Immunomodulatory Effects of Aqua-acupuncture Solution of Medicinal Plants

서 ¹⁾론

감초 (Glycyrrhiza Fissch)는 原産地가 內蒙古 로서 豆科의 多年生 草本植物이며 歸經은 心, 肺, 脾, 胃經脈^1-2) 하는 것으로 알려져 있으며, 解百藥毒, 五臟六腑의 寒熱邪氣, 堅筋骨, 溫中 下氣, 養陰血, 潤肺, 補裨和中, 淸熱解毒, 癰疽, 瘡毒, 腫毒, 腫痛, 堅筋骨, 久服輕身延年, 通經 脈, 補五勞七傷, 一切虛損, 利百脈, 益精養氣, 養陰血, 壯筋骨, 消瘡疽, 降火止痛 등에 활용 되고³⁾, 張⁴⁾ 등은 舌癌, 鼻咽癌, 胃癌, 白血病,

▪교신저자 : 임종국, 경북 경주시 석장동 707 동국대학교 한의과대학 경혈학교실 Tel. 054-770-2365, Fax. 054-770-2649, E-mail : [email protected]

骨髓腫瘤, 腹水癌 등에 항암효능이 있다고 보 고하였다. 또한 일본의 Mori⁵⁾ 등은 AIDS 환자 에 다량의 감초를 투여한 결과 면역증강 및 간 기능 증가 효과를 확인한 바 있다.

艾葉 (Artemisia asistica Nakai)은 엉거시과 에 屬하는 多年生草本인 사재발쑥의 葉⁶⁾으로서 本草綱目에 收錄된 이후로 主治와 효능에 있어 서 歸經은 肝․腎․脾經에 作用하고 性溫無毒 하고 苦香의 특성으로 癰疽, 疔瘡腫毒, 吐血, 鼻出血, 疥瘡, 崩血, 面瘡, 腫痛, 咯血, 皮膚濕疹 瘙痒, 腹冷痛, 腰痛下血, 熱腫, 瘡疾등의 止血, 解熱 鎭痛, 消炎, 調經, 强壯에 관여한다고 하 였고, 이는 能通十二經, 溫中逐冷, 理氣血, 溫中

生藥 藥鍼液의 免疫活性에 미치는 影響

조경희¹․윤성묵¹․박경미¹․손윤희²․남경수²․임종국¹

동국대학교 한의과대학 경혈학교실¹, 동국대학교 의과대학 약리학교실 및 난치병한양방치료연구센터²

Immunomodulatory Effects of Aqua-acupuncture Solution of Medicinal Plants

Kyoung-Hee Cho¹․Sung-Mook Yoon¹․Gyung-Mi Park¹․Yun-Hee Shon²․ Kyung-Soo Nam²․Jong-Kook Lim¹

Dept. of AM-Meridian & Pointology, College of Oriental Medicine¹,

Dept. of Pharmacology, College of Medicine and Intractable Diseases Research Center², Dongguk University

Abstract

Immunomodulatory effects of Glycyrrhizae uralensis Fischer aqua-acupuncture solution (GRAS) and Artemisia asistica Nakai aqua-acupuncture solution (ANAS) were examined. GRAS and ANAS increased the proliferation of T and B cells. GRAS at the concentration of 5× resulted in 20% increase of T cell and 28.2%

increase of B cell proliferation. ANAS at the concentration of 0.1× increased 31.4% of T cell and 39.3% of B cell proliferation. In addition, GRAS and ANAS remarkably increased cytolytic activity of purified T cell aganist K562 cell. GRAS showed more than 40% increase of cytolytic activity. ANAS also increased the cytotoxic activity of purified T cell. Therefore, we expect that GRAS and ANAS may have immunomodu- lating effect.

Key Words : Glycyrrhizae uralensis Fischer aqua-acupuncture solution (GRAS), Artemisia asistica Nakai aqua-acupuncture solution (ANAS), T cell proliferation, B cell proliferation, Cytolytic activity J. Kor. AM– Meridian & Pointology Soc.

開鬱, 生肌肉, 能透諸經而除百病, 壯陽助水의 효능이 있다고 하였다^7-8). 劉 등은 艾葉의 乳房 癌, 肺癌, 胃癌, 子宮癌, 腸癌, 胰腺癌, 食道癌 등에 대하여 보고^9-10)한바 있다.

한편 약침요법¹¹⁾은 약물이 경구적으로 투여 되는 경우와는 달리, 소화관에서의 대사과정을 거치지 않으므로 약물고유의 성분이 표적부위 에서 신속하게 효과를 발휘할수 있다는 장점이 있으므로 한방 치료의 새로운 영역으로 많은 관심이 집중되고 있다.

생체가 이물질에 노출되면, 특이적으로 임파 구의 활성화와 증식 및 이물질인 항원에 대하 여 특이적인 항체가 만들어지는 면역 응답 반 응이 일어나고, 이 반응에는 macrophage, T 세포, B 세포가 주된 역할을 담당하고 있으며, 또한 비특이적 생체내 방어작용에 관여하는 natural killer (NK cell) 세포의 활성도 종양면 역 응답에 중요한 지표^12-15) 가 된다. 최근 꾸준 히 천연물질로부터 연구되고 있는 생물학적 반 응 조절제는 생체의 면역계를 활성화 시킴으로 써 생체방어능력을 증강시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 생약 약침액의 생 체내 면역계 활성화를 검토하기 위해서 생쥐의 비장에서 얻은 T 세포 및 B 세포를 이용하여 면역 증강효과 및 T 세포의 활성도를 측정하였 다.

실험재료 및 방법

실험재료 ­ RPMI­1640 medium, percoll, antibiotics, dimethylsulfoxide (DMSO), bovine serum albumine (BSA), triton X­

100, 3­[4,5­dimethylthiazol­2­yl]­

2,5­diphenyltetrazolium bromide (MTT)등 은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하였 고, fetal bovine serum (FBS)은 Gibco사 (Gibco BRL, Life Techno. Inc., NY, USA), Nylon wool은 Wako사 (Wako Chem. Co., Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 기타 시약은 세포 배양용 및 특급 시약을 사용하였다.

본 실험에서 사용한 생약인 감초 (Glycyrrhi-

zae uralensis Fischer)와 애엽 (Artemisia asistica Nakai)은 약침액을 제조하기 위하여 동국대학교 부속한방병원에서 구입한 뒤 정선 하여 사용하였고, 추출용매인 물은 이온교환수 지를 통과시킨 증류수를 사용하였다.

생약 약침액 제조 ­ 약침액은 수제 알콜침 법¹⁶⁾에 의하여 조제하였다. 감초 60 g과 애엽 60 g을 각각 조말하여 증류수 400 ml을 가한 뒤 rotary evaporator (BUCHI RE121, Switzerland)에서 3시간 전탕하여 추출하고 여 과한 후 4℃, 2,500 rpm에서 10분간 원심분리 하여 얻은 상층액 200 ml을 감압농축하였다.

이 농축된 용액에 99.9% ethanol로 가하여 75%, 85%, 95%의 ethanol 용액이 되게 하여 침전물을 여과하고, pH 7.4로 조정한 후 저온 에서 24시간 방치하여 membrane filter (0.22

㎛, Whatman. Germany)로 여과하였고, 3차 증류수를 가하여 200 ml이 되게 하여 1×의 약침액으로 사용하였다. 10×, 5×, 3× 약침액 은 1× 의 약침액을 감압농축하여 사용하였고, 증류수나 PBS를 첨가하여 0.1×, 0.5× 농도를 조제하였다.

실험 동물 ­ 대한실험동물센터에서 구입한 6주령 수컷 ICR 생쥐를 사용하였다. 7­10 일 간 안정화시킨 후, 실험에 사용하였으며, 실험 기간 중 사료와 물은 자유로 먹게 하였다.

세포 배양 ­ 계대 보존 중인 K562 cell은 10% FBS가 포함된 RPMI 1640을 배양액으로 CO2 배양기 (5% CO2, 37℃)에서 배양하였고, 배양액은 3 또는 4일 간격으로 교환해 주었다.

이 세포들은 액체질소의 기체상태 (­150℃)에 보존해 두었다가 같은 passage 번호를 가진 세 포를 녹여서 사용하였다.

비장세포의 조제 ­ 6주령이 지난 생쥐를 질식시켜 고정한 다음, 비장을 무균적으로 적 출하여 Coligan¹⁷⁾ 등의 방법에 따라 비장세포 를 조제하여 다음 실험에 사용하였다.

Nylon wool column의 제작 ­ Coligan¹⁷⁾ 등의 방법에 따라 nylon wool column을 제작 하였으며 10% FBS가 첨가된 RPMI 배지를 적당히 column을 통과시킨 후 배양하여 활성

화 시켰다.

T 세포 및 B 세포의 분리 ­ 문¹⁸⁾ 등의 방 법에 따라 비장세포 부유액을 column내로 유 출시켰다. 이때 유출되어 나오는 세포는 대부 분 T 세포 (natural killer 세포 포함), nylon wool column에 부착되어 있는 세포를 B 세포 로 사용하였다. Column내에 부착되어 있는 B 세포는 10 ml의 cold PBS를 가한 뒤 유출시켜 사용하였다.

T 세포 증식에 미치는 영향¹⁹⁾­ T 세포를 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용 하여 2.5×10⁶ cells/ml로 조제한 다음, 96­

well plate에 190 ㎕씩 균등하게 넣고 감초 약 침액 및 애엽 약침액을 농도별로 각각 10 ㎕을 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 72시간 배 양한 후, MTT assay에 의하여 시료에 의한 T 세포 증식효과를 측정하였다.

B 세포 증식에 미치는 영향 ­ B 세포를 10% FBS가 첨가된 RPMI 배지로 세척하고 2.5 ×10⁶ cells/ml로 조제한 다음, Yoshiza- wa¹⁹⁾ 등의 방법에 따라 B 세포의 증식효과를 측정하였다.

Percoll 농도구배를 이용한 순수 T 세포 의 정제 ­ Minami²⁰⁾, Mezoguchi²¹⁾ 등이 이 용한 Percoll 불연속 밀도 구배 원심법에 의 해 T 세포의 농축 및 정제를 시행하였다. 본 실험에서는 두번째 중간층을 T 세포로 회수 하여 10% FBS가 첨가된 RPMI 배지로 2번 세척하여 얻은 순수 T 세포를 활성 측정에 사용하였다.

순수 T 세포의 활성 측정 ­ T 세포의 활 성을 측정하기 위하여 cytotoxicity detection kit를 사용하였다. 먼저 분리한 T 세포를 밑 이 둥근 96­well plate에 1×10⁶ cells/well이 되게 assay medium (1% FBS가 첨가된 RPMI)으로 현탁시킨 후 100 ㎕씩 분주하고 감초 약침액 및 애엽 약침액 10 ㎕를 처리하 여 24시간 반응시킨 후 표적세포로 배양한 K562 세포를 1,000 rpm으로 3분간 원심분리

하여 세척하고, assay medium으로 현탁시킨 후, 1×10⁴ cell/well이 되도록 100 ㎕를 가하 였다. 시료를 처리한 T 세포와 K562 세포를 가볍게 혼합한 다음, 37℃, 5% CO2 배양기에 서 4시간 배양시켰다. 배양 후 plate를 1,500 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액 100

㎕를 취한 다음, 밑이 편편한 96­well plate 에 옮기고 100 ㎕의 cytotoxicity assay 반응 혼합액을 각 well에 분주한 다음, 실온에서 약 30분간 차광하여 반응시킨 후, 붉은색의 formazan salt의 흡광도를 492 nm에서 측정 하였다.

결과 및 고찰

T 세포 및 B 세포의 증식 효과 ­ T 및 B 임파구 세포들의 활성화 및 분화 과정은 생체 의 주요 방어기능인 면역체계의 초기 조절과정 중 핵심적인 단계이며, 일반적으로 면역세포의 활성화는 임파구들의 증식과 분화과정으로 나 타나게 된다. 즉, 이종의 단백질이나 미생물, 종양세포 등의 면역원에 대한 일련의 반응 과 정중 초기에 T 및 B 세포의 증식현상이 일어난 다. 감초 약침액, 애엽 약침액이 T 세포의 증식 에 미치는 영향을 알아본 결과, T 세포의 경우, 감초 약침액 1×에서 8.0%의 증가율을 나타내 었고, 5×의 농도에서 18.8%의 증가율을 보였 다 (Fig. 1).

애엽 약침액의 경우, 0.1×에서 31.4%의 증 가율을 나타내었고, 0.5×의 농도에서 20.0%의 증강효과가 있었다 (Fig. 2). 이와같이 T 세포 의 증식효과는 감초 약침액과 애엽 약침액에서 뚜렷이 나타났다.

B 세포의 경우, 감초약침액 1×에서 8.5%

의 증강효과가 나타났으며 5×의 경우 28.2%

의 B 세포 증가율을 보였다 (Fig. 3). 애엽 약 침의 경우, 0.5×의 경우 21.4% , 0.1×에서 39.3%의 높은 증강효과가 나타났다 (Fig. 4).

감초 약침액은 농도가 증가할수록 B 세포의 증식효과가 증가하였으며 애엽 약침액은 저

0 5 10 15 20 25 30

0.1 0.5 1 3 5

Co ncentratio n (X )

% of increase

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

0.1 0.5 1

Co nc e ntratio n (X )

% of increase

0 5 10 15 20 25 30 35

0.1 0.5 1

Co nc e ntratio n (X )

% of increase

0 5 10 15 20 25 30 35

0.1 0.5 1 3 5

Co nce ntratio n (X )

% of increase

농도에서 그 증식효율이 증가하는 경향을 보 였다 .

이 결과들을 통해서 감초 약침액과 애엽 약 침액을 투여함으로 인해서 비장의 여러 세포 들 중 주를 이루는 임파계 세포에 증식효과가 있었음을 알수 있었다.

T 세포의 활성에 미치는 영향 ­ 사람의 생 체는 외부로부터 미생물의 침입을 받기도 하

고, 이물질적 자기항원 (암항원, 정상세포의 파 괴성분 등)이 나타나는 조건에서 생존하고 있 으나, 생체내에는 이것을 방어하는 능력 즉, 면 역시스템을 갖고 있다²⁵⁾. 최근 암의 면역요법 과 관련하여 암세포가 증식할수록 T 세포 및 NK 세포 등과 관련된 생체내의 면역력이 저하 된다는 점에 착안²⁶⁾하여 T 및 NK 세포의 활성 을 증가시킬수 있는 약제의 탐색에 많은 괸심 이 집중되고 있다. 감초 약침액과 애엽 약침액 의 정제 T 세포의 활성에 미치는 영향을 입증 Figure 1. Effect of GRAS on the T cell

proliferation. T cell (5×10⁵ cells/well) were incubated at 37℃ for 72 hrs, and cell proliferation was measured using MTT assay.

Figure 2. Effect of ANAS on the T cell proliferation. T cell (5×10⁵ cells/well) were incubated at 37℃ for 72 hrs, and cell proliferation was measured using MTT assay.

Figure 3. Effect of GRAS on the B cell proliferation. B cell (5×10⁵ cells/well) were incubated at 37℃ for 72 hrs, and cell proliferation was measured using MTT assay.

Figure 4. Effect of ANAS on the B cell proliferation. B cell (5×10⁵ cells/well) were incubated at 37℃ for 72 hrs, and cell proliferation was measured using MTT assay.

0 10 20 30 40 50 60

0.1 0.5 1 3 5

Co nce ntratio n (X )

% of inhibition

0 0.5 1 1.5

0.1 0.5 1 3

Co ncentratio n (X )

Ratio (treated/control)

하기 위한 방법으로 정제 T 세포가 표적세포인 K562 세포에 대한 독성을 관찰한 결과, 감초 약침액의 경우 5×의 농도에서는 44.4%의 높 은 T 세포 독성 효과가 있었다 (Fig. 5). 애엽

약침액에서는 0.1×와 0.5×에서 대조군에 비 해 1.3배의 독성효과가 있었으며 1×의 농도에 서도 1.2배의 T 세포 독성 효과가 나타났다 (Fig. 6). 특히, 감초 약침액의 경우, 농도 의존 적으로 그 효과가 증가하는 것을 확인할 수 있 었다.

이와같이 이들 생약 약침액은 T 세포의 활성 을 촉진하는 물질이 함유되어 있을 가능성이 높고, 이것은 또한 예방 의학적 측면에서 활용 가능성이 있을 것으로 판단된다.

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activity of purified T cell. The purified T cell (1×10⁶ cells/well) was incubated with K562 cell (1×10⁴ cells/well) at 37℃ for 4 hrs in 96­

well plate. Cytolytic activity of T cell was measured by LDH assay. Each value represents mean± standard deviation of three experiments.

Figure 5. Effect of GRAS on the cytolytic activity of purified T cell. The purified T cell (1×10⁶ cells/well) was incubated with K562 cell (1×10⁴ cells/well) at 37℃ for 4 hrs in 96­

well plate. Cytolytic activity of T cell was measured by LDH assay. Each value represents mean± standard deviation of three experiments.

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