생쥐

expression of mouse cytokine IL-4 after treatment of LPS

Lane 1. DNA marker Hind III digest Lane 2. 0 min ( control)

Lane 3. 15 min after acupuncture Lane 4. 30 min after acupuncture Lane 5. 1 hr after acupuncture Lane 6. 3 hrs after acupuncture Lane 7. 6 hrs after acupuncture

Fig. 3. Effects of Radix Astragali aqua-acupunc- ture on transcriptional expression of mouse cytokine IL-4 before treatment of LPS.

Lane 1. 15 min Radix Astragali aqua acu- puncture

Lane 2. 30 min Radix Astragali aqua acu- puncture

Lane 3. 1 hr Radix Astragali aqua acu- puncture

Lane 4. 2 hrs Radix Astragali aqua acu- puncture

Lane 5. 3 hrs Radix Astragali aqua acu- puncture

Lane 6. 4 hrs Radix Astragali aqua acu- puncture

IL-4유전자발현에 미치는 효과를 알아보기 위 해서, 생쥐의 신수혈에 황기약침액 0.1 ml/

mouse을 처치한 다음 5분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간 단위로 혈액을 생 쥐의 안와에서 혈액을 채취하여 RNA를 추출 한 후 RT-PCR을 이용하여 DNA의 양을 비교 하였다. <Fig. 4>와 같이 IL-4는 850 bp에서 발현되었다. 약침후 5분 이후부터 지속적으로 IL-4의 생성량이 증가하여 5시간에서는 가장

많은 양이 생성되었다. 즉 IL-4는 1시간에서 5 시간사이에 최대의 효과를 볼 수 있고, 1시간 이상일 경우에는 약침에 의한 효과가 확실히 감지할수 있는 것으로 생각된다.

고 찰

한의학에서 인체는 내적인 정기가 충실하면 질병을 야기하는 사기가 침입하지 못하고, 인 체의 내적인 정기 손상이 선행함으로써 외부의 사기가 침입하여 질병이 발생할 수 있다고 하 였다

. 또한 인체의 다양한 질병을 음양의 평 형조절 불균형에 두고 있으며, 근본적인 질병 으로부터의 예방․치료적인 방법으로써 체내 의 기혈진액 순환대사의 평형 조절이 중시되고 있다

. 이에 인체의 각종 질병에 대하여 침자 극과 약침제재를 이용하여 기혈진액순환을 유 지․활성화시키는 방법이 광범위하게 이용되 고 있으며, 특히 침치료는 인체의 경락과 경혈 들을 침으로 자극하여 체내의 기혈을 원활히 순환시킴으로써 질병의 치료는 물론, 예방에 높은 효과를 나타내고 있다

. 또한 약침제재 를 이용한 요법은 한의학의 경락이론을 이용한 침치료 작용과 주사 요법을 통한 약물의 약리 작용을 결합한 것으로 혈위, 침자, 약물을 결합 한 독특한 치료 방법인데, 특정 수혈에 단미 혹 은 복방으로 된 한약제를 주입하여 정신기혈, 오장육부의 기능을 조절하여 질병을 치료하는 방법으로써, 조직기관의 병리적 현상에 직접 작용하여 혈위와 약물의 치료 작용과 경락의 소통을 원활히 하며, 인체의 항병 능력을 증강 시킨다고 하였다

.

이러한 관점은 현대 면역학의 이론과도 부합 되는 것으로 생각되는데, 현대 면역학에서는 생체는 사기의 침습에 대하여 내부환경을 항상 적으로 유지하는 면역조절기구를 통하여 생체 자신을 방어하고 있다고 하였으며, 이에 대하 여 조기에 대응하는 면역활성조절물질로는 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, TNF(α,β) 등이 있다고 하였다

. 면역활성조 절물질인 cytokine은 외부에서 오는 여러 가지

ture on transcriptional expression of mouse cytokine IL-4 after treatment of LPS.

Lane 1. DNA marker Hind III digest Lane 2. 5 min Radix Astragali aqua acu-

puncture

Lane 3. 15 min Radix Astragali aqua acu- puncture

Lane 4. 30 min Radix Astragali aqua acu- puncture

Lane 5. 1 hr Radix Astragali aqua acu- puncture

Lane 6. 2 hrs Radix Astragali aqua acu- puncture

Lane 7. 3 hrs Radix Astragali aqua acu- puncture

Lane 8. 4 hrs Radix Astragali aqua acu- puncture

Lane 9. 5 hrs Radix Astragali aqua acu- puncture

자극에 대하여 한 개체의 세포와 조직들이 유 기적 내지는 종합적 반응을 나타내는데 필요한 세포 상호간의 작용을 매개하는 역할을 한다

4-5)

. 조혈 작용, 면역 반응, 일반적 염증 과정 등 에 관련된 모든 세포들의 작용을 조절하며 이 와 같은 작용과 연관하여 최근에는 여러 가지 병리학적인 기전에도 깊은 관련을 가진다는 사 실이 밝혀지고 있다

. Cytokine의 하나인 IL-4는 최근 연구에 의해 조혈조절작용, B-cell stimulation factor(BSF), B-cell growth factor(BGF) 등의 일반적인 작용 외에도 병태 성 세포의 억제기능으로 항암연구에 널리 이용 되고 있다. 또한 IL-4는 T-cell, mast cell, CD5

, B-cell 등에서 생산되며, B-cell에 대해 co-mitogen으로 작용하는데 그 영향은 B-cell 의 성숙도에 따라 다르다. 즉 pre-B-cell의 분화 를 촉진시키나 immature B-cell의 분화는 억 제한다. 또한 resting B-cell에서 MHC class

Ⅱ와 low affinity IgE receptor의 표현을 증대 시키며, B-cell에 의한 immunoglobulin의 생산 을 유도하는데 immunoglobulin의 class switch factor로 작용하여 저농도에서는 IgG1, 고농도에서는 IgE의 생산을 유도하게 된다. 반 면에 IgM, IgG3, IgG2a, IgG2b 등의 생산은 억제한다. IL-4는 T-cell에 대해서도 growth factor로 작용하는데 IL-2의 생산을 자극하며 IL-2 receptor의 표현을 증대시키는 데도 관계 한다. 다른 cytokine인 interferon-γ(IFN-γ) 와 서로 길항적인 효과를 나타내어 B-cell에 의 한 Ig의 생산에 대한 각각의 작용을 서로 억제 한다. 그러므로 IL-4의 적절한 발현이 생체의 항상성 유지에 작용하지만 과잉의 또는 장기적 인 생성은 역으로 조직의 파괴나 병적상태의 악화로 연결될 가능성이 있으며 그 생성조절은 엄밀한 제어하에 있는 것으로 보인다

. 그러 나 많은 생물 활성이 in vitro계에서 검색된 것 으로 실제 in vivo계에서 어떠한 생물 활성이 생체 반응에 대응하고 있는지와 2개의 cytoki- ne이 협동적으로 작용하는 경우에 보이는 반응 은 어떠한 것인가하는 것 등은 불명확한 상태 에 있다

.

본 연구에서는 면역활성 cytokine인 IL-4가 신수혈의 침자극과 황기약침을 통해 실험용 생 쥐의 생체내에서 일어나는 발현능을 관찰한 것 이다. 실험에 활용한 신수혈(BL

)은 신의 배수 혈이며 신장의 기능을 왕성하게 하여 그 결과 생명력이 고무되고 신체가 강건해지는 경혈이 고, 補腎臟․振氣化․祛水濕․强腰脊․益水壯 火등의 혈성이 있어서, 허로․신허․유정․유 뇨․두통․신열․현훈․요배통․황달․소갈․

신염 등의 여러 질환에 효과가 있다

. 또한 신수혈의 응용 범위는 대단히 넓은데, 현대 의 학적으로 부신 기능에 해당하며 이곳에서 신체 의 상태를 살필 수 있다고 하였다. 즉 이 부위 에 응어리나 압통이 없으면 건강한 증거이고, 그 반대라면 과로경향과 정력이 감퇴하고 다리 가 부어오르며, 혈압이 높아지는 증상이 나타 난다고 하였다. 그러므로 신수혈을 사용하는 질환은 생식기 질환, 비뇨기 질환, 호흡기 질환, 순환계 질환, 신경계 질환, 부인과 질환, 대사 질환 등 대단히 폭이 넓다

.

약침의 재료로 사용한 황기(Radix Astragali) 는 補脾昇陽․益衛固表․益氣昇陽․托瘡生肌 의 효과가 있어 기허를 치료하는 약으로 이용되 고 있을 뿐만 아니라 생체의 외사침입에 대한 면역력의 증가에도 활용되고 있으므로 실험 약 침액의 재료로 사용하였다

. 그러므로 신의 기능을 왕성하게 하여 그 결과 생명력이 고무되 고 신체가 강건해지는 경혈인 신수혈의 침자극 과, 기허를 치료할 뿐만 아니라 생체의 외사침 입에 대한 면역력의 증가에도 활용되고 있는 황 기의 신수혈약침을 통해 실험용 생쥐의 생체내 에서 일어나는 면역활성물질인 cytokine의 IL-4 의 발현능을 관찰한 결과 다음과 같이 관찰되었 다.

LPS처치 전의 침자극이 생쥐 IL-4유전자발

현에 미치는 효과는 <Fig. 1>에서 보여주는 것

처럼, IL-4는 850bp에서 발현되었다. Control

에서는 거의 미량이 생성되었지만 30분에 발현

되었다. 그 뒤, 1시간에서 2시간 에서는 거의

발현되지 않았다. 이것은 정상생쥐에서 침자극

이 면역활성화계에 미치는 영향을 검토하기 위

한 IL-4생성연구에서는 그 작용범위가 매우 반 응초기임을 시사하였다. 즉, IL-4생성을 통한 침의 면역 효과는 초기 30분 정도에서 그 효과 가 나타나는 것으로 생각된다. LPS처치 후의 침자극이 생쥐 IL-4 유전자발현에 미치는 효과 는 <Fig. 2>에서 보여주는 것처럼, IL-4는 850bp에서 발현되었다. Control에서는 생성되 지 않았지만 15분이후 꾸준하게 IL-4의 발현이 증가하여 그 뒤, 30분, 1시간, 3시간, 6시간까 지 지속적으로 많은 양이 생성되었다. 특히 30 분에서 1시간까지는 대량의 IL-4가 발현되었 다. 이것은 침자극에 의한 면역 반응 효과는 초 기 30분 이후가 되어야만 그 효과가 나타나는 것으로 생각된다. 즉 IL-4는 30분에서 1시간 사이에 최대의 효과를 볼 수 있고 3시간 이상 일 경우에는 침에 의한 효과가 약간 감소하지 만 지속적으로 IL-4를 생성시키고 있는 것으로 생각된다. 또한 LPS 처치 후, RT-PCR에 의해 생성된 DNA의 양을 비교해보면, 오히려 시간 이 더 길어졌다. 그러므로 면역활성에 미치는 자침의 반응기작은 염증 후 더 효과적임을 암 시하는 것이다. 즉, LPS에 의한 염증이 장시간 진행되므로 이를 억제하려는 생체방어력을 제 공하는 IL-4의 생성이 지속됨을 시사하였다.

LPS처치 전의 황기약침이 생쥐 IL-4유전자 발 현에 미치는 효과는 <Fig. 3>에서 보여주는 것 처럼, IL-4는 850bp에서 발현되었다. IL-4는 반응초기에서는 발현되지 않으나 약침후 15분 에서는 대량으로 발현되었으며 30분이후에서 4시간까지 점차로 감소하였다. 이것은 황기약 침에 의한 면역 반응 효과는 초기 15분이후에 즉각적인 효과가 나타나는 것으로 생각된다.

즉 IL-4는 15분에서 최대의 효과를 볼 수 있고 3시간 이상일 경우에는 황기약침에 의한 효과 가 감소하는 것으로 생각된다. LPS처치 후의 황기약침이 생쥐 IL-4유전자발현에 미치는 효 과는 <Fig. 4>에서 보여주는 것처럼, IL-4는 850bp에서 발현되었다. 약침후 5분이후 부터 지속적으로 IL-4의 생성량이 증가하여 5시간에 서는 가장 많은 양이 생성되었다. 이것은 염증 유발후 약침에 의한 면역 반응 효과는 즉각적

인 반응을 통하여 지속적인 생성을 유도하는 것으로 생각된다. 즉 IL-4는 1시간에서 5시간 사이에 최대의 효과를 볼 수 있고, 1시간 이상 일 경우에는 약침에 의한 효과를 확실히 감지 할 수 있는 것으로 생각된다. LPS 처치 전, RT-PCR에 의해 생성된 DNA의 양을 비교해보 면, 오히려 시간이 더 길어졌다. 그러므로 면역 활성에 미치는 황기약침의 반응기작은 염증후 더 효과적임을 암시하는 것이다. 그리고 LPS 처치후 황기약침과 자침자극의 효과를 비교해 보면, 황기약침이 DNA생성에 오히려 시간이 더 길어졌다. 그러므로 염증반응 후 면역활성 에 미치는 약침의 반응기작은 자침의 반응기작 보다 더 시간이 요함을 암시하는 것이다.

이와 같이 신수혈의 침자극과 황기약침은 면 역증강 작용을 나타내는 cytokine IL-4 에 대 한 반응이 관찰되었으나 LPS처치전의 정상상 태보다는 LPS처치후의 염증상태에서 면역증강 작용이 명확하게 나타났으며, 침자극과 황기약 침의 비교에서는 황기약침이 침자극보다 염증 상태에서 면역증강작용이 지속되는 것을 알 수 있었다. 그러므로 신수혈을 이용한 cytokine IL-4의 추적은 생체내 병태적인 상태에서의 침 자극과 황기약침의 효과에 대한 근거를 추측할 수 있을 것이며, 뿐만 아니라 침자극과 황기약 침에 의한 면역반응 정도를 통해 질병의 진행 상태를 나타내는 진단지표로써 활용 가능성이 있을 것으로 사료된다.

결 론

신수혈의 침 자극과 황기 약침을 이용하여 면역 증강 작용을 나타내는 IL-4의 발현 능력 을 관찰하기 위해 RT-PCR을 통해 실험 한 바 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. LPS처치 전의 침자극이 생쥐 IL-4 유전자 발현에 미치는 효과는 control에서는 거의 미량으로 생성되었고, 30분에 발현이 나타 났다.

2. LPS처치 후의 침자극이 생쥐 IL-4 유전자

발현에 미치는 효과는 control에서는 생성되

지 않았지만 15분이후 꾸준하게 IL-4의 발 현이 증가하여 지속적으로 많은 양이 생성 되었다. 특히 30분에서 1시간에서 최대의 효과를 볼 수 있고, 3시간 이상의 경우에는 효과가 약간 감소하지만 지속적으로 나타났 다.

3. LPS처치 전의 황기약침이 생쥐 IL-4 유전 자발현에 미치는 효과는 반응초기에서는 나 타나지 않았으나 약침 처치후 15분에서는 대량으로 나타났으며 30분 이후부터 3시간 까지 점차로 감소하였다.

4. LPS처치 후의 황기약침이 생쥐 IL-4유전자 발현에 미치는 효과는 약침처치후 15분이전 부터 지속적으로 IL-4의 생성량이 점차 증 가하여 1시간부터 3시간에 최대의 효과를 나타내었다.

그러므로 신수혈의 침자극과 황기약침은 LPS 처치전보다 처치후에서 IL-4의 유전자 발 현이 증가하였으며, 염증발생 후의 황기 약침 은 IL-4의 발현능을 더욱 지속시킴을 알 수 있 다. 또한 IL-4의 추적은 침자극과 황기 약침의 효과에 대한 근거를 알 수 있을 뿐만 아니라 생 체의 면역반응정도를 통해 질병의 진행상태를 나타내는 진단지표로써의 활용 가능성이 있을 것으로 사료된다.

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