서1) 론
川芎의 기원은 미나리과 (Umbelliferae Makino)에 속한 다년생 초본인 궁궁의 根莖으 로 학명이 Cnidium officinale Makino (Lygusticum officinale)로 性은 溫無毒하고 味 는 辛苦하며 癰疽瘡瘍 痘瘡 一切血症 疼痛 氣 病 一切虛損 壯筋骨 瘰癧 瘡疥 腦癰 消瘀血 癥 結癭瘺 瘀疽塊痛 등에 活用하고 肝․脾․心․
膽․三焦經絡에 作用하는 歸經藥物로 報告하 고 있다 1). 川芎의 성분은 ligustilide, butylidenephthalide, buthlphthalide, cnidi-
•교신저자 : 임종국,경북 경주시 석장동 707 동국대학교 한의과대학 경혈 학교실, Tel. 054-770-2365, Fax. 054-770-2649, E-mail : [email protected]
lide, neocnidilide, senkyunolide 이며, 풍냉 으로 인한 두통, 脇이나 腹의 동통, 추위로 인 한 근육의 마비, 무월경, 난산치료에 이용되고 있으며, 당귀와 마찬가지로 온성의 구어혈, 보 혈, 강정, 진정, 진통약으로 사용되며, 빈혈증, 냉증, 월경 불순, 월경통 등에 응용된다. 또한 대뇌활동 억제, 연수의 혈관운동 중추, 호흡중 추, 척수 반사의 흥분작용, 혈압 강하, 심근 수 축, 혈관 확장, 항균 작용, 정혈, 진정, 입냄새 제거에 효능이 있는 것으로 알려져 있다 2,3). 암에 관련된 제재 개발연구는 발병된 암을 치료할 수 있는 항암제 개발과 암의 진행과정 을 저지할 수 있거나 암 발병을 예방할 수 있는 물질 개발 차원에서 이루어지고 있다. 특히 항 암제의 독성에 의한 부작용으로 암이 발병하기
川芎 藥鍼液과 열수추출액의 생체해독효소 유도 효과
한상훈1․임종국1
동국대학교 한의과대학 경혈학교실1
Effect of Cnidium officinale Makino Aqua-acupuncture Solution (COMAS) and Cnidium officinale Makino Water-extracted Solution (COMWS)
on the Induction of PhaseⅡ Detoxification Enzymes Sang-Hoon Han1․Jong-Kook Lim1
Dept. of AM-Meridian & Pointology, College of Oriental Medicine, Dong-Guk University1
Abstract
Induction of phase Ⅱ, enzymes such as quinone reductase (QR) or glutathione S-transferase (GST) is considered a major mechanism of protection against initiation of carcingenesis. The present study was performed to evaluate the chemopreventive activity of Cnidium officinale Makino aqua-acupuncture solution (COMAS) and Cnidium officinale Makino water-extracted solution (COMWS)
in vitro. COMAS and COMWS are potent inducer of quinone reductase and glutathioe S-transferase activities in murine hepatoma Hepa1c1c7 cells. However, GSH activity was not increased with COMAS and COMWS. These results suggest that COMAS and COMWS may act as blocking agents against carcinogenesis by induction of phase Ⅱ enzymes.
Key Words : Cnidium officinale Makino, Phase Ⅱ enzyme, Glutathione J. K or. A M – M eridian & Pointology Soc.
전에 막을 수 있는 암 예방 물질의 개발이 중점 적으로 이루어지고 있다.1-2) 암예방 물질은 발 암 물질의 대사과정에 변화를 가져오거나 암화 과정(carcinogenesis)시 생성되는 대사물질 또 는 대사과정시 생성되는 부산물과 반응하여 상 호작용을 일으키거나 특정 효소의 발현 및 기 능을 변화시키므로 이러한 특징을 이용하여 암 예방 물질을 개발, 조사할 수 있다. 대표적인 것으로 QR, GST 활성유도, glutathione생성 등의 측정이 있다 4).
QR은 간세포에서 주로 생성되는 phase Ⅱ enzyme [glutathione S-transferase (GST), UDP-glucuronosyl transferase]의 한 종류로 quinone을 환원시켜 무독(detoxify)하게 만들 고 세포내에 유도되어 발암물질에 의해 일어나 는 돌연변이(mutation)와 종양효과(neoplastic effect)를 막아주고 발암 물질을 무독하게 하는 역할을 한다. 5)
Glutathione은 세포 내에서 다양한 기능을 가지고 있으며 외부의 독성물질이 세포내 침입 했을 때 직접 반응하거나 glutathione S-trans- ferase에 의해 독성물질과 결합하여 무독하게 하는 기능을 가지고 있다. 또한 glutathione은 자연적인 항산화제로 발암과정시 세포를 보호 한다. glutathione의 전자친화적인 성질은 외 부물질이 DNA와 결합하여 암을 유발하는 것 을 막아주며 GST는 유리기(free radical)를 파 괴하여 반응성이 높은 산소들로부터 세포를 보 호한다고 보고되고 있다 6).
본 실험실에서는 앞서 여러 생약제재 약침액 의 암예방효과 (금은화 7), 감두탕 8), 애엽 9)) 및 면역 증강 효과 (시호10), 감초11)) 등을 연구한 바, 본 논문에서는 川芎을 약침액과 열수추출 액을 조제하여 이것을 이용하여 quinone reductase 유도효과, glutathione S-transfe- rase 생성율 및 세포내glutathione 함량 등을 측정하여 암예방 효과를 검정하고자 하였다.
실험재료 및 방법
시약및 시료
Minimum essential medium eagle's (MEM), antibiotics, flavin adenine dinucletide (FAD), 3-4,5-dimethylthiazol2-l- ,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), glucose-6-phosphate, β-nicotinamide adeni- ne dinucleotide phosphate (β-NADP), glucose-6-phosphate dehydrogenase, menadi- one, laury sulfate (sodium dodecyl sulfate), dicuomarol, crystal violet, NADP+, chloro-2, -initrobenzene (CDNB), glutathione reduc- tase, triton X-100, Na-EDTA, bovine serum albumin (BSA), tween-20, 5, 5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB), cupric sulfate, bicinchoninic acid protein kit는 Sigma사 (St.
Louis, MO, U.S.A)에서 구입하였고, fetal bovine serum (FBS)은 Gibco사 (Grand Island, NY, U. S. A) 제품을 사용하였다. 기타 시약은 세포 배양용 및 특급 시약을 구입, 사용 하였다.
본 실험에 사용된 川芎은 동국대학교 부속병 원 한방병원에서 구입한 뒤 약침액은 김 등7)이 보고한 바와 같이 수제 알콜침법에 의하여 조 제하였으며, 약침액의 추출용매인 물은 이온교 환수지를 통과시킨 증류수를 사용하였다. 3×, 5× 약침액은 1×을 감압농축하여 사용하였고, 0.1×, 0.5 × 농도는 증류수로 희석하여 조제 하였다. 열수추출액 또한 김 등7)이 보고한 바 와 같이 조제하여 본 실험에 사용하였다.
세포배양
계대 보존 중인 생쥐의 간암세포인 Hepa1- c1c 7 cell을 10% fetal bovine serum이 포함 된 MEM을 배양액으로 하여 CO2 배양기 (5%
CO2, 37℃)에서 배양하였고, 이들 배양액은 3 또는 4일 간격으로 교환해 주었다. 세포의 생 존은 trypan blue dye exclusion 방법으로 확 인하였다.
NAD(P)H:quinone oxidoreductase (QR) 생성 측정
세포수에 대한 QR 생성 및 유도효과는 한 등8)의 방법으로 실시하였다. NAD(P)H:quino- ne oxidoreductase 활성은 분당 환원된 MTT 의 흡광도와 crystal violet의 흡광도에 의해 산 출하였고, QR의 활성 유도는 川芎 약침액 및 열수추출액을 처리하지 않은 대조군의 QR 활 성에 대한 시료에 의한 활성의 비로 계산하였 으며, 이때 도입된 3247 nmol/mg은 crystal wiolet과 MTT의 흡광계수를 결정하는 비례상 수이다.
Specific = activity
Absorbance change of MTT/min
×3247nmol/mg Absorbance of
crystal violet
세포내 glutathione 함량 측정
세포 내의 총 glutathione 함량은 윤 등9)의 방법으로 측정하였다. GSH 함량은 GSH 표준 곡선으로 계산하였고, nmol/mg protein으로 표시하였으며, GSH 함량의 비는 대조군에 의 한 GSH 양과 시료에 의해 생성된 GSH 양의 비율로 측정하였다. 세포내 총 단백질은 bincinchoninic acid protein kit를 사용하여 BSA를 표준 단백질 용액으로 이용한 표준 검 량선을 구하고 그 양을 산출하였다 12).
세포내 glutathione S-transferase 생성량 측정
GST 활성 측정은 윤 등9)의 방법으로 실시하 여 3분간 흡광도의 증가를 405 nm에서 측정하 였다. GST 활성은 slop/min/mg protein으로 계산하여 꿀풀과하고초 약침액을 처리하지 않 은 대조군의 GST 활성에 대한 시료를 처리한 GST 활성의 비로 나타내었으며, 세포내 총 단 백질은 위와 동일한 방법으로 측정하여 그 양 을 산출하였다.
통계학적 처리
실험결과는 평균±표준편차 (Standard dev- iation, SD)로 나타내었으며, 실험에 대한 유의
성 검정을 위해 Student`s t-test를 수행하여 결과치는 p값이 0.05, 0.0, 0.005 미만을 통계 학적으로 의미있는 것으로 간주하였다.
실험결과
QR 생성에 미치는 영향
川芎 약침액의 QR 생성 유도율을 측정한 결 과, 0.1×, 0.5×, 1×농도에서 대조군에 비하여 1.38배, 2.77배, 2.56배의 유의성있는 증가를 보였으며, 열수추출액의 경우, 0.1×, 0.5×, 1
×, 3×, 5×에서 각가 1.24배, 2.00배, 2.48배, 1.94배, 1.21배의 유의성있는 증가를 나타내었 다 (Fig. 1). 이 결과에서 川芎 약침액과 열수추 출액은 QR은 생성에 효과가 있었으며, 열수추 출액의 경우에서 고농도에서도 그 효과가 있음 을 알 수 있었다.
GSH 생성에 미치는 영향
川芎 약침액과 열수추출액에 의한 glut- athione 생성을 살펴본 결과, 약침액에서는
Fig. 1. Effect of Cnidium officinale Makino aqua-acupuncture solution (COMAS) and Cnidium officinale Makino water-extracted solution (COMWS) on induction of quinone reductase activity in murine hepatoma Hepa1c1c7 cells. Each point represents the mean of three separate experiments. Values are mean±SD (n=3).
* : p<0.05, ** : p<0.01, *** : p<0.005 as compared to control.
***
**
**
*
***
*
*
*
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
0 1 2 3 4 5 6
Concentration (X )
Specific activity (ratio)
COMAS COMWS
GSH 유도를 관찰할수 없었으며, 열수추출액에 서도 1×농도에서만 1.15배의 양이 생성되었으 며 다른 농도에서는 GSH 양이 생성되지 않았 다 (Fig. 2).
GST 생성에 미치는 영향
川芎 약침액과 열수추출액에 의한 GST 활성 도를 관찰한 결과, 약침액 0.1×, 0.5×에서 각 각 1.43배, 1.91배의 증가률을 나타내었고, 열 수추출액에서는 0.1×, 0.5×, 1×, 3× 농도에 서 1.69배, 2.12배, 1.48배, 1.25배의 유의성있 는 GST 활성이 나타났다 (Fig. 3).
고 찰
암예방은 암화 과정을 연장, 억제시키거나 암화된 것을 전환(reversion)시키는 작용이다.
현재 암예방 물질에 대한 많이 연구가 진행되
고 있으며, 효과적인 암예방 물질
(chemopreventive agents)의 연구를 위해 생화 학적 표식자를 사용하고 있다. 이 표식자들은
암화과정시 발암물질의 대사물질과 그의 부산 물과도 반응하며 다양하고 많은 발암기전을 저 해할 수 있는 효과적인 암예방 물질로 간주된 다. 이러한 표식자들에는 QR, GSH, GST 등이 사용되고 있다 13).
일반적으로 川芎은 한방에서 보혈․활혈․
정혈제로 부인병에 주로 쓰는 대표적인 약재이 다. 생리불순, 냉증, 생리통, 산후에 당귀와 같 이 쓰는 귀중한 약재이다. 川芎은 혈액순환을 활발하게 하여 체내의 악혈을 빨리 운반하여 없애고 강한 살균작용으로 외과질환도 신속히 치유하며 자궁수축작용으로 산후에 피를 멎게 한다. 또한 진통․진정제로도 효과가 우수하여 두통, 어지럼증, 빈혈 등에 쓰이고 강장약으로 도 효과가 뛰어나다 14-15). 본연구에서는 이러한 목적으로 사용되고 있는 川芎을 이용, 약침액 및 열수추출액을 만들어 이것의 암억제 효과 검정을 위하여 QR 유도효과, 세포내 GSH 함 유량 측정 및 GST 유도효과등을 측정함으로써 발암과정의 initiation 억제 (blocking agents) 에 미치는 영향을 살펴보았다.
Fig. 2. Induction of glutathione level by Cnidium officinale Makino aqua-acupuncture so- lution (COMAS) and Cnidium officinale Makino water-extracted solution (COMW S) in murine hepatoma Hepa1c1c7 cells.
Each point represents the mean of three separate experiments. Values are mean±
SD (n=3).
* : p<0.05 as compared to control.
*
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2
0.1 0.5 1 3 5
Concentration (X)
Induction of GSH
COMAS COMWS
Fig. 3. Induction of glutathione S-transferase by Cnidium officinale Makino aqua-acup- uncture solution (COMAS) and Cnidium officinale Makino water-extracted solution (COMWS) in murine hepatoma Hepa1c1c7 cells. Each point represents the mean of three separate experiments. Values are mean±SD (n=3).
* : p<0.05, ** : p<0.01, *** : p<0.005 as compared to control.
*
**
***
***
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
0.1 0.5 1 3 5
Con c e n t r a t i on (X )
Induction of GST
COM AS COM WS
QR이나 GST와 같이 phaseⅡ drug-metabo- lizing enzymes의 유도는 chemical stress나 carcinogenesis의 initiation에 대한 중요한 방 어기작이다. 효소의 유도 패턴에 의하면 drug-metabolizing 효소를 유도하는 물질은 PhaseⅠ과 phase Ⅱ 효소를 모두 증가시키는 bifunctronal inducers (planar aromatic compounds)와 phase Ⅱ 효소만을 증가시키는 monofunctional inducers (diphenols, thiocar- bamates, isothiocyanates, 1,2-dithiol-3-thion- es)이 있다 16). Phase Ⅰ 효소 유도는 발암물질 을 활성화된 발암물질 (ultimate carcinogens) 로 바꾸기 때문에 암 유발 위험인자이다. 그러 므로 이상적인 암예방물질은 암예방활성을 가 진 monofunctional 효소 유도체이다. 川芎 약 침액 및 열수추출액의 QR 유도효과를 관찰한 결과 유의성있는 증가가 나타났으므로 phase
Ⅱ enzyme들의 생성량 및 활성 변화를 측정하 여 phase Ⅱ enzyme들에게 주는 영향 및 기전 을 심도있게 연구할 가치가 있다.
GSH는 initiation 단계에서는 glutathione의 전자친화적인 성질로 인해 외부물질이 DNA와 결합하여 암을 유발하는 것을 막아주고, promotion 단계에서는 oxidative free radical 의 공격을 제한하므로서 발암과정을 저해할 수 있다. Aflatoxin에 의한 간종양을 가진 쥐에 많 은 양의 GSH를 투여하였을 때, 종양이 감소하 였다. 또한 butylated hydroxyanisole은 GSH 함량을 증가 시켜서 발암과정을 저해하였다 17). 이러한 연구들에 의하면 GSH가 reactive oxygen intermediates감소를 가져오는 free radical을 제거한다는 강한 증거를 제공한다.
GST는 유리기 (free radical)를 파괴하여 반응 성이 높은 산소들로부터 세포를 보호한다고 보 고되고 있다 22). 川芎 약침액 및 열수추출액은 세포내에서의 GST의 생성율을 증가시켰다. 이 것은 세포내 glutathione 생성을 촉진하여 세 포내 발생한 산화물질과 기타의 독성물질을 무 독하게 할 것으로 추측된다.
요 약
발암물질을 무독화시키는 QR 생성 유도를 살펴보기 위하여 川芎 약침액 및 열수추출액을 생쥐의 간암세포인 Hepa1c1c7에 처리하여 측 정한 결과, 황기 약침액의 농도를 증가시킬수 록 많은 QR 생성율을 보였으며, GST 생성 또 한 증가하였다.
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